（分析化学专业论文）棒曲霉素和辣椒素的鲁米诺化学发光行为研究及应用.pdf

摘要 本学位论文为棒曲霉素和辣椒素在不同氧化剂的鲁米诺化学发光体系中化学发光 行为的研究和应用。以近年来国内外有关化学发光分析的1 3 8 篇文献为基础，着重阐述 了化学发光分析法的基本原理，及其在食品分析和生物分析中的应用情况。 棒曲霉素( p a t u l i n ) 是由青霉属和曲霉属的真菌生产的毒枝菌素，广泛存在于谷物及 水果中，特别是苹果及其制品，如苹果汁、苹果酒。棒曲霉素能破坏d n a 并诱导有机体 突变，世界卫生组织将其在食物中的最高限量定为5 0 斗gk g - 1 。研究发现，棒曲霉素对鲁 米诺_ h 2 0 2 化学发光体系具有明显的增敏作用，化学发光强度的增加值与棒曲霉素浓度 在0 0 5 - 8 0 0n gm l - 1 范围内具有良好的线性关系，检出限为0 0 1n gm l - 1 ( 3 砷，成功测定 了苹果汁中的棒曲霉素；并对可能的发光机理进行了讨论。研究发现，棒曲霉素对鲁米 诺一溶解氧的化学发光反应有强烈的抑制作用，化学发光强度的降低值与棒曲霉素浓度 的变化呈线性关系，测定线性范围为0 0 4 , - - 1 0 0 n g m l - 1 ，检出限为0 0 1n g m l - 1 ( 3 0 ) ，本 法成功地应用于苹果汁中棒曲霉素的测定 辣椒素( c a p s a i c i n ) ( 反式) 8 一甲基卜香草基一6 _ 壬烯酰胺 是存在于辣椒中的一种 n _ 香草基酰胺类生物碱，是辣椒中产生辣味的主要成分，具有镇痛、消炎、促进食欲、 改善消化、抗菌杀虫等药理作用。以辣椒素对鲁米诺一溶解氧、鲁米诺一肌红蛋白、鲁米 诺一高碘酸钾、鲁米诺一过氧化氢体系的抑制化学发光反应为基础，结合流动注射技术， 自行设计安装出操作简便、快速、灵敏度高、成本低廉的化学发光分析实验装置，建立 了四种测定辣椒素的新方法，成功测定了干辣椒粉中辣椒素的含量。 关键试：棒曲霉素：辣椒素：化学发光；鲁米诺；流动注射 a bs t r a c t t h et h e s i sf o c u s e so nt h er e s e a r c ha n d a p p l i c a t i o no fp a t u l i n a n d c a p s a i c i n c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) b e h a v i o rw i t hv a r i o u sl u m i n o lc ls y s t e m s t h em e c h a n i s m sa n d a p p l i c a t i o n so fv a r i o u sc ls y s t e m sf o r t h ef o o da n db i o l o g i c a la n a l y s i sw e r es i m p l yr e v i e w e d , u s i n g13 8 r e f e r e n c e sc o n c e r n i n gc la n a l y s i s ，b a s e do nt h ef u n d a m e n t a lt h e o r yo f c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n dc o m b i n e dw i t hm yr e s e a r c hw o r k p a t u l i n ，4 - h y d r o x y 4 h - f u r o 3 ，2 - c p y r a n - 2 ( 6 h 加n e ，i sf o r m e di na p p l e sd e c a y e db y c e r t a i ng e n u so f m o l d s ，p a r t i c u l a r l yp e n i c i l l i u me x p a n s u m ，e a s i l yt r a n s f e r si n t oa p p l ej u i c e d u r i n gp r o c e s s i n go w i n gt oi t ss o l u b i l i t yi nw a t e r c a r c i n o g e n i c ，t e r a t o g e n i ca n dm u t a g e n i c e f f e c t so fp a t u l i nh a v eb e e nr e p o r t e d t h ew o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o nr e c o m m e n d sl i m i t i n g i t sc o n t e n t si nf o o d st o5 0p gk g - 1 i nt h i sw o r k ，i tw a sf o u n dt h a tp a t u l i nc o u l de n h a n c et h e c li n t e n s i t yp r o d u c e db yl u m i n o la n dh y d r o g e np e r o x i d ei na l k a l i n em e d i u m t h es y s t e m r e s p o n d e dl i n e a r l yi nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o mo 0 5t o8 0 0n gm e m lw i t ht h ed e t e c t i o n l i m i to f0 01 n gm l - ( 3 0 ) t h ep r o p o s e d m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e dt ot h e m e a s u r e m e n to fa p p l ej u i c es a m p l e s i tw a sf o