（预防兽医学专业论文）广西沼泽型水牛γ干扰素基因的克隆与原核表达.pdf

堕丕兰! ! 堕堡塑主堂堡丝塞堕塑竖型查! ：垫茎箜塞堕兰堕垫塞鲨广西沼泽型水牛丫一干扰素基因的克隆与原核表达摘要干扰素( if n ) 是由干扰素诱生剂诱导生物细胞后所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。干扰素分为i 型和i i 型，r 干扰素( i f n 嘲属于i i 型干扰素，是由t 细胞和n k 细胞产生的，具有广谱抗病毒作用，也具有上调主要组织相溶性复合物i i ( m a j o rh i s t o c o m p a t i b | j t yc o m pj e i i ，m h c i i ) 类抗原分子的表达等作用，是影响机体细胞和体液免疫反应的一类具有多种调节效应的细胞因子。本实验从健康沼泽型水牛静脉无菌采血，分离外周血单个核细胞( p b m c ) ，用刀豆素a ( c o n c a n a v a i na ，c o n a ) 诱导培养1 3 、1 7 h 后，提取细胞总r n a ，用水牛lf n - 丫基因特异性引物通过r t - p c r 扩增了水牛jf n _ 丫的完全编码区c d n a 序列和成熟肽编码区c d n a 序列，将其克隆至i j p m d l 8 - t 载体中，经序列分析表明，水牛i f n l 编码区c d n a 共有5 0 1 b p ，其序列与g e n b a n k 上报道的印度水牛j f n l 核苷酸序列同源性高达9 9 6 ，与牛、羊、猪、狗、马、人和鼠的同源胜分别为9 7 8 、9 6 嘶、8 5 8 、8 2 4 、8 1 o 、7 5 0 5 ； n 6 0 7 。氨基酸序列与印度水牛同源性1 0 0 5 与牛、羊、猪、狗、马、人和鼠的同源性分别为9 7 6 、9 5 2 、7 7 1 、7 7 1 、7 6 5 、6 0 8 幂9 4 0 6 。4 4 if n - y 成熟肽编码区基因亚克隆到表达载体p e t - 3 2 a + 中，构建重组表达质粒p e t - m i f n l ，重组质粒转化大肠杆菌汇c o i ) b l 2 1 ，于3 7 。c 经i p t g 诱导表达7小时，s d s - p a g e 分析表明该基因在大肠杆菌中获得了高水平表达，表达的融合蛋白分子量约为3 5 k d ，且表达产物占菌体总蛋白的4 3 6 。本试验成功地克隆、表达了水牛j f n l ，为下一阶段水牛l f n _ 丫重组蛋白生物学特性及其应用的研究奠定了基础。关键词：沼泽型水牛：y - 干扰素：基因克隆：原核表达 耍盔堂；! 堂旦堡圭堂垡迨奎亡耍塑翌型查! ：王垫壅盟塞堕量堡堡壅鲨c l o n i n ga n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fg u a n g x is w a m pt y p eb u f f a l oi n t e r f e r o n - , g e n ea b s t r a c ti n t e r f e r o ni sak i n do fh i 曲l ya c t i v ea n dm u l t i - f u n c t i o n a lg l u c o p r o t e i np r o d u c e db ya c t i v a t e dc e l l s i n t e r f e r o ni sd e v i d e di n t oc l a s sia n dc l a s si i i n t e r f e r o n 吖( n db e l o n g st oc l a s si i b u f f a l oi f n - ? i sa na n t i v i m lc y t o k i n ep r o d u c e db ya c t i v a t e dtc e l l sa n dn kc e l l s i tu p r e g u l a t sm h c i ia n t i g e ne x p r e s s i o n ，i n f l u e n c e st h ec e l l u l a ra n dh u m o r a li m m u n er e s p o n s e sa n dh a sp l e i o t r o p i cr e g u l a t o r ye f f e c t so ni m m u n es y s t e m ，i nt h i sw o r k ，t h et o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mp e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c ) ，i s o l a t e df r o mt h r e eh e a l t h ys w a m pt y p eb u f f a l oa n ds t i m u l a t e dw i t hc o n af o r13a n d17h o u r s ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ec