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电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 摘要 有机磷农药的大量使用造成了严重的环境污染，对人类的健康造成了严重 危害。因此，发展有机磷农药的检测技术越来越受到人们的高度重视。现有的 农药残留检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法以及与各种光谱联用技术等。 但是，这些方法不仅成本高，耗时多，而且所需仪器大都昂贵且庞大笨重，需 要专业技术人员操作，不适用于现场检测。生物传感器技术弥补了上述方法的 缺点，可满足现场快速检测的需要。而且生物传感器技术具有响应速度快，操 作简单，灵敏度高，测定成本较低等突出优点，是近年来备受关注的研究领域， 已越来越广泛地应用于有机磷及氨基甲酸酯类农药的检测，具有很好的发展前 景。本文设计了两种电化学酶传感器，这些传感器制备简单，使用方便，灵敏 度高，可对有机磷农药进行快速检测。本论文工作主要包括以下三个方面： 1 辣根过氧化物酶( h r p ) 修饰电极的制备及h 2 0 2 的检测 h ：0 2 的快速、准确检测是研制本文设计的有机磷农药酶传感器的重要基础。 本章对h 2 0 2 的检测分为两大部分。第一部分为h r p 修饰石墨电极检测h 2 0 2 ，我 们以聚邻苯二胺( p o p d ) 修饰石墨电极为基底电极，利用纳米金( n a n o a u ) 静电吸附法将h r p 固定在电极上并对h 2 0 2 进行检测。结果表明，以h r p n a n o - a u p o p d 石墨电极检测h 2 0 2 的检测限为8 8 2 1 0 一m o l 1 , ，线性范围为3 5 3 1 0 。 2 1 5 1 0 一m o l l 。该h 2 0 2 传感器具有电极制作方法简单，检测迅速，响应时间 小于3m i n ，灵敏度高，线性范围宽，一致性较好，寿命较长等优点。用该传感 器检测食品中微量h 2 0 2 时，选择性好，回收率为9 6 1 - 1 0 7 9 ，r s d 3 ，2 5 0u m g ，相对分子质量为 4 4 0 0 0g t o o l ，上海金璐贸易有限公司) ；三( 羟学基) 氨基甲烷( 强s ；邻苯二 胺( 天津市科密欧化学试剂开发中心) ；h 2 0 2 溶液( 3 0 ) ( 天津市科密欧化学 试剂开发中心) ；氯金酸，柠檬酸三钠，磷酸二氢钾，磷酸氨二钠，氯化钾，氯 化钠，麓萄糖，柠檬酸，o 半胱氨酸，甘氨酸，抗坏盘酸。 所罱试裁均为分析纯；所有溶液配制用水均为超纯水。 2 1 1 3h r p 修饰石墨电极的制备 将萑墨电极打磨至光亮，溺超纯水清洗干净。取1 0m l4 0m m 邻苯二胺溶 液于小烧杯中，组装好三电极系统( 裸石墨电极作为工作电极，饱和甘汞电极 作为参比电极，铂电极作为对电极) ，在0 3 - - 1 3v 范围内以1 0 0m v s 扫速循 环翔描4 0 次，取壤电极用超纯水冲洗，并用氮气吹予。然爱将此修饰电极浸入 1 0m l 纳米金溶胶中，组装好三电极系统( p o p d 修饰石墨电极作为工作电极， 饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极) ，恒电位1 5 5v 组装6 0r a i n ， 取嬲用超纯水冲洗，并用氮气吹干。最后用微量进样器取4u l1 0m g m lh r p 涂予修饰电极表瑟，晾干后再雳超纯水；孛洗，并用氮气吹干，即霹制成h r p t n a n o a u p o p d 石墨电极。 2 。1 1 4 检测方法 在小烧杯中加入2 0n i l 邻苯二胺溶液作为底物溶液。组装好指示电极 ( h r p n a n o a l 脚o p d 石墨电极) 和参比电极( 饱和甘汞电极) ，待电位示数稳 定艨，依次加入定浓度的h 2 0 2 标准溶液，测定反应体系电位的变化值。以电 位的变化篷对h 2 0 2 浓度的对数作图，其直线部分即失检溅嚣2 0 2 的标准瞒线。 2 1 2 结果与讨论 2 1 2 1p o p d 膜修饰电极的表诬 电化学聚合法是近年发展起来的电子导电聚合物的一类制备方法。这一方 法采用电极电位作为聚合反应的引发和反应驱动力，在电极表面上进行聚合反 1 8 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 应并直接生成导电聚合物膜。