（营养与食品卫生学专业论文）甲基睾酮分子印迹聚合物及其固相萃取研究.pdf

a b s t r a c t 摘要 分子印迹技术是一种新兴的分离技术，通常可以被描述成制造识别“分子钥匙 的 人工“锁的技术。它可以制备出对所选目标分子具有高度亲和性及选择性的聚合物材 料。近年来分子印迹技术发展十分迅速，己经在固相萃取、模拟酶催化、化学仿生传感 器等领域展现了良好的应用前景。 以甲基睾酮为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂， 用本体聚合法制备了甲基睾酮分子印迹聚合物( m i p ) ，用扫描电镜( s e m ) 及液氮吸 附仪多点法( b e t ) 对其进行了物理学表征，并研究了该m d 作为高效液相色谱( h p l c ) 固定相时对模板分子及其结构类似物的保留行为，同时也考察了在乙腈流动相中添加水 对色谱保留行为的影响。此外还运用平衡吸附实验研究了该m i p 的结合特性和选择性识 别能力。研究表明：色谱流动相的极性越强，越不利于印迹聚合物对模板分子的识别。 同时也测得了该印迹聚合物对模板分子的最大表现结合位点数为8 8 5 6 7 岬o l g ，识别因 子为5 3 4 ，对模板分子显示出一定的结合能力与特异性识别能力。 对本体聚合法制备的甲基睾酮分子印迹聚合物在固相萃取上的应用作了进一步的 探索。用干法与湿法两种方法制各了甲基睾酮的固相萃取柱，对淋洗与洗脱条件进行了 选择，在此条件下用甲基睾酮的乙腈溶液上样，分别计算回收率，并对两种方法进行了 简单的比较。研究发现：湿法制备的甲基睾酮固相萃取柱填料分布均匀，回收率达到 9 6 7 2 ，而干法则只有8 5 0 2 。此外，通过研究表明印迹聚合物固相萃取柱具有很好 的稳定性和耐用性，1 5 次使用后其回收率仍能保持在9 0 以上。 以甲基睾酮为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂， 用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物微球( m i p s ) 。利用扫描电镜( s e m ) 及液氮吸附仪 多点法( b e t ) 对该m i p s 进行物理学表征，研究了聚合方式、溶剂量、引发剂量对聚 合物微球形貌的影响。并比较了几种印迹聚合物的结合特性和选择性识别能力。研究结 果表明，当模板与溶剂比例( m m o l ：m l ) 为1 ：5 0 0 时，聚合物微球粒径出现一个最大的 极限点，达到1 7l a i n 左右。此外，模板与溶剂比例( m m o l ：m l ) 为1 ：2 0 0 时，沉淀聚合 法制备的m i p 对模板分子的最大表现结合位点数达到4 4 1 6 4 3 肛r n o v g ，特异性的分离能 力也达到了2 2 2 8 ，对模板分子显示出最强的结合能力与特异性识别能力。 此外，还对两种聚合方法制各得到的甲基睾酮印迹聚合物在物理表征、结合特性和 选择性识别能力等方面进行了比较。 关键词：甲基睾酮分子印迹聚合物本体聚合沉淀聚合固相萃取高效液相色谱 摘要 a b s t r a c t m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ( m i t ) i sak i n do fr i s i n g t e c h n i q u e f o rd i v i d i n g m o l e c u l e s ，i t so f t e nd e s c r i b e da saw a yo fm a k i n gam o l e c u l a rl o c kt om a t c ham o l e c u l a rk e y t h ep o l y m e r sw h i c hh a v eah i g ha f f i n i t ya n ds e l e c t i v i t yt ot h ei m p r i n t e dm o l e c u l e sc a l lb e p r e p a r e d m i ti sd e v e l o p i n gq u i c k l yt h e s ey e a r s i th a sb e e nr e p o r t e dr e c e n t l yt h a t m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r sh a v eag o o df o r e g r o u n da p p l i e di ns o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ， e n z y m e m i m i c k i n gc a t a l y z e r , c h e m i c a l - b i o n i cs e n s o ra n d s oo n t 1 1 ep a p e rc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r sa sf o