d n ao fb u f f a l oi f n - yg e n ew a sa m p l i f i e db yr t p c ru s i n gap a i ro fp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e db o v i n ei f n 吖g e n es e q u e n c e t h ep c rp r o d u c tw a sc l o n e di n t op m d l 8 - tv e c t o r t h e n ，s i xo f t h ep o s i t i v er e c o m b i n a n tc l o n e sw e r es e q u e n c e da n da n a l y z e d c o m p a r i s o no ft h es e q u e n c e di f n 吖w i t ht h er e p o r t e di n d i a nb u f f a l oi f n vs e q u e n c ei ng e n e b a n kr e v e a l e d9 9 6 i d e n t i t ya tt h en u c l e o t i d el e v e l ，a n ds h a r e s9 7 8 ，9 6 0 ，8 5 8 ，8 2 4 ，8 1 o ，7 5 o a n d6 0 7 i d e n t i t i e sw i t hb o v i n e ，g o a t ，p i g ，d o g ，h o r s e ，h u m a na n dm o u s ei f n 吖g e n ei nn u c l e o t i d e ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r i n gw i t ht h er e p o r t e di n d i a nb u f f a l oi f n 一丫s e q u e n c e ，t h e r ew a s10 0 i d e n t i t ya tt h ea m i n oa c i dl e v e l ，a n ds h a r e s9 7 6 ，9 5 2 ，7 7 1 ，7 7 1 ，7 6 5 ，6 0 8 a n d4 0 6 i d e n t i t i e sw i t hb o v i n e ，g o a t ，p i g ，d o g ，h o r s e ，h u m a na n dm o u s ei f n - ? g e n ei na m i n oa c i d ，r e s p e c t i v e l y t h eb u f f a l oi f n 吖g e n ew a ss u b c l o n e di n t oa ne x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 a + t h u s ，r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp e t m i f n 吖w a sc o n s t r u c t e d t h ei i堕盔堂! ! 旦! 星堡主堂堡堡奎堕塑竖型查上王垫塞箜塞堕兰堕竖墨竺r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t m l f n 吖w a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1c e l l s ，a n di n d u c e db yi p t ga t3 7 f o r7h o u r s t h er e c o m b i n a n tb u f f a l oi f n - yw a se x p r e s s e de f f i c i e n t l yi nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o a yw i t ht h ey i e l da c c o u n t i n gf o r4 3 。6 o ft o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nh a dam o l e c u l a rw e i g h to f a p p r o x i m a t e3 5 k d i nt h i sw o r k ，w eh a v ec l o n e db u f f a l oi f n - ? g e n ea n de x p r e s s e dr e c o m b i n a n tb u f f a l oi f n yf u s i o np r o t e i n t h i sp r o v i d e sag o o df o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nb u f f a l oi f n 吖b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n da p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：s w a m pt y p ew a t e rb u f f a l o ；i n t e r f e r o n 吖；g e n ec l o n i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni l受盔兰! 