导电聚合物在电极表面的电化学聚合，由于其特 殊的化学和物理性质，很早就引起了人们广泛的兴趣。人们已对多种导电聚合 物，如聚苯胺，聚乙炔，聚吡咯，聚噻吩等的电化学性质进行了系统的研究惭】。 聚苯胺是研究较广泛的导电聚合物之一，苯胺衍生物也是人们感兴趣的研究对 象。穆绍林【6 7 】等曾经系统地对1 6 种苯胺衍生物的电化学性质进行了研究，发现 只有邻位取代基的衍生物才能电聚合。聚邻苯二胺( p o p d ) 即是该类衍生物之一， 由于0 p d 比苯胺能提供更多的可修饰基团，因此在电催化、电显色、化学传感 器 6 8 , 6 9 和电极修饰材料等方面都有重要的用途。 p o p d 膜的导电性与膜的厚度相关。通过实验我们可以观察到阴极峰电流在 前4 0 次循环扫描过程中逐渐增大，而后随着扫描次数的增加反而减小，说明膜 的导电性随循环扫描次数增加先增大后减小。在电聚合过程中，前4 0 次循环扫 描过程对应的是导电性膜的形成过程，继续扫描时膜厚度继续增大而导致电阻 增大，因此电流逐渐减小。以下实验我们均选择导电性最好的4 0 次循环扫描来 修饰电极。 2 1 2 2 纳米金溶胶的制备及表征 随着纳米材料研究的不断深入，各种纳米材料的不同性质已逐渐为人们所 了解【7 0 】，纳米材料以其特有的物化性质在生物学、化学、免疫学等领域展现出 广阔的应用前景。金溶胶是一种重要的纳米材料，最早由f a r a d a y 在1 8 5 9 年首 次制得。它一度被用作免疫电镜技术中的标记物，广泛应用在免疫分析领域【7 1 1 。 如今n a n o - a u 以其良好的生物相容性，在生物化学等领域的应用已成为热点课 题。n a n o a u 溶胶能够保持蛋白质的生物活性f 7 2 例，因此，它常用作蛋白质氧 化还原的直接电子传递体 7 4 , 7 5 1 和制备生物传感裂7 6 ，7 7 1 。 n a n o a u 的制备已有成熟技术。将l m l l ( 质量分数) 的h a u c h 溶液加入 到1 0 0m l 超纯水中，加热至沸，在剧烈搅拌下快速加入4m l l ( 质量分数) 的柠檬 酸三钠溶液。在沸腾情况下搅拌1 0m i n , 这期间溶液颜色由灰变蓝再变紫，最后 为酒红色。移去热源后再搅拌1 0m i n ，即制得平均径粒为1 01 1 m 的金溶胶。将制 备得到的金溶胶置于棕色瓶中，于4 c 下保存备用。 图2 2 为n a n o - a u 溶胶的紫外可见吸收光谱，从图中可以看到n a n o - a u 溶 胶在5 2 0n i l l 处有一个吸收峰，峰形对称，表明所制备的金溶胶为单分散体系， 电位篓多酶赞感嚣在有瓿磷农药检测中翡应用 胶体粒子接近球形且粒径较窄【7 8 】。 柏0 $ o o6 0 0 7 0 08 0 0 a 加m 毽2 2n a n o - a u 溶胶的紫外簟霓吸收光谱 2 1 2 3h r p n a n o - a u p o p d 修饰石墨电极的组装过程 本文剩属tn a n o - a u 具有较小的半径和较大的院表瑟积，并对氨基有强烈 的吸附作用的性质【7 9 1 ，在p o p d 修饰电极上用电聚合的方法修饰n a n o a u ，然 后再通过n a n o a u 对h r p 中氨基的吸附作用采用涂膜的方法实现h r p 的固定 化。整个组装过程如图2 。3 所示； 固定化 h r p 匕= = = = 蝴糊。嗽咖。0 n 锄m ， h r p 趱2 3h r p n a n o - a u p o p d 名；纂电援酌纽装示意蹬 2 1 2 4h r p n a n o 加卯o p d 修饰石墨电极的性能测试 以h r p n a n o a 姻o p 磊墨电极为指示电援，饱和苗汞电极为参玩电极， 在p h 9 8 的t r i s h c l 溶液中检测h 2 0 2 ，实验结果见图2 4 、2 5 。 从实验结果可以看出，h r p n a n o - a u p o p d 毛i 墨电极在由p h 9 8t r i s h c l 2 o 8 6 毒 2 o ， o o o o o 3 曼 厦蠢氍薹 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 配制的邻苯二胺溶液中检测h 2 0 2 的线性回归方程为y = 3 3 8 7 5 x + 2 1 6 4 3 ，检测限 为8 8 2 x 1 0 。