l l o w s ： 1 t 1 1 i sc h a p t e rs u m m a r i z e st h ed e v e l o p m e n to ft h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p ) ，a n a l y s e st h ei s s u ea n do f f e r sa ni n s i g h ti nt h en e a r f u t u r e 2 am e t h y l t e s t o s t e r o n e i m p r i n t e dp o l y m e rw a sp r e p a r e du s i n gb u l kp o l y m e r i z a t i o n t h r o u g ham o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y , 、析也m a aa sf u n c t i o n a lm o n o m e ra n de g d m a a sc r o s s l i n k e r t h ep h y s i c a lp r o p e r t i e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ym e a n so fs e ma n db e t t h e a f f i n i t yo ft h em i pa sh p l cs o l i dp h a s ef o rt h et e m p l a t ea n di t ss t r u c t u r a la n a l o g sw a s s t u d i e d t h ei n f l u e n c eo ft h em o b i l ep h a s eu s i n gd i f f e r e n tv o l u m ef r a c t i o n so fw a t e ri nt h e a c e t o n i t r i l eo nt h er e t e n t i o nb e h a v i o rw a sa l s od i s c u s s e d i na d d i t i o n , e q u i l i b r i u mb i n d i n g e x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tt oe v a l u a t et h ea d s o r p t i o np r o p e r t i e sa n ds e l e c t i v er e c o g n i t i o n a b i l i t yo ft h em m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t , t h es t r o n g e rp o l a r i t yo ft h et h em o b i l ep h a s ew a s ， t h ew e a k e rr e c o g n i t i o na b i l i t yo ft h em i pt ot h et e m p l a t ew a s t h em a x i m a la p p a r e n t a d s o r p t i v ec a p a c i t yh a sr e a c h e d8 8 5 6 7l a m o f g ，a n dt h ea b i l i t yo fr e c o g n i t i o nr e a c h e d5 3 4 ， t h u se x h i b i t e ds e l e c t i v i t ya n dr e c o g n i t i o na b i l i t yt ot h et e m p l a t e 3 f u r t h e ra p p l i c a t i o no ft h ea b o v em i pw a se x p l o r e d m t - s p ec o l u m n sw e r ep r e p a r e d u s i n gd r ya n dw e tm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h e nt h ew a s h i n gs o l u t i o na n de l u t i n gs o l u t i o nw e r e o p t i m i z e da f t e rt h es t a n d a r dm e t h y l t e s t o s t e r o n es o l u t i o n i na c e t o n i t r i l e a sl o a d e d t h e r e c o v e r i e sw e r ec a l c u l a t e ds e p a