塑曼星堡主堂垡堡塞亡耍塑竖型查生王垫茎塑塞蹩量堕堕壅垄本论文常用英文缩写a m pa ，啦i c i l l i n氮苄青霉素a p sa m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵d n ad e o x y r i b o n u c l e o t i d ea c i d脱氧核糖核酸b b e t h i d i u mb r o m i d溴化乙锭e d l ae t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d乙二胺四乙酸e l i s ae n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验i p t gl s o p r o p y l t h i o - b d g a l a c t o s i d e异丙基硫代b d 半乳糖苷l bl a u r i ab r o t hl b 肉汤p a g ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳p b sp h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n磷酸盐缓冲液p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应r n ar j b o n u c l e o t i d ea c i d核糖核酸s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠r e m e dt e t m m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺t r b f r i ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲烷x g a l5 - b r o m o - 4 c h l o r o - 3 i l d o l y b - d g a l a c t o s i d e5 一溴一4 氯3 一吲哚- b d - 糖核苷酸gg r a m克m gm i l l i g r a m毫克斗gm i c r o g r a m微克n gn a n o g r a m纤克m lm i l l i l i t e r毫升u lm i c r o l i t e r微升p m o lp i c o m o i皮摩尔m l nm i n u t e分钟s e cs e c o n d秒r d mr e v o l u t i o n sp e rm i n u t e每分钟转数b pb a s ep a i r碱基对k d a干道尔顿k i l od a l t o n so do p t i c a ld e n s i t y光密度v 耍盔堂三塑! 旦堡圭堂焦堡塞亘翌竖型壅! ：王垫鲞塑塞堕兰壁垒壅堕细胞因子的研究现状第一部分文献综述细胞因子( c y t o k i n e ) 是一类由活化的免疫细胞( 淋巴细胞、单核巨噬细胞等) 和相关细胞( 纤维细胞、内皮细胞等) 产生的具有调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质，它们通过与高亲和力特异性受体相互作用，在低浓度下发挥作用，是机体发挥免疫功能不可缺少的成分。1 9 5 7 年， s a a c s 和l i n d e n m a n n 从病毒感染细胞培养物中分离到一种具有生物学活性的物质，由于这种因子可干扰其他病毒的复制，所以将其命名为干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) ，成为被正式命名的第一个( 类) 细胞因子“1 。此后，人们陆续发现了一系列的细胞因子，主要包括肿瘤坏死因子( t n f ) 、白细胞介素( i l ) 、集落刺激因子( c s f ) 、表皮生长因子( e g f ) 、神经生长因子( n g f ) 、肝细胞生长因子( h g f ) 等”1 。随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆，新的细胞因子不断被发现，重组的细胞因子更加接近于天然分子，这使得人们能更加确切的研究各种细胞因子的理化特性、结构和生物学效应，作用的受体、受体的结构及受体介导的信号传导过程。“。但是，由于重组细胞因子在临床应用中可引起如发热、寒颤等一系列的副作用以及很快失活的特性，人们又将目光转向对细胞因子进行适当的加工和改造上来，通过对细胞因子的结构进行适当的加工和改造，以获得生物学活性更加单一、更加有效、副作用更小的细胞因子。