8 m o i l ，线性范围为3 5 3 1 0 - 7 2 1 5 1 0 乏m o l l ，相关系数南9 9 5 1 。 检测下限较低，适合于微量h 2 0 2 的定量检测。 8765- 4- 3- 21 i g c ( m o l l ) 图2 4i - i r p 修饰石墨电极检测h 2 0 2 的 响应曲线 2 1 2 5 传感器的寿命 s 8 0 邑 岩4 0 7- 6- 5 - - 32 i g c ( m o l l ) 图2 5 h r p 修饰石墨电极检测h 2 0 2 的 标准曲线 用1 同一支i - i r p n a n o 一川p o p d 石墨电极在一个月内检测h 2 0 27 次( 图2 6 、 2 7 ) ，结果表明，该传感器在3 0 天内检测h 2 0 2 标准曲线斜率下降为初始的7 9 ， 可见该传感器具有较好的重现性。 i g c ( m o l l ) 图2 6h r p 修饰石墨电极在一个月内检 测h 2 0 2 7 次的响应曲线 2 l 卸 4 0 岁3 0 e & 2 0 o 西 1 0 o 051 01 52 02 5弱 t i m e ( d a y ) 图2 7h r p 修饰石墨电极检测h 2 0 2 的标准 曲线斜率随检测天数的变化曲线 柏 o ( e 一山q 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 2 1 2 6 传感器的一致性 采用相同条件下制备的7 支电极检测h 2 0 2 的线性范围及检测下限相似，标 准曲线斜率的相对标准偏差r s d = i 7 5 ( 图2 8 、2 9 ) ，表明该电极的一致性很 好。 e 山 q i g c ( m o l l ) 图2 8 不同m 冲修饰石墨电极检测h 2 0 2 的响应曲线 2 1 2 7 食品中微量h 2 0 2 的检测 1234567 一t h en u m b e ro fe l e c t r o d e 图2 9 不同h r p 修饰石墨电极检测h 2 0 2 的标准曲线斜率对比 利用上述制备的h 2 0 2 传感器，分别对钙片、虾皮、豆制品、牛百叶中的微 量h 2 0 2 进行了测定。各种样品需经充分碾碎、混匀后，用超纯水溶解，浸泡3 0 m i n 后过滤，取滤液待用。检测结果见表2 1 ： 表2 1 实际样品中h 2 0 2 的检测 柏 如 竹 0 一edqols 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 2 1 2 8 回收率实验： 为验证电极的实用性，采用标准加入法，在测定食品中微量h 2 0 2 时进行了 加标回收实验，回收率为9 6 1 - 1 0 7 9 ，相对标准偏差r s d 昙6 0 山 q 3 0 o 8 7 - 65432 i g c ( m o l l ) 图2 1 5 溶解h r p 的p b s 酸度对检测 h 2 0 2 响应曲线的影响 7 5 4 5 e m 号 ( ，) 1 5 o 4 55 05 56 06 57 07 58 08 5 p h 图2 1 6 溶解h r p 的p b s 酸度对检测 h 2 0 2 标准曲线斜率的影响 阳 的 柏 一eools o 一 一山q 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 e 山 司 i g c ( m o l l ) 藿加 q o2 0 c ) o o 20 3 c ( m o l l ) 图2 1 7 溶解h r p 的p b s 浓度对检测图2 1 8 溶解t i r p 的p b s 浓度对检测 h ，0 ，响应曲线的影响h ，0 ，标准曲线斜率的影响 表2 5 溶解h r p 的p b s 酸度对检测h 2 0 2 的影响 3 l 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 2 2 2 6h r p e d c + n h s 4 m b a 金片电极的性能测试 在优化实验条件下，以如e d c 吣m s 4 m b a 金片电极为指示电极，饱和 甘汞电极为参比电极，在p h7 4 的r i f f s h c i 溶液中检测h 2 0 2 ，实验结果见图2 1 9 、 2 2 0 。从实验结果可以看出，阳妞厄d c + s 4 m b a 金片电极在由p h7 4 i r i s h c l 配制的邻苯二胺溶液中检测h 2 0 2 的线性回归方程为y = 5 7 9 5 3 x + 4 2 7 5 7 ， 检测限为8 8 2 x i 0 一m o l l ，线性范围为3 5 3 x 1 0 培一8 8 2 x 1 0 击m o l l ，相关系数 r = o 9 9 4 。