r a t e l y , a n dt h et w om e t h o d sw e r eg e n e r a l l yc o m p a r e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ef i l l i n go fm t - s p eu s i n gw e tm e x h i b i t e db e t t e ru n i f o r m i t y s ot h e r e c o v e r yw a s9 6 7 2 ，o t h e r w i s e ，t h er e c o v e r yu s i n gd r ym i pw a s8 5 0 2 m o r e o v e r , t h e r e c o v e r yw a ss t i l la b o v e9 0 a f t e ru s i n g 15t i m e s a sar e s u l t ，m i p - s p ee x h i b i t e dh i g h s t a b i l i t ya n dd u r a b i l i t y 4 am e t h y l t e s t o s t e r o n e - i m p r i n t e d p o l y m e r w a s p r e p a r e du s i n gp r e c i p i t a t i o n p o l y m e r i z a t i o n ，谢廿1m a a a sf u n c t i o n a lm o n o m e ra n de g d m aa sc r o s s - l i n k e r t h ep h y s i c a l p r o p e r t i e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ym e a n so fs e ma n db e t t h ei n f l u e n c e so fp o l y m e r i z a t i o n m e t h o d s ，t h es o l v e n tv o l u m ea n dt h ei n i t i a t eo nt h ef o r m a t i o no fm i c r o s p h e r e sw a ss t u d i e d i n a d d i t i o n , e q u i l i b r i u mb i n d i n ge x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tt oe v a l u a t ea n dc o m p a r et h e a d s o r p t i o np r o p e r t i e sa n ds e l e c t i v er e c o g n i t i o na b i l i t yo ft h em i p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t i a b s t r a c t t h ep a r t i c l es i z eo ft h em i c r o s p h e r e sw o u l dr e a c hal a r g e s tl i m i t i n gp o i n t ( a b o u t1 7 岫) w h e nt h er a t i oo ft h et e m p l a t et ot h es o l v e n ti s1 ：5 0 0 ( m m o l ：m l ) m o r e o v e lt h em i p s u s i n g p r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o ne x h i b i t e dh i g h e s ts e l e c t i v i t ya n dr e c o g n i t i o na b i l i t yt ot h e t e m p l a t ew h e nt h er a t i oo ft h et e m p l a t et ot h es o l v e n ti s1 ：2 0 0 ( m m o l ：m l ) t h em a x i m a l a p p a r e n ta d s o r p t i v ec a p a c i t yh a sr e a c h e d4 4 16 4 3l m a o l g ，a n dt h es p e c i f i cs e p a r a t i o na b i l i t y h a sa l s or e a c h e d2 2 2 8 i na d d i t i o n , t h ep h y s i c a lp r o p e r t i e s ，t h ea d s o r p t i o np r