研究发现，将i l 一2 中1 2 5 位c y s 点突变为a l a或s e r 后得到的i l 一2 具有不形成二聚体、比活性高、热稳定性好、体内半衰期延长等优点“1 。若利用d n a 重组技术，用i l 一2c d n a 片段取代绿脓杆菌p e 毒素基因的细胞识别功能区构建嵌合基因，发现该融合蛋白对表面表达i l 一2 r 的活化t 淋巴细胞具有明显杀伤效应，可用于抗排斥反应或治疗自身免疫性疾病。“6 “”。美国科学家也构建了以白喉杆菌( d t ) 外毒素为主体的i l - 2 一毒素蛋自，证明它们能在体外高度特异性地杀伤高表达相应细胞因子受体的肿瘤细胞州。从细胞因子被发现时起，就因其对免疫系统的强大调节作用而备受关注，开始研究其与疾病的关系，但直到近年来随着细胞工程和基因工程的发展，能够大量获得天然或塑盔堂兰塑垒星堕主堂堡堡茎亡亘翌竖型查! ：王塑塞堕塞璧兰堕堡墨垄重组细胞因子以后，其l 临床应用才成为可能。1 9 8 6 年，美国食品和药物管理局( f d a ) 批准i f n a 用于临床，至今至少已有3 0 个以上的细胞因子在美国、欧洲和世界各地用于临床治疗，利用基因工程技术生产有活性的细胞因子用于疾瘸的治疗或预防已成为当前研究的热门并取得了很大的成绩，相信不久将有更多的细胞因子进入临床应用“1 。用细胞因子作为疫苗佐荆的研究也取得了很大的进展，对于抗原性弱、不能有效诱导机体产生保护性免疫反应的疫苗，利用细胞因子作为佐剂进行免疫可达到增强免疫效果的目的，尤其对于基因工程疫苗或基因疫苗，选择合适的细胞因子或细胞因子基因作为佐剂是当前研究的重点和热点“叭“”。r e d d y m 3 等报道，将低剂量( 2 5 - 0 2 5ug k g )重组牛i l 一2 与牛疱疹病毒i 型活苗( b h v - i ) 一起使用。血清中和抗体滴度比单独使用疫苗组提高6 倍，攻毒后病毒排出减少4 倍。h u g h e s m “”等报道。以b h v 一1 糖蛋白( g ) 亚单位苗免疫牛，并以0 5ug a g 的量每隔1 2 h 注射i l 一2 ，连续5 次，可以显著提高( p o 0 5 )抗g l v 特异性抗体滴度、特异性细胞毒性反应及特异性淋巴细胞增殖反应，且无抑郁、发热及拉稀等副作用。此后，r e d d y “”等又报道了单次或多次注射重组牛i l 一2 对b h v l 一副流感病毒二联苗及牛病毒性腹泻病毒灭活苗的免疫增强作用。结果显示，单次或多次注射均可增强两种疫苗的免疫效果，多次注射更好，无副作用。w e i n b e r g “”等报道，将i l - 2 与单纯疱疹病毒( h s v ) 粗提物或其糖蛋白d ( g d ) 亚单位苗一起使用，攻毒后可使发病率由6 3 - i 0 0 降低到0 4 3 。b l e c h a 等“”报道，将牛i l lb 及i l 一2 与猪链球菌苗一起使用，攻毒后，注射高剂量( 2 5 0 ug m l ) i l lb 的猪可以耐受链球菌攻击，注射低剂量( 1 0ug m l ) 的猪比对照组的猪能够产生更高滴度的抗体、更好的生长性，而且临床症状轻。细胞因子对胚胎生长发育也存在影响。胚胎自分泌和母体旁分泌的多种细胞因子可以影响胚胎的生长发育”。研究证明在母体的羊水中发现了大量的细胞因子，包括i l 一1 、t n f 、i l - 6 和i l 一8 ，后三者也出现于胚胎的血液中，胚胎血液中i l 一6 和i l 一8 浓度的增加与子宫内胚胎的生长抑制和( 或) 绒毛膜破裂有关。母体旁分泌的细胞因子在一定的程度上影响了胚胎生肌细胞和脂肪细胞的增殖和分化，从而影响了出生后的生长。在畜禽疾病中，许多病原感染后可以引起畜禽免疫功能不全或长失，这些病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫“”等。虽然目前对造成免疫抑制的孝几理尚不完全了解，但研究表明，一些病原所引起的免疫抑制与i l 一2 等细胞因子分泌水平降低或表达不正常有关。o r o s z “”等研究了鸡成髓细胞瘤病毒、疱疹性口炎病毒、猫自血病病毒、长臂猿白血病病毒和禽肉瘤病毒对人淋巴样细胞的影响，发现病毒和细胞一起培养后，淋巴细胞 堕盔竺垫! 曼星堡主堂焦鲨奎耍塑竖型壅生! ：主垫茎盟塞堕芝堕壁塞垄对有丝分裂原( p h a ) 的反应性受到抑制，分泌i l 一2 的能力降低。李庆章等啪1 报道，当鸡感染马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒后。鸡胸腺、脾脏t 细胞对有丝分裂原反应下降，i l 一2 分泌受到抑制。这些研究表明，病毒可能通过直接或间接干扰合成功能性i l 一2而导致免疫抑制。细菌和真菌主要通过自己的代谢产物即毒素产生免疫抑制。已经报道，溶血性巴氏杆菌所产生的白细胞毒素在体外培养中可以抑制牛淋巴细胞对刀豆素a ( c o n a ) 等有丝分裂原的反应，但外加纯化的牛i l - l 和i l 一2 可以减轻其抑制作用。许多真菌毒素可以引起不同程度的免疫抑制，其中的环孢肽a ( c y l o s p o r i n a ) 现在已成为一种在器官移植中广泛应用的抗排斥作用药物即免疫抑制药。“。它主要抑9 6 j j t 细胞产生i l 一2 ，但不抑制细胞对i l 一2 的反应性。