检测下限较低，适合于微量h 2 0 2 的定量检测。 87- 6- 5- 4 3 i g c ( m o l l ) 图2 1 9 h r p 修饰金片电极检测h 2 0 2 的 响应曲线 2 2 3 小结 - 7 5 7 0- 6 5 - 60 - 5 55 0 i g c ( m o l l ) 图2 2 0 h r p 修嘶金片电极检测h 2 0 2 的 标准曲线 通过自组装技术将带一c o o h 的硫醇固定在金基底上，利用共价键结合的方 法将h r p 牢固地固定于自组膜上，得至u h r p e d c + n h s 4 m b a 金片电极，并在 由p h 7 4t r i s h c l 配制的邻苯二胺溶液中测定h 2 0 2 的线性回归方程为 y = 5 7 9 5 3 x + 4 2 7 5 7 ，检测限为8 8 2 x 1 0 母m o l l ，线性范围为3 5 3 x 1 0 培8 8 2 x 1 0 。6 m o l l ，线性相关系数r - - - o 9 9 4 。该传感器制备简单，响应时间小于3m i n ，检测迅 速，灵敏度高，而且检测限较低，适合于微量h 2 0 2 的定量检测，具有广阔的应 用前景。同时证明该传感器可以进一步作为制作检测有机磷农药传感器的基础 电极。 3 2 矗 己 0 一 一山q o (一山 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 第3 章基于a l p 抑制的双酶传感器检测有机磷农药 3 1 实验部分 3 ：1 1 仪器与试剂 m m 3 微机化多功能离子分析器( 江苏江分电分析仪器有限公司) ；8 5 2 c 磁力加热搅拌器( 巩义市英峪予华仪器厂) ；p h s 一3 c 型精密酸度计( 上海精密 分析仪器公司) ；s a r t o r i u sb s 2 1 0 s 型分析天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公 司) ；1 0u l 微量移液器( 临海市华威分析仪器有限公司) ；超纯水系统( h u m a n l i p 9 0 0 ，h u m a n 公司，韩国) ；h r p 修饰石墨电极作为指示电极或工作电极，饱 和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极。 辣根过氧化物酶( h r p ，e c1 1 1 1 7 ，r z 3 ，2 5 0u m g ，相对分子质量为 4 4 0 0 0g t o o l ，上海金璐贸易有限公司，1 0m g m l ，p h7 4 磷酸盐缓冲溶液配制) ； 碱性磷酸酶( a l p ，p r o m e g ac o p o r a t i o n ) ；邻苯二胺( 天津市科密欧化学试剂开 发中心) ；3 吲哚酚磷酸酯( 3 i p ，北京百灵威化学技术有限公司) ；5 0 对硫磷 乳油( 天津市施普乐农药技术发展有限公司) ；氯金酸，柠檬酸三钠，磷酸二氢 钾，磷酸氢二钠，三( 羟甲基) 氨基甲烷( 嘶s ) 。， 所用试剂均为分析纯；所有溶液配制用水均为超纯水。 3 1 2 实验原理 由于有机磷农药对胆碱酯酶的抑制是不可逆的，因此基于这类原理制备的 酶传感器一般只能一次性使用，成本太高【8 2 8 3 】。鉴于此本实验提出了一种新型 有机磷生物传感器。我们选用h r p 修饰石墨电极为基础电极，在检测体系中， 加入碱性磷酸酶( a l p ) 和它的底物3 吲哚氧基磷酸酯( 3 p ) ，3 i p 会在a l p 的催化作用下水解并耦合最终放出h 2 0 2 ，h 2 0 2 又会被电极表面的h r p 催化分 解而引起电极电位的响应。当有机磷农药抑制该a l p 反应时，水解反应的速率 相应减小，从而引起电位响应值发生变化。溶液中有机磷农药的浓度越高，反 应生成h 2 0 2 的速率就越慢，电位变化值相应就越小。而一定反应时间内的电位 变化值与有机磷农药浓度成正比。因此，可通过测定电位的变化就可得到农药 的含量。这个反应的检测原理如下： 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 p p 0 3 2 -9 q h 2 q 骂2 旺务且q 烈习：吼 龟吣l ，nh 2 20 i+3 h 2 0 2 v n h 2 hrp n n n 丫。 