o p e r t i e sa n d s e l e c t i v er e c o g n i t i o na b i l i t yo ft h em i p s ，w h i c hw e r e s e p a r a t e l yp r e p a r e du s i n gb u l k p o l y m e r i z a t i o na n dp r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o nw e r ea l s oi n v e s t i g a t e di nt h ep a p e r k e y w o r d s ：m e t h y l t e s t o s t e r o n e ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，b u l kp o l y m e r i z a t i o n , p r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n ，s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，h p l c i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 签名：日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 谶再 第一章绪论 第一章绪论帚一早硒形 1 1 引言 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 是近年来得到广泛关注的一 种新兴技术，通常可以被描述成制造识别“分子钥匙 的人工“锁的技术。也就是说， 它是一种制备在空间结构和结合位点上与特定目标分子( 也称模板分子或印迹分子) 互 补并完全匹配的聚合物分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s ，m i p s ) 的 技术 1 1 。 分子印迹思想的起源可以追溯至l j f i s c h e r 的“锁和钥匙 理论 2 1 、p a u l i n g 的“抗原 抗体 3 1 ，b u m e t 的“克隆选择理论 4 】、以及d i c k e y 的“专一性吸附的概念5 1 。然而 现代分子印迹技术的建立应归功于w u l 蹄m o s b a c h ，他们开创性的工作使得分子印迹技 术得到了突飞猛进的发展。1 9 7 2 年，分子印迹技术的先驱德国h e i n r i c hh e i n e 大学的 w u l 一6 7 j 研究小组首次成功制备出了对糖类和氨基酸衍生物有识别作用的共价型分子印 迹聚合物( m m s ) 。之后，分子印迹技术开始被人们逐渐认识。尤其是1 9 9 3 年瑞典l u n d 大学的m o s b a c h 瞵j 等在n a t u r ef - 发表了有关茶碱m i p s 的研究，报道了非共价型印迹聚合 物的制备方法。由此，分子印迹技术变成了国内外科学研究工作者关注和研究的热点问 题。1 9 9 7 年，m o s b a c h 等人在瑞典的l u r i d 大学成立了国际性的分子印迹协会( s o c i e t yf o r m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，s m i ) 咿j ，其宗旨是“致力于分子印迹科学和技术的全面发展 ，从 而使分子印迹技术在传感器、人工模拟抗体及色谱固定相分离等方面得以发展，并使其 成为化学和生物学交叉的新兴领域之一。 本章将对分子印迹技术的原理、印迹机理、分子印迹聚合物的制备方法及其应用， 以及分子印迹技术面临的问题进行简单的介绍，并在此基础上提出本实验拟研究的内 容。 1 2 分子印迹技术概述 1 2 1 分子印迹技术的原理和方法 分子印迹技术一般包括以下三个步骤( 如图1 1 ) ：( 1 ) 在一定溶剂( 也称致孔剂，一 般为非极性或弱极性的有机溶剂) 中，模板分子与功能单体依靠共价或非共价作用形成 主客体配合物 1 0 1 ；( 2 ) 加j k 大量的交联剂，通过自由基聚合，使主客体配合物中的主体分 子与交联剂共聚，从而在模板分子周围形成高度交联的刚性聚合物；( 3 ) 用一定的溶剂洗 去模板分子，这样在聚合物中便留下了与模板分子的大d , n n 状相匹配的立体孔穴 1 1 1 ， 同时孔穴中含有精确排列的、与模板分子宫能团互补的、由功能单体提供的功能基团。 这些孔穴的空间结构和性质是由模板分子的结构和性质决定的，因此m i p s 可以在众多模 板分子及其结构类似物中选择性地识别模板分子。 