近2 0 年来，借助于分子生物学技术的应用，细胞因子研究取得了惊人的进展，主要表现在：( 1 ) 数十种细胞因子及其受体的基因被相继克隆和重组，推动了其结构与功能关系的研究，揭示了细胞因子活性交叉的物质基础；( 2 ) 转基因和基因敲除技术运用到细胞因子网络研究；( 3 ) 发现细胞因子可作用于中枢神经系统，促进了神经内分泌免疫学的诞生；( 4 ) 细胞因子基因调控和信号传导系统研究取得了突破：( 5 ) 重组细胞因子成为最具活力的新兴的生物制药产业；( 6 ) 细胞因子检测技术日臻成熟，从单一的生物活性测定法，发展到免疫化学测定法、逆转录一聚合酶链反应法( r t p c r ) 和细胞内测定法并进的局面“。此外，还发现病毒因子( v i r o k i n e ) 干扰细胞因子网络。细胞因子既是免疫系统的信息传递介质，又是神经、内分泌及其他系统和免疫系统相互联系的重要桥梁。同时细胞因子还沟通了免疫系统和其他非免疫系统之间的关系，因而研究细胞因子具有广泛的生物学和临床意义。现在，有关动物细胞因子的研究也得到了蓬勃发展，重组细胞因子己在一些动物疾病的免疫预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方面显示出广阔的应用前景。以细胞因子为免疫增强荆，可能是解决目前众多疫苗，特别是寄生虫苗效果不良或不稳定问题的有效途径之一”“。结合我国的实际情况，更应该加强这方面的研究，以促进畜禽疫病防治技术的更快发展。二干扰素的研究概况21 千扰素的发现上个世纪3 0 年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时，发现普遍存在两种病毒相互拮抗的现象，由此产生了病毒问干扰现象( i n t e r f e r n c e ) 概念。从那塑丕芏! 垒堕塑堡主堂焦堡塞亡堕塑堡墼垄生上王垫壅塑塞璧复堕堡垂姿以后很多科学家试图寻找出这种引起干扰现象的活性物质，但一直没有获得成功。1 9 4 4年，g a r d 等发现感染了脊髓灰质炎病毒的鼠脑有种抗病毒因子，这种因子与病毒颗粒无关，而且也不能与病毒相结合，由此认为这种因子并非是抗体。在1 9 5 2 年，b u n n e t将a 型流感病毒m e l 株注射到鸡胚绒毛尿囊膜上，在1 8 - 2 0 4 , 时后再注射w s s 株流感病毒，结果n w s s 没有引起出血性脑炎，在此实验条件下鸡胚不能产生特异性抗体，所以这种干扰现象与抗体无关，由于m e l 株在鸡胚绒毛尿囊膜细胞内繁殖不会迸入鸡胚血流到脑中，所以这种干扰现象也不可能是由于病毒直接干扰引起的。因此说明感染病毒的细胞发生干扰现象并非是由于细胞缺少了某种物质，相反是由于细胞内产生了某种非抗体物质所引起的。直到1 9 5 7 年，i s a a c s 和l i n d e n m a n n 在研究流感病毒时，先把流感病毒加温灭活，然后与鸡胚绒毛尿囊膜块一起培养，把没有吸附到细胞的灭活病毒彻底洗去，在3 7 c条件下几小时之后去掉膜块，另外加入新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，3 7 c 培养过夜后用活病毒进行攻击，结果发现流感病毒的繁殖明显的被抑制了。这清楚地说明，灭活的流感病毒作用于细胞后，细胞产生了一种可溶性物质干扰了病毒的繁殖。当时，他们把这种物质命名为干扰素( i n t e r f e r o n ) ，也就是我们现在所称的v 一干扰素。1 9 6 5 年，w h e e l o c k报道了用p h a 刺激人白细胞时产生一种对酸不稳定的y 一干扰素( i n t e r f e r o n y ) ，又名免疫干扰素。22 千扰素的分类及产生机理干扰素的细胞来源因动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件而异，可分为来自白细胞的i f n o ，来自纤维细胞的i f n - b 和来自淋巴细胞和n k 细胞的i f n v 。i f n u 也属于白细胞源i f n ，i f n - k 是一新型的纤维细胞源i f n 。其中，耐酸的i f n a 、i f n b 、i f n 一与i f n k 属于i 型干扰素：对酸敏感的i f n l 称为i i 型干扰素或免疫干扰素。其中i f n o 具有异质性，又可分为不同的亚型。“，分别命名为al ，o ：，o ，等，目前已经鉴定的i f n a 亚型至少有2 3 种之多。由病毒、微生物及其产物诱导产生的i 型干扰素主要参与抗病毒、抗肿瘤，如诱导合成抗病毒蛋白，2 5 腺酸合成酶；而由t 淋巴细胞和n k 细胞受有丝分裂原或特异抗原刺激原产生的i i 型干扰素除了有抗病毒、肿瘤外，还参与诱导m h c 类抗原的表达和免疫调节效应。干扰素的产生受细胞基因组控制，由于细胞d n a 中干扰素基因抑制物( i f ns u r p r e s o r )与干扰素基因结合，抑制复制酶系统，所以一般情况下，干扰素基因处于抑制状态。当 耍盔兰! 垒堑星堡主堂堡迨塞亡堕塑竖型查生! ：王垫垂笪塞堕董堕篮塞姿病毒或其他诱生剂作用于细胞膜后，使干扰素基因脱抑制，干扰素操纵子开始转录，合成m r n a ，m r n a 迅速转移至细胞浆，在核糖体上转译成干扰素前体，切除信号肽后，成熟的干扰素分泌到细胞外( 如图卜1 ) 。病毒或华诱生莉i f n 抑串9 摄白基因组。