v 1 - n h nh 2 2 + 6 h ：。 有机磷农药对第一步反应的催化剂a l p 有抑制作用，为该反应的抑制剂。 而产物h 2 0 2 的浓度可由2 1 制备的h 2 0 2 传感器测定。 3 1 3 实验方法 在小烧杯中加入2 0m l 邻苯二胺溶液( 由0 1m o v lp h = 9 8t r i s h c i 配制) 作为检测的底物溶液。加入1 5u l1 0u m l a l p 和一定量的有机磷农药标准液， 搅拌下抑制1 5m i n 。组装好指示电极( 2 1 制备的h r p n a n o a u p o p d 石墨电极) 和参比电极( 饱和甘汞电极) ，待电位示数稳定后，加入o 5m l3m m o l l3 i p 溶液，测定电位随时间变化曲线。以一定反应时间内电位变化值对有机磷农药 浓度作图，即为检测有机磷农药的标准曲线。 3 2 结果与讨论 3 2 1 反应时间的确定 在小烧杯中加入2 0m l 邻苯二胺溶液( 由0 1m o l l p h9 8t r i s h c l 配制) 作为底物溶液。加入1 5u ll ou m l a l p 溶液，组装好指示电极( 心n a n o - a u p o p d 石墨电极) 和参比电极( 饱和甘汞电极) ，待电位示数稳定后，加入0 5 m l 3m m o l l3 i p 溶液，测定体系的电位随时间变化曲线( 结果如图3 1 ) 。可以看 出，随着反应的进行，传感器的电位响应值逐渐增大并趋于稳定。当进行到3 0m i n 后电位变化已经很不明显，为了缩短整个检测时间，我们选择反应时间为3 0 m i n 。 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 051 01 52 02 53 03 54 04 5-051 01 52 02 5 t m i na l p u l 图3 1 传感苎堂皇位尊寰值随反应时 图3 2a l p 用量对电位响应的影响 间的变化曲线 3 2 2a l p 用量对电位响应的影响 在反应底液中分别加入2 2 5u l1 0u m l a l p 溶液，测定不同体系的电位响 应情况，结果见图3 2 。由图可知，传感器的电位响应值随着酶用量的增加而不 断增大，当加入1 5u l a l p 时电位响应值接近最大，传感器响应最灵敏，之后趋 于稳定，故选择最佳的a l p 用量为1 5u l 。 3 2 33 i p 用量对电位响应的影响 底物浓度对传感器响应性能会产生影响。在反应底液中分别加入 0 0 5 - 1 0 m l 的3 m m o 讥3 i p 溶液，测定不同体系的电位响应值( 结果见图3 3 ) 。 结果表明，随着3 p 加入量的不断增大，传感器的电位响应值也越来越大，直 到加入量为o 5m l 时电位响应值达到最大，之后趋于稳定，因此选择最佳3 口 的量为0 5i n l 。 3 2 4 底物缓冲溶液酸度的选择 底物缓冲溶液的酸度对酶的活性影响很大，p h 过高或过低均会使酶的活性 降低，从而对反应产生影响。实验中考察了t r i s h c l 缓冲溶液酸度在p h7 4 1 1 0 时，不同体系的电位响应情况( 图3 4 ) 。由实验结果可知，随着缓冲溶液p h 的 逐渐增大，电位呈现出先下降后上升的趋势，当p h 为9 8 时电位响应达到最大， 之后趋于稳定，此时对于a l p 来说有较大的抑制空间，而且当 i r i s h c i 酸度为 3 5 柚 己 o ，山q 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 ， p h9 8 时电位达到稳定的速度最快，因此选择t r i s h c i 缓冲溶液最佳酸度为p h 9 8 。 0 00 上0 40 60 81 01 27891 01 11 2 3 - 1 p u l p h 图3 33 口用量对电位响应的影响图3 4t r i s - h c l 酸度对电位响应的影响 3 2 5 最佳抑制时间的选择 抑制时间能显著影响有机磷农药对a l p 活性的抑制程度，实验中考察了在 不同的反应体系中，分别加入1 5 6 x 1 0 。3 m o l l 对硫磷和4 5 8 x 1 0 4 m o l l 氧化乐果， 抑制不同时间后，测定体系的电位响应情况( 图3 5 、3 6 ) 。