分子印迹技术之所以发展如此迅速，主要是因为它具有三大特点：第一，构效预定 性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) ，即分子印迹聚合物可以根据不同的目的制备不同的分子印迹聚合 物以满足各种不同的需要；第二，特异识别性( s p e c i f i cr e c o g n i t i o n ) ，即分子印迹聚合 至重奎堂堡主堂垡丝壅 物是按照印迹分子定做的，可专一地识别印迹分子；第三，实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) ，即 分子印迹聚合物既可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激 素相比拟，又具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，显示出高度的稳定 性和较长的使用寿命。 m o n o m e r 曰 t 洲e m e p 硼l a t e e 率 m o i e c u l e 。弋跹r “4 n o m e r 酷 = = = 2 p r c a r r a n g e m e n t p o l y m e r 。s a t 。帆戮e x t r a c t i o n 戮 第一章绪论 目前，该法己被广泛应用于制备染料、氨基酸衍生物、多肽、核苷酸、肾上腺素功 能药物阻抑剂、茶碱、二胺、维生素等化合物的分子印迹聚合物。 共价法与非共价法各有利弊，可以根据不同的需要来选择不同的方法，如表1 1 。 表1 1 共价法和非共价法的比较 t a b 1 - 1c o m p a r i s o no fc o v a l e n ti m p r i n t i n ga n dl i o n c o v a l e n ti m p r i n t i n g 除上述两种主要的方法外，也有将共价作用与非共价作用结合起来的分子印迹方 法。 另外，用功能单体与金属离子配位制备分子印迹聚合物也得到了发展，主要用于金 属离子和蛋白质分子的分离。由于金属配位作用强，分子印迹聚合物可以在极性溶剂中 制各和识别。这种方法的最大优点是可通过简单变换金属离子种类达到对分子印迹物的 亲和能力的灵活调节。 1 2 2 分子印迹聚合物的识别机理 关于分子印迹机理方面的研究也较多，一般认为分子印迹聚合物对印迹分子的识别 主要是由三个方面的因素决定的。 1 2 2 1 印迹反应 印迹反应是指分子印迹聚合物中功能单体上的功能基与印迹分子上功能基的选择 性反应，主要包括形成可逆性共价键的反应和形成非共价键( 包括氢键、离子键、金属 配位键、兀兀作用力、疏水作用力和范德华作用力) 的反应。凡是能影响这些反应发生 的因素都能影响分子印迹聚合物对印迹分子的识别作用。这些因素主要有四种：第一， 功能基的抑制剂；第二，功能基空间取向的改变；第三，静电斥力和空间位阻效应；第 四，溶剂的影响。 1 2 2 2 聚合物空穴的空间结构与印迹分子的完美匹配 分子印迹聚合物空穴的空间结构与印迹分子的构型、构象的完美匹配有利于印迹聚 合物功能基与印迹分子功能基的充分靠近并进行专一性结合。聚合物空穴的结构和形状 并不是完全刚性和一成不变的。在溶剂中，聚合物存在溶胀现象，这使得印迹聚合物空 穴的大小和形状都发生改变，从而使对模板的选择性发生不同程度的改变。一般来说， 功能基与印迹分子之间的专一性反应在聚合物对模板的选择性亲和过程中所起的作用 是主要的。但除此之外，对于大多数功能基排列相同的模板之间的识别主要是由空穴的 大小和形状起决定作用的。总的来说，功能基和聚合物空穴对于聚合物的选择性共同起 作用，缺一不可。 1 2 2 3 印迹聚合物对印迹分子的识别过程 不论是印迹聚合物被用于催化还是被用于分离或其它目的，被印迹的分子是否能正 江南大学硕士学位论文 确进入聚合物空穴都是很重要的。通常情况下，结合位点越少，聚合物与模板的结合速 度越快，但同时其选择的专一性也相对较差；反之，如果结合位点较多，则能够很好地 提升分子印迹聚合物的选择专一性，但其结合速度却会相应受到影响。因此，往往需要 综合考虑这两方面的因素。事实上，两位点结合的结合常数大于单位点结合的结合常数， 所以说大多数印迹分子都能以正确的方式进入空穴并与功能基结合。但是，两位点结合 的速度却较慢。对于同一个聚合物来说，不同空穴的选择能力是不同的，它们对于聚合 物选择性的贡献也是不同的。这是由于聚合物中空穴及功能基与模板的匹配程度不同所 造成的。聚合物空穴中的功能基也可以进行非特异性结合。这样，聚合物在特异地与印 迹分子结合的同时还可以非特异地结合其它分子，从而造成对印迹分子的选择性降低， 对于色谱分析来说会造成峰的“拖尾”现象瞄j 。 1 2 3 分子印迹聚合物的制备 1 2 3 1 分子印迹聚合物原材料 制备m 口s 一般需要以下几种原材料：模板分子、功能单体、交联剂及溶剂。 1 、模板分子 理论上讲，只要有合适的功能单体，任何分子都可作为模板分子。但由于受到功能 单体分子种类的限制，现在己经合成的分子印迹聚合物中的模板分子主要是一些带有强 极性基团的( 羟基，羧基，氨基等) 化合物，如碳水化合物，氨基酸及其衍生物，羧酸类， 甾族，维生素，蛋白质以及一些生物大分子，因为强极性基团能够和功能单体形成更为 稳定的分子复合体系，因此易于制备高效能的聚合物。 2 、功能单体 对于给定的模板分子，通过它的结构一般就可以选择出适合的功能单体。