挚葫胞i f n 抑舀蟹白m r n 灭蹦鼢k e = = i = ：i 恐白jt干扰素摹因激活不话动性t p n 揶制蛋白j”吐n ai干扰索简体l 切随信号肚成熟干扰襄分泌到细胞外图i - i 干扰素产生机理( 颜丽萍绘)2 3 干扰素的分子结构i f n a 的各亚型均含1 6 6 - 1 7 2 个氨基酸残基，结构相似，无糖基，分子量约为1 9 k d左右，不同种属间同源性7 0 左右“”：i f n b 含1 6 6 个氨基酸残基，有糖基，分子量为2 3 k d ；i f n 一( ) 含1 7 2 1 7 4 个氨基酸残基。不同类型干扰素分子具有不同程度的氨基酸同源性( i f n a 与i f n b 分子同源性为2 8 ，与i f n 一( ) 分子同源性高达6 0 ) 。i f n a 与i f n b 的结构基因均定位于人的第九号染色体上，而且都不含有内含子。i f n 一1 ，基因定位于第1 2 号染色体上，共含有3 个内含子。目前己鉴定出的i f n a 非等位基因至少有1 5 个，0而i f n - 0 和i f n 一丫均由单基因编码。动物i f n 一丫基因4 个外显子编码数目相近的氨基酸。第一个外显子包含5 u t r ，1 9 个氨基酸的信号序列和2 2 个氨基酸的成熟蛋白质。外显子2 - 4 分别编码2 3 ，6 0 ，4 0 个氨基酸，外显子4 也编码终止子与37u t r ，外显子2 与4 的氨基酸序列具有高度保守性，分别为5 6 5 与4 2 5 。三个内含子准确插入两个密码予之间的开放阅读框。内含子都具有保守性序列，包括5 g t 与3 a g 。尽管氨基酸序列存在差异，但i 型干扰素具有相似的三维结构，都由紧密排列的n 螺旋结构域构成，并表现出相似的生理、生化特征，如对p h 的稳定性和对同类细胞表面受体的识别。i f n 一7 是一同型二聚 耍盔兰! 垒堑旦堡主芏垡堡塞亡堕塑坚型查生上主塑鲞堕塞堕量堕堡塞姿体，每一个原体细胞中含有与i f n b 排列相似的螺旋区，它的细胞表面结合受体也不同于i 型干扰素。2 4 干扰素的基本特性干扰素是一种糖蛋白，分子量为2 0 - 1 0 0 k d ，其不能通过普通透析膜，但可通过滤菌器。干扰素比病毒颗粒小，沉淀病毒的离心力不能沉降干扰素。在温度稳定方面，干扰素一般在5 6 c ，3 0 分钟不被灭活，- 2 0 。c 可长期保存。在p h 稳定性方面，干扰素一a 1 3耐酸，在p h 2 o - 1 0 o 中很稳定。干扰素叫有严格的种属特异性，对酸不稳定，在p h 2 0时极易破坏，在5 6 。c ，3 0 分钟被破坏。干扰素一般由1 5 0 - 1 6 0 个氨基酸组成，含1 7 种以上的氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸的含量较高，不含核酸，所以不被d n a 酶或r n a 酶破坏，但易被胰蛋白酶、乙醚、氯仿和酮基等破坏。研究表明干扰素具有广谱性，也就是说干扰素作用于机体有机组织细胞后，可使机体获得抗多种病毒和微生物的能力。但干扰素仅作用于异常细胞，对正常细胞的作用很小，也就是说干扰素对一个体细胞具有严格的选择性，而且有相对的种属特异性，即由某一种生物细胞产生的干扰素只作用于同种生物细胞，使其获得保护自身的能力。对他种生物细胞则无作用，因而其应用受到限制。2 5y 一干扰素基因的转录调控通常干扰素基因受一种抑制物的作用而使其表达处于沉默状态，只有受到诱导和刺激后被激活才进行转录，转录时也受到多种因素的调节和控制，这些因素相互作用，组成一个复杂的基因转录调控网络。研究表明，在c d 4 + t 细胞受到抗原刺激分化为t h l t h 2时，细胞因子基因转录需要经过两个阶段：首先是未致敏的c d 4 4t 细胞受到抗原刺激后活化、增殖，同时在i l 一4 和i l 1 2 的作用下开始向t h l 或t h 2 分化，在此过程中i l 一4 和i f n l基因位点染色体重构，d n a 去甲基化，细胞特异性转录因子及细胞表面受体的上调和下调：然后i l 一4 和i f n l 基因在诱导性转录因子作用下进行转录1 ，这些转录因子包括活化t 细胞核因子( n 卜a t ) ，c - m a f ，g a t a 一3 和t h l 细胞特异性转录因子( t b o xe x p r e s s e di ntc e l l ，t - b e t ) 等”。n f a t 可以和i l - 4 基因启动子近端的5 个功能性位点( p o p 4 )相结合，并与结合在p l 和p 4 位点的激活蛋白( a p - 1 ) 协同作用，诱导i l 一4 呈低水平转录；同时，在i l 一4 基因3 增强子上亦存在功能性n f - a t 结合位点，增强子与启动子协同作用，6亡塑丕芏兰垒竖星塑圭芏垡笙奎 堕塑竖型查e 士垫塞堕塞堕量堕鳖垂姿才能使i l 一4 基因充分转录与表达啪m 1 。尽管n f - a t 和a p - i 对i l - 4 基因表达具有重要作用，但i l 一4 基因的表达必需细胞特异性转录因子的参与才能完全实现。c m a f 属于亮氨酸拉链转录因子家族，其只在t h 2 细胞中表达而不在t h l 细胞中表达，它可以与i l 一4 基因启动子近端m a r 反应元件结合。在体外，c - m a f 可以激活i l + 4 基因启动子，c - m a f 基因敲除的小鼠i l - 4 产生明显减少，但其它t h 2 类细胞因子( i l 一4 、5 、6 、1 0 、1 3 等) 的产生不受影响。