、结果表明，随着抑 制时间的不断增加，电位响应值越来越小，即a l p 被抑制的越来越强烈，当对 硫磷抑制1 5r a i n ，氧化乐果抑制1 0r a i n 时，抑制作用达到最大。因此，本实验 选择对硫磷最佳抑制时间为1 5m i n ，氧化乐果最佳抑制时间为1 0m i n 。 d51 01 52 0 t ( m i n ) 图3 5 对硫磷最佳抑制时间的选择 051 01 52 0 t ( m i n ) 图3 6 氧化乐果最佳抑制时间的选择 加 己 o e 击幻 阳 加 o e ，| q 阳 e 一| q o 邶 锄 渤 舶 蜘 勘 一 e 一山q 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 3 2 6 有机磷农药的检测 在优化实验条件下，按照上述实验方法检测对硫磷及氧化乐果农药，实验 结果见系列图3 7 3 1 0 。以检测对硫磷农药为例，图3 7 中由上到下六条曲线分 别表示对硫磷浓度为0 0 0 8 5 8 ，0 0 8 5 4 ，0 4 1 9 ，0 8 1 8 ，1 5 6 ，2 2 4m m o l l 时反应 体系的电位随时间变化曲线，可以看出，每条曲线都呈现出电位先下降后上升 的趋势，这是因为3 p 在a l p 的催化作用下生成中间产物，而3 - i p 和它水解的 中间产物在溶液中带有不同的电荷，改变了电极表面的电荷分布，从而引起电 位的变化。当中间产物浓度超过一定值时，两个中间产物分子会在氧气的存在 下聚合为靛青，并放出h 2 0 2 ，h 2 0 2 在电极表面被h r p 催化氧化溶液中的o p d ， 因此导致电极电位迅速上升。 随着体系中对硫磷浓度的逐渐增大，a l p 被抑制的程度越来越强，导致一 定反应时间内体系电位响应值越来越低，以反应进行到3 0m i n 时的电位响应值 对对硫磷浓度作图，即为检测对硫磷的标准曲线。该方法检测对硫磷标准方程 为y = 2 6 4 1 8 x + 5 8 2 2 5 ，r 2 = 0 9 9 6 2 ，线性范围为8 5 8 x 1 0 。6 2 2 4 x 1 0 一m o l l ，检 测限为4 2 9 x1 0 。6m o l l 。 同理可得到该传感器检测氧化乐果的标准方程为y = 2 3 1 2 x + 5 4 7 4 2 ，r 2 = 0 9 9 7 2 ，线性范围为1 8 8 x 1 0 。6 2 0 8 x 1 0 。m o 儿，检测限为9 3 8 x 1 0 m o l l 。 o51 0，52 02 5 3 0 3 5 t ( m i n ) 图3 7 不同对硫磷浓度下传感器的 响应曲线 e 山 q c ( m m o l k ) 图3 8 检测对硫磷标准曲线 o e 一山q 一电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 o51 0 1 52 02 53 0 t ( m i n ) 0 00 51 01 52 o2 5 c ( m m o l l ) 图3 9 不同氧化案果奎度下传感器的 图3 1 0 检测氧化乐果标准曲线 响应曲线 3 2 7 精密度实验 同一支电极重复检测一定浓度对硫磷农药6 次( 结果如图3 1 1 ) ，其电位响 应值的相对标准偏差为2 3 3 ，可见该传感器的精密度较高，数据的重现性较 好。 123456 t i m e 图3 1 1 电位响应值随检测堙翦的变化曲线 3 2 8 传感器的寿命 o5 o1 52 02 53 03 5 t i m e ( d a y ) 图3 1 2 电位响应值随检测天数的变化曲线 该传感器的寿命理论上应为h r p m o _ a u p o p d 石墨电极在p h9 8 t r i s h c i 溶液中检测h 2 0 2 的寿命( 至少为1 个月) 。但是由于传感器在检测有机 磷农药时一定程度上会被农药毒害，因此需重新考察它的寿命( 结果如图3 1 2 ) 。 3 8 柏 趵 竹 o 一山刈 o 1 一 e u q 乃 诣 ； 侣 o ，山 为 竹 e - 山_ q 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 用该传感器在1 5 天内检测对硫磷农药3 次，电位响应值下降为原来的8 1 0 ； 3 0 天内检测7 次电位响应值下降为原来的6 1 5 。虽然比单纯检测h 2 0 2 的电极 寿命低了一些，但总的来说该电极还是具有较好的稳定性。 