碱性模板 分子选择酸性功能单体( 三氟甲基丙烯酸，甲基丙烯酸等) ；酸性模板分子选择碱性功能 单体( 4 一乙烯基吡啶等) ；中性模板分子选择中性或酸性的功能单体( 丙烯酰胺，甲基丙 烯酸，甲基丙烯酸甲酯等) 。 v 洲 a c r y i k ：a c i d 1 i 洲 o m e l h a c r y l i ca c i d ( 2 ) 丫洲 m e t h y lm 9 t h a c d m a 俺( 3 q a h 乜w 洲 p v i n y 怕e n z 。i c ：翘) 4 - e t h y l s t y r e n e 5 i t e k c o n i ca c i d 6 ) v n + c s 刚 o 2 a c r y 岖m i d o - 2 一m 矾h y i 一1 - 1 ) r o p a n e - - 蜀u i p h o n i ca d d 7 ) 一o 。o 1 - v m y l i r n j c l a z o l e 8 ) 4 - v i n y l p y r i o l n e 9 ) 2 ”n y l p y n d i n 1 口， 图l - 2 几种常用的功能单律结构式 第一章绪论 f i g 1 - 2s t r u c t u r eo f f u n c t i o n a lm o n o m e r s 对于有些比较特殊的模板分子还可以考虑使用双功能单体或多种功能单体，因为多 种功能单体可以形成多种类型的结合位点。例如t o s h i f u m i t l 2 1 等以甲基丙烯酸和2 ( 三氟 甲基丙烯酸) 作为双功能单体制备了分子印迹聚合物。郑宁【1 3 j 以磺胺二甲嘧啶和磺胺异 恶唑为模板分子，分别用丙烯酸( a a ) ，4 一乙烯吡啶( 4 v p ) 及丙烯酸( a a ) 和4 一乙烯吡啶 ( 4 v p ) 的混合物做功能单体，显示了更好的印迹效果。采用多种功能单体的优点是聚合 物与印迹分子的作用力较强，选择专一性更好。 此外，经过研究者的不懈努力，不断报道 1 4 , 1 5 】有新的功能单体被合成及应用，图1 2 给出了常用的功能单体。 3 、交联剂 分子印迹过程中，交联剂用来固定与印迹分子结合的功能单体，形成具有印迹分子 空间特定构型的聚合物。为使生成的分子印迹聚合物具有一定的硬度( 特别是用于色谱 固定相的分子印迹聚合物) 和形成稳定的结合位点。分子印迹聚合物往往需要很高的交 联度( 7 0 - 9 0 ) 。所采用的交联剂在聚合溶液中占了很大比例，因此交联单体很大程度 上决定着印迹聚合物的疏水性。乙二醇二甲基丙烯酸酯( e g d m a ) 应用最多，制备的分 子印迹聚合物选择性较高，非特异性吸附低。通常，印迹分子、功能单体与交联剂的参 考比例为1 ：4 ：2 0 。 4 、溶剂 溶剂使聚合反应的所有成分( 含模板分子、功能单体、交联剂及引发剂) 成为均 相，同时也起着致孔的作用，因此也叫致孔剂。在制备m i p s 时，溶剂的用量及性质会影 响聚合物的形态及孔体积【1 6 1 。因此，选取溶剂时应尽可能减小它对印迹分子与聚合物的 键合作用的不利影响，使后继处理( 如抽提) 尽可能地简单易行。在非共价分子印迹中， 由于功能单体与模板分子形成复合物是通过较弱的非共价作用产生的，而极性溶剂会影 响它们之间的相互作用，因此应尽可能选用介电常数低的溶剂，如甲苯、氯仿、二氯甲 烷等。 e s h t e r 1 7 】对比了用甲苯和乙腈作溶剂制备的m i p s 对三嗪类除草剂的萃取性能，结果 发现以介电常数小的甲苯作溶剂时的回收率为9 0 ，而乙腈为溶剂时回收率为3 7 5 。 但有时为了满足模板分子的溶解要求，也有选用乙腈【1 8 , 1 9 、四氢呋喃等作溶剂，另外， 有报道【2 l 】，当分子识别中使用的溶剂与聚合反应的溶剂一致时，识别性能最好，这可能 是因为满足了最适合的印迹条件。 5 、引发方式 m i p s 的制备通常借助热，光或辐射线来引发，一般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或者偶氮 二异庚腈( a b v n ) 为引发剂。以低温光引发最为普遍，它具有以下优点：( 1 ) 可以印迹热 稳定性差的化合物；( 2 ) 可稳定模板分子和功能单体形成的复合物；( 3 ) 可改善分子印迹 聚合物的物理性能以提高其选择性。热引发也是常用的引发方式，但只对热稳定物质适 用。 1 2 3 2 分子印迹聚合物的制备方法 江南大学硕士学位论文 1 、本体聚合 早期的分子印迹聚合物多是用本体聚合法制得的，即把印迹分子、功能单体、交联 剂和引发剂按一定的比例溶于惰性溶剂，密封在一个真空的安培管中，经聚合制得块状 聚合物，经粉碎、过筛，再抽提洗去模板分子得到所需的粒状m d s 。 作者用本体聚合法制备了甲基睾酮的分子印迹聚合物，研究发现，其结合量较小， 利用率较低。 此法简单，至今仍是制各m i p s 的主要方法之一；但后处理过程冗长、费时、费力， 且所得粒子的不规则性降低了其分离能力，也很难大规模生产。 2 、原位聚合 原位聚合法是一种将模板分子，功能单体，交联剂，引发剂，溶剂按照一定比例混 合，然后放在特定的容器中( 液相色谱柱，毛细管柱) 直接聚合。这种方法得到的聚合物， 不需要研磨、过筛、沉降等繁琐的处理步骤，可以直接用于分析。 