因此，c - m a f 对i l 一4 基因的高水平表达有重要作用“”g a t a 一3 属锌指结构转录因子家族成员，也是t h 2 特异性转录因子。g a t a - 3 在早期分化的t h l 细胞中移位表达，可抑翻j t h l 分化，使i l 一4 等t h 2 类细胞因子分泌增加，而使i f n - t 等t h l 类细胞因子( i f n - y ，i l 一2 、1 2 等) 分泌减少；但i l 一4 和i l 一5 基因对g a t a 一3 的反应不同，g a t a _ 3 可直接激活i l - 5基因启动子，而1 l 一4 基因启动子对g a t a 一3 反应性较低，但对c m a f 具有很强的结合能力。”。3 。t - b e t 为首次在免疫细胞中发现的t 盒转录因子家族成员，小鼠的t b e t 蛋自由5 3 0 个氨基酸组成，含有一个由1 8 9 个氨基酸组成的t 盒d n a 结合域，人t - b e t 在氨基酸水平与小鼠t b e t 有8 8 的同源性。用n o r t h e r n 印迹和w e s t e r n 印迹杂交证实其仅选择性的表达于t h l 细胞，在未分化的c d 4 + t 细胞及t h 2 细胞中不表达，新鲜分离的t c r 转基因脾细胞在t h l 而非t h 2 诱导条件下可观察到t b e t 的表达：除t h l 细胞外，在活化的b 细胞和n k细胞中可观察到t b e t 和i f n 一丫的同时表达，这表明t b e t 可能与i f n 一丫的表达有关1 。目前在i f n - v 基因上发现了3 个潜在的t 咄e t 结合位点。两个位于启动子，一个位于第三个内含予，t b e t 结合后不但可以特异性的激活i f n l 基因的表达，而且可使i f n y 基因位点染色体重组，可有效地反式激活i f n 吖基因和i f n _ 丫的内源表达。另外还发现t b e t对i l 一2 启动子具有抑制作用，而对i l - 4 启动子无明显作用，但它可能通过抑带f g a t a 一3基因转录，降i 氐g a t a 一3 水平，从而抑$ , j t h 2 类细胞因子转录”。异位表达t b e t 于新鲜分离的人t 细胞，不仅可使t 细胞在缺乏相应细胞因子诱导下向t h l 型细胞分化，而且能诱导己分化的效应性t h 2 细胞重新向下h 1 细胞分化o 。从而说明t - b e t 是诱导t b l 细胞定向分化的特异性转录因子。i f n 吖的分泌除了与细胞激活导致基因转录增加有关之外，还与转录后m r n a 的稳定性有关。人们早就发现多种细胞因子m r n a 的半衰期( t l 2 ) 很短，如i f n ，c f o s ，c m y c ，g m - c s f 等的m r n at l 2 均短于3 0 分钟，而b 一珠蛋白的t l 2 长达1 7 j 、时，通过分析发现c f o s ，i l 一卜3 ， f n ，t n f ，g - c s f ，g n c s f 等基因的m r n a3 u t r 区富a u 。”，当把h g m - c s f 的3 富含a u 区连接到大鼠b 一珠蛋白基因的3 端后，发现0 一珠蛋白m r n a 的稳定性降低了l o 一3 0 倍，如果把g m c s f 和i l 一3m r n a3 u t r 区富含a u 区缺失，则i l 一3塑盔堂! 垒堑星堡主堂垡笙奎耍塑登型垄生! ：王垫壅盟塞堕量堕垫壅垄m r n a 的稳定性有明显的提高，半衰期从 4 4 、时。所以，3 u t r 内的富含a ux c 是i f n lm r n a 降解的信号识别区。”1 。研究i f n y 基因表达调控具有实际意义，一方面可指导我们发掘拮抗剂或激活剂，便于主动地调节其表达：另一方面可指导我们构建高效真核表达体系，以获得高产量的重组细胞因子，用于疾病的治疗或作为疫苗佐剂使用。2 6y 一干扰素受体及其介导的信号传递受体( r e c e p t o r ) 是细胞表面或亚细胞组分中的一种生物大分子物质，可以识别并特异性的与有生物活性的配体相结合，从而激活或启动细胞的一系列生物化学反应，最后导致配体特定的生物学效应“，i f n l 发挥其相应的生物学功能也必须与其存在于靶细胞上的特异性受体相结合，通过受体的介导作用将胞外信号传导至细胞内，从而引起细胞内的一系列变化；另外，i f n l 的作用范围和生物学效应，取决于i f n y 受体( i f n 一丫r )的表达和分布“”。可见，受体在i f n 叫发挥其相应生物学效应中具有十分重要的作用。因此，i f n 叫信号转导途径研究是目前研究的一个热点，人们正在试图控制或改变信号转导，从而治疗一系列疾病如肿瘤、自身免疫性疾病、免疫抑制或免疫缺陷、移植排斥反应等。2 6 1w n - t r 的结构特点i f n - y r 是i 虫c d l l 9 和i f n 一 r 辅助因子一1 ( i f n la c c e s s o r yf a c t o rl ，i f n l ，a f 一1 ) 组成。