3 3 小结 本实验根据刖一p 催化底物3 口水解放出h 2 0 2 ，h 2 0 2 又会被固定在电极表 面上的h r p 催化分解而引起电极电位变化的原理，提出了一种电位型双酶有机 磷农药生物传感器，并用该传感器对溶液中有机磷农药的含量进行了测试。结 果表明，在8 5 8 1 0 西 2 2 4 1 0 弓m o l l 的浓度范围内，电位响应值与对硫磷浓 度成良好线性关系，回归方程为y = 2 6 4 1 8 x + 5 8 2 2 5 ，r 2 = 0 9 9 6 ，检测限为4 2 9 1 0 由m o l l ；检测氧化乐果的标准方程为y = 2 3 1 2 x + 5 4 7 4 2 ，r 2 = 0 9 9 7 2 ，线 性范围为1 8 8 x 1 0 6 2 0 8 x 1 0 一m o l l ，检测限为9 3 8 x 1 0 。m o l l 。该传感器具有制 备简单，检测迅速，一致性较好，寿命较长等优点，具有一定的应用前景。并 且这种酶传感器设计新颖，成本较低，目前国内外均未见报道，富有创新性。 3 9 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 第4 章基于a c h e 抑制的三酶传感器检测有机磷农药 4 1 实验部分 4 1 1 仪器与试剂 m 认3 微机化多功能离子分析器( 江苏江分电分析仪器有限公司) ；8 5 2 c 磁力加热搅拌器( 巩义市英峪予华仪器厂) ；p h s 3 c 型精密酸度计( 上海精密 分析仪器公司) ：s a r t o r i u sb s 2 1 0 s 型分析天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公 司) ；1 0l l l 微量移液器( 临海市华威分析仪器有限公司) ；，超纯水系统( h u m a n l i p 9 0 0 ，h u m a n 公司，韩国) ； 辣根过氧化物酶( h r p ，e c1 1 1 1 7 ，r z 3 ，3 0 0u m g ，相对分子质量为 4 4 0 0 0g t o o l ，上海金璐贸易有限公司) ；胆碱氧化物酶( c h o x ，s i g m a ，e c1 1 3 1 7 ， 1 2u m g ) ；乙酰胆碱酯酶( a c h e ，s i g m a ，e c3 1 1 7 ，f r o me l e c t r i ce e l ，4 2 5 9 4u m g s o l i d ) ；对羧基苯硫酚( 4 m b a ，上海医药股份有限公司) ；1 一乙基3 ( 3 二甲氨 基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ，a l d r i c h 公司) ；n - 羟基硫代琥珀亚胺( n h s ， s i g m a ) ；邻苯二胺( 天津市科密欧化学试剂开发中心) ；氯化胆碱( 9 9 + ，s i g m a ) ； 氯化乙酰胆碱( 9 9 ，s i g m a ) ：甲胺磷标准溶液( 1 0 0 l ag m l ，北京陆桥技术有限 责任公司) ；磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，所用试剂均为分析纯，所有溶液配制用 水均为超纯水。 4 1 2 实验原理 以金片电极为基础电极，利用自组装单分子膜技术将a c l l e 、c h o x 和h r p 共同固定在电极上( 具体制备过程见2 2 ) 。在检测体系中，固定化a c h e 催化 乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，固定化c h o x 催化胆碱氧化生成h 2 0 2 ，固定化h r p 催化h 2 0 2 在金电极表面上的还原，使电极电位发生移动。当有机磷农药抑制 a c l l e 反应时，水解反应生成的胆碱量减少，胆碱氧化生成的h 2 0 2 也相应减少， 最终导致电极电位变化幅度减小。体系中有机磷农药的浓度越高，反应生成h ：0 2 的速率就越慢。定义体系的抑制率i 为：i - - ( e o e i ) e o 】1 0 0 l 8 4 8 5 1 。以一定反应 时间内不同体系的抑制率i ( 、对有机磷农药的浓度( a m ) 作图，得到检测有机 磷农药的标准曲线。 电位型多酶传感器在有机磷农药检测中的应用 上述反应表示如下： ( c h 3 ) 3n + c h 2 c h 2 0 0 c c n 3 + h 2 0 上婴l 刊( c h