张静等【2 2 】用这种技术合成了一系列m i p s 柱来分离印迹分子士的宁及其结构类似物， 并用于富集和检测体液中的士的宁。此外，利用该法已经成功的分离了那格列奈四】、辛 可宁【2 4 j 等药物外消旋体。 在原位聚合技术中，聚合反应程度决定着色谱柱的性能，聚合时间过长，合成的聚 合物太致密使色谱柱的流动力学性能差，表现在柱压高，流速低；聚合时间短，聚合物 中的选择性结合位点少，色谱柱效低。 3 、沉淀聚合法 沉淀聚合法也是一种简单的制备球形聚合物的方法，又称非均相溶液聚合。反应所 使用的单体、交联剂和引发剂可溶于分散相，组成均相混合液。反应开始时引发剂分解 产生自由基，引发聚合形成线性和具有分支的低聚物；随着反应的进行，低聚物通过交 联成核从介质中析出，又相互聚结而形成聚合物粒子，这些粒子通过捕捉其它低聚物和 单体长大成为粒径均一的球形聚合物 2 5 1 。但沉淀聚合法对溶剂的粘性要求高，只有在粘 性较小的溶剂中才能实现理想的粒径分布。因为在低粘度的溶剂中，单体分子和低聚物 有较大的流动性，从而可以避免它们的聚集，目前文献只报道了乙腈中的沉淀聚合。 y e 等 1 8 】用这种方法成功地在乙腈中印迹了雌二醇，所得球形m i p s 平均粒径为0 0 3 g m ，随着反应液浓度的提高，聚合物的微观形貌从微球渐变为块状。他们将制得的微 球用于放射性配体结合免疫分析，实验结果证明该法制得的m i p s 优于传统的封管聚合。 姜勇等【2 6 】以乙腈为分散相，采用沉淀聚合法合成了反乌头酸m i p s 微球，并通过振荡 吸附法对聚合物的结合特性进行了评价，发现m i p s 微球对模板分子的识别性优于块状 m i p s 和非印迹聚合物。 另外，最近也有相关报道【2 7 1 9 】对沉淀聚合法制备的分子印迹聚合物进行表征，对制 备工艺进行了探索。 作者用沉淀聚合法制备了甲基睾酮的分子印迹聚合物微球，研究发现，不仅方法简 单，而且m i p s 具有很好的识别能力与选择特性。 4 、溶胀聚合 6 第一章绪论 溶胀聚合又称为多步溶胀悬浮聚合或种子溶胀悬浮聚合：( 1 ) 采用有无皂乳液聚合 法合成粒径较小的微球作为种子；( 2 ) 用一定的乳液进行多次溶胀种子，再通过还原剂的 加入经光引剔3 0 1 或热引发3 11 聚合物制得符合要求的m p s 微球。 刘岚等”2 j 先合成聚苯乙烯种子，经两步溶胀和超声聚合得到粒度均匀的m i p s 。对 茶碱有良好的特异吸附性。h g a n i k a a 等 3 3 , 3 4 1 使用多步溶胀聚合法，得到单分散性较好的 聚合物微球。 溶胀聚合法的优点是聚合反应可在极性溶剂中进行，所以制得的m i p s 可用于极性环 境，这满足了酶模拟等生物环境的要求，同时mi p s 的规整性和单分散性也好。另外， 识别位点在m i p s 微球的表面使得印迹分子的结合和洗脱可较快地达到平衡。但这种方法 需要多步的溶胀过程，因此存在制备过程较为繁琐，制备周期较长的缺点。 5 、表面聚合 表面聚合法是近年内出现的一种全新的方法。它有两种制备方法，可分别识别金属 离子和其他物质。识别金属离子是以中孔的硅胶树脂为基质，将模板金属离子和功能单 体形成的配合物利用缩合聚合引入到硅胶表面，当金属离子除去后，在硅胶或聚合物的 表面留下可结合该金属离子的位点。另外一种表面印迹的方法也称为基质修饰法，是将 模板分子通过反应( 如偶联反应) 连接到硅胶的表面，加入功能单体和交联剂后聚合，最 后用氢氟酸将聚合物中的硅胶腐蚀掉得到m i p $ 3 5 , 3 6 】。 表面印迹有以下优点：( 1 ) 可以用在水相中聚合和识别；( 2 ) 得到的聚合物的比表面 积大，颗粒均匀，在除去硅胶之后可以留下较多的孔径和通道，有利于聚合物与溶液中 模板分子的结合；( 3 ) 结合位点位于聚合物的表面，一方面使模板分子易于洗脱，可以提 高结合容量，另一方面再结合时模板分子无需进入其刚性结构，大大加快结合的动力学 过程。但是这种方法同样有它的局限性，目前基质主要局限于硅胶，在反应结束后除去 基质比较麻烦，一般采用氢氟酸腐蚀的方法，但是经过腐蚀后对聚合物的骨架结构会有 一定的不良影响。 1 2 4 分子印迹聚合物的应用 目前，分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常广泛，包括环境、医药、食品、 军事等。m i p s 具有制作简单、成本低廉且坚固耐用、适用范围广等优点，而被誉为“万 能的分子识别材料 。这些优点使之能够取代天然的或通过其它方法获取的具有分子识 别性能的材料，如抗体等。 在过去的一段时间里，分子印迹聚合物的应用研究主要集中在以下几个方面：( 1 ) 固相萃取；( 2 ) 抗体与受体结合模拟；( 3 ) 模拟酶催化；( 4 ) 传感器材料。这几个方面在今 后的一段时间内仍将是研究的重点。 1 2 4 1 固相萃取 由于m 口可以选择性地结合混合物中的某一种或某一组结构相似的化合物，非常适 用于色谱分析前样品的净化和富集。因此近年来m 口在固相萃取中的应用与日俱增。传 统的固相萃取是利用分析物和吸附剂间的相互作用如反相，正相及离子交换进行萃取， 由于它们之间的作用力是非特异性的，因而洗脱及萃取条件要根据样品的化学性质来仔 7 江南大学硕士学位论文 细确定，而采用m i p 来进行固相萃取，上述的问题就会得到简化。 