其中c d l l 9 全长2 2 9 个氨基酸，分子量为9 0 一i o o k d ，胞膜外区有2 2 9 个氨基酸，含有两个f n 3 结构域，五个n 一连糖基化位点，但无i 型细胞因子受体家族f n 3 中的t r p s e r x t r p s e r ( w s x w s ) 基序，它是i f n _ 丫r 的c i 链，可与i f n l 二聚体结合，主要分布于单核细胞、巨噬细胞、t 细胞、b 细胞、n k 细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、上皮以及多种肿瘤细胞。”。i f n a f l 全长3 1 0 氨基酸残基，分子量为6 2 k d ，胞膜外区有2 2 0 个氨基酸。含有两个f n 3 结构域，但缺乏w s x w s 基序，有六个n 一连接糖基化位点：跨膜区和胞浆区分别为2 l 和6 9 个氨基酸残基，基因定位于2 1 q 2 2 卜l q 2 2 2 ，它为i f n y r 的b 链“”。c d i l 9 可与i f n 一丫高亲和力结合，i f n l a f 一1 主要通过胞膜外区与c d i1 9 结合介导i f n y 的信号向细胞内传递“。2 6 ，2i f n y 刺激基因( i n t e r f e r o n - s t i m u i a t e dg e n e ，i s a )璺盔兰! ! 塑璺塑主兰篁堡奎堕塑登型查生! ：王垫壅塑塞堕兰堕堡垂堕对干扰素调节的一些细胞基因的鉴定是干扰素研究进展的一个里程碑，干扰素基因大致可分三个主要类型：i 型干扰素诱导：i f n 叫诱导；被所有干扰素诱导。在9 0 年代，人们认为干扰素至少诱导表达5 0 - 6 0 种蛋白质m 3 。然而，对人单个细胞系的整个基因组分析表明：干扰素至少诱导表达2 5 0 - 3 0 0 个基因和下调1 0 多个基因表达。这只是对三分之转录体的分析出来的结果，还有其他的i s g 尚待发现。干扰素刺激基因编码蛋白的功能包括：调节膜组成，转录、转译、r n a 稳定、蛋白质稳定、分泌、核孔开放、应急信号、细胞周期循环和抗原提里等，事实上，干扰素能够影响整个细胞结构【 7 j 【4 8 ) 酬。2 6 3i f n 应答元件( t h ei n t e r f e r o n r e s p o n s i v ee i e m e n t s )对一些i 型干扰素和i i 型干扰素应答基因的启动予分析显示：保守的干扰素刺激应答元件( i n t e r f e r o n - s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n ti s r e ) 对干扰素的应答是非常关键的“”3 。i s r e 的保守同源序列是a g g t t t c n n n t t t c c t 。i f n - y 刺激基因含有各种各样的应答元件，包括干扰素激活位点( i n t e r f e r o n 叫a c t i v a t e ds i t e ，g a s ) 阻1 ，于扰素激活转录元件( i n t e r f e r o n ga c t i v a t e dt r a n s c r i p t l o n a le l e m e n tg a t e ) 、x - 盒、y 一盒等 s s i s l = 根据这些基因表达的时期，可将它们分为早期和晚期基因。大多数已知的早期干扰素激活基因含有一个独特的g a s 元件呻1 ，g a s 的序列为t t n n n n a a ，它是第一个与信号转导和转录激活物( s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ，s t a t ) 结合的元件，然而，一些与g a s 相似但有着不同的序列长度与序列间隔元件，能与各种各样的细胞因子诱导的不同s t a t 结合应答。”“”。一些与i s r e 的同源区不一样的元件，也能与干扰萘产生应答”“。在鼠干扰素调节基因调节子的启动子的干扰素激活转录元件( i n t e r f e r o n ga c t i v a t e dt r a n s c r i p t i o n a ie l e m e n tg a t e ) 中发现：g a t e 看起来像i s r e ，然两，仔细观察这个元件发现g a t e 结合蛋白与i s r e 结合蛋白是不一样的。g a t e ( 2 4 b p ) 也比i s r e ( 1 5 b p )长，与i s r e 和g a s 同源性低。2 6 4 调节干扰素刺激应答的转录因子发现i s r e 后，与之反应的蛋白也得到了鉴定，即干扰索刺激基因因子( i n t e r f e r o n s t i m u l a t e dg e n ef a c t o r ，i s g f ) 。i s g f 就是一种i s r e 结合因子，i s g f包括干扰素基因调节因子( i n t e r f e r o ng e n er e g u l a t o r yf a c t o r ，i r f ) 家族的一些耍丕堂! 塑! 星堡主堂堡垒奎 耍翌竖型变垫茎盟塞堕芝堕鏊塞堕成员和被称为s t a t 的一组蛋白。e m s a 实验检测发现：i s g f 2 和i s g f 3 是阳性调节子，而i s g f i 则显示为抑制子岫“”。后来i s g f 2 被鉴定为i r f i ，它不是干扰素应答的主要调节子，但是它对一些特异的i s