近来，已有学者用分子印迹的技术从中药中提取所需要的活性成分 3 7 , 3 8 】。中药中的 成分比较复杂，分离和分析比较困难，特别是一些含量较少的活性成分。采用分子印迹 固相萃取技术可以比较容易得到所需的成分。h u 等 3 9 】以七叶甙原为模板分子合成了 m p ，通过优化淋洗和洗脱条件，成功的分离了七叶甙原和其他几种共存在中药中的化 合物。 另外，用分子印迹聚合物制备的固相萃取柱检测食品、生物环境中的杀虫剂、农药、 兽药等的相关报道也已经越来越多。z h u 等【4 0 j 以农药久效磷为模板，制备分子印迹聚合 物，用作固相萃取剂富集水和土壤中的久效磷、速灭磷、磷胺和氧乐果，并提高检出率。 1 2 4 2 抗体与受体模拟 配体结合( 1 i g a n d b i n d i n g ) 分析被用来临床测量血液中的痕量物质，这种分析方法需 要一个能选择性地结合待分析物的受体。通常人们用抗体做受体，但使用抗体操作上很 不方便且费用很高。用m m s 制备人工抗体和受体，从理论上来说是对生物抗体的有益补 充。 1 9 9 3 年，v a l a t l d s 等 8 】首次在这一领域作了报道，他们用支气管扩张药品茶碱和安神 药安定制得的印迹显示出惊人的专一识别性，通过竞争性放射免疫测定发现，m i p s 的相 关识别结构是不存在的或远低于印迹分子，但它们的交叉反应同单克隆抗体一致。 m i p s 作为人工抗体和受体有以下几点好处：( 1 ) 制备容易；( 2 ) 稳定性好，适用于 苛刻环境如高温i 高压、强酸强碱及有机溶剂；( 3 ) 对于从自然界难得到或不能得到的抗 体和受体，人工制备的模拟物则成为生物抗体和受体有用的补充；( 4 ) 造价低廉；( 5 ) 不 需要大量动物；( 6 ) 不易受到生物降解的破坏。因此m i p s 作为生物抗体和受体的理想替 代品在临床药物分析方面显示出诱人的发展前景。 1 2 4 3 模拟酶催化 分子印迹最富挑战性的应用研究是对酶的人工模拟。由于天然酶提取困难、价格昂 贵、耐受性差、难于回收和重复使用，多年来，化学家们试图制备出与酶的催化性能相 近的化学催化剂，但取得的进展极其缓慢。分子印迹技术的出现，使这一状况大为改观。 与天然酶相比，分子印迹模拟酶可针对不同底物和反应需要加以设计，真正做到量 体裁衣，而且结构和性能更加稳定、环境适应性更好、寿命更长、价格便宜、便于存储 和规模化生产。另外，通过m p i s 模拟酶的设计，可以帮助人们对催化反应历程的了解。 目前，研究较多的m i p s 模拟酶催化反应主要有水解反应【4 1 】、合成反应 4 2 1 、转移反应、 脱t - i f 反应【4 3 1 、异构化反应等，而且，研究发现，分子印迹模拟酶还可催化四氯噻吩与 马来酸酐之间的d i e l s a l d e r 反应m 】，迄今为止还未曾发现天然酶能催化这个反应。 1 2 4 4 传感器材料 由于分子印迹聚合物对于模板分子的高选择性，因此可以作为仿生传感器的分子识 别元件。 p e r c i v a l 等【4 5 】将m i p s 材料涂布在电极上，研制出声波传感器，用于筛选激素类兽药 诺龙。c h u n y u e hh u a n g 等【删制备了胆红素电化学传感器，其灵敏性为1 3 4 4 - 4 - 0 3 8 灿g 。 8 墨二兰丝丝 国内，马杰【4 7 j 报道了将克伦特罗m i p 颗粒填充在化学发光流通池中，采用甲醛高锰 酸钾发光体系与吸附的克伦特罗反应，通过化学发光法建立了测定克伦特罗分子印迹流 动注射化学发光分析法。周候江等【4 8 j 利用m d 识别元件通过化学发光传感器检测尿样中 沙丁胺醇，检测限为0 0 1 6 “g l 。目前，国内唯一关于分子印迹传感器应用的相关专利 是关于有机磷农药仿生识别检测试剂盒的制备【4 9 】。 与近年来研究较热的生物传感器相比，分子印迹聚合物作为传感器具有耐高温、高 压、酸、碱和有机溶剂，不易被生物降解破坏，可多次重复使用，易于保存等优点；而 且可以用标准的化学方法合成出来。因此，分子印迹聚合物有望成为取代生物材料的理 想替代品。 最近几年来，科学家们已开始探索m i p s 的一些新的应用领域，其中在组合化学库 的放映技术( t h es c r e e n i n go f c o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r yl i b r a r y ) ，痕量元素的富集、选择性 催化剂、副产物的分离等方面己取得了一定的进步。 1 3 甲基睾酮与分子印迹技术 食品安全与人们生活息息相关，同时也直接影响我国的经济和在国际上的地位。近 年来，由于食用被污染的食物而中毒甚至死亡的事件时有报道，因此食品安全问题越来 越受到人们的关注。对于食品中污染物和危害物的检测就显得尤为重要，这就要求更加 快速、灵敏、准确的分析手段。 1 3 1 甲基睾酮 。 甲基睾酮 m e t h y l t e s t o s t e r o n e 诺龙 1 9 一n o r t e s t e r o n e 丙酸睾酮 t e s