u n dt h a tp a t u l i nc o u l di n h i b i tt h ec lg e n e r a t e d f r o ml u m i n o la n d d i s s o l v e d - o x y g e ns y s t e ms i g n i f i c a n t l y t h e d e c r e m e n to f c h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a sl i n e a rw i t ht h ep a t u l i nc o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g ef r o m 0 0 4t o10 0n gm l - 1 ( 尸= 0 9 9 8 9 ) ，w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f0 0 1n gm e m l ( 3 0 ) t h e p r o p o s e dm e t h o dh a sb e e na p p l i e ds u c c e s s f u l l yi nt h ed e t e r m i n a t i o no fp a t u l i ni na p p l ej u i c e c a p s a i c i n ( t r a n s - 8 - m e t h y l ? v 却a n i l l y l _ 6 邶o n e n a m i d e ) i st h ep r i n c i p a la l k a l o i dd e r i v e d f r o mc a p s i c u mf r u i te x t r a c t so fd i f f e r e n to fc a p s i c u m s p e c i e s c a p s a i c i nh a sm a n y p h a r m a c o l o g i c a le f f e c t ss u c ha sa n a l g e s i c ，a n t i - i n f l a m m a t o r y ，p r o m o t i n ga p p e t i t e ，i m p r o v e d i g e s t i o n ，a n da n t i - b a c t e r i a li n s e c t i c i d e b a s e do nt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fc a p s a i c i no nt h e c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) r e a c t i o nb e t w e e nl u m i n o l - d i s s o l v e do x y g e n ，l u m i n o l - m y o g l o b i n ， l u m i n o l - k 1 0 4a n dl u m i n o l - h 2 0 2i nf l o wi n j e c t i o n ( f i ) s y s t e m s f o u rn e wm e t h o d sw e r e e s t a b l i s h e df o rd e t e r m i n ec a p s a i c i ni nc h i l ip o w d e r k e y w o r d s ：p a t u l i n ；c a p s a i c i n ；c h e m i l u m i n e s c e n c e ；l u m i n o l ；f l o wi n j e c t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：到孱雾 指导教师签名： 2 伊7 年占月7 日2 哆年月7 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 函忍压 刁年月7 日 西北大学硕士学位论文 1 1 引言 第一部分化学发光综述 早在古希腊，人们就发现了天然的生物发光。1 8 7 7 年，r e d z i s z e w s k i 首次报 道了洛吩碱在碱性介质中与氧反应发出绿色的光人为的化学发光。1 8 8 8 年， w i e d e m a n 首次用化学发光一词描述由化学反应产生的化学发光现象。 化学发光是指某些化学反应中发出可见光的现象。其发光机理是：反应体系 中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由 基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量以光辐射的形式释放 出来，产生化学发光。产生化学发光的反应通常应满足以下条件：必须是放热反 应，所放出的化学能足够使反应产物分子变成激发态分子；具备使化学能转变为 电子激发能的合适化学机制，这是化学发光最关键的一步；处于电子激发态的产 物分子本身会发光或者将能量传递给其它会发光的分子。 化学发光反应所以能用于分析测定，是因为化学发光强度与化学反应速度相 关联，所有影响反应速度的因素都可以作为建立测定方法的依据。 化学发光反应一般可表示为： 反应物a + 反应物b 一激发态产物c 掌十其它产物 激发态产物c 奎基态产物c + 光子 化学发光强度( i c l ) 取决于化学反应的速率( d p d t ) 和化学发光量子效率( 中c l ) i c l ( t ) = 审c l d p d t 式中巾c l 可表示为：忙l _ 中，机，其中啦为生成激发态产物分子的量子效率，啦为 激发态产物分子的发光量子效率。对于特定的化学发光反应，惋l 为一定值，其反 应速度可按质量作用定律表示出与反应体系中物质浓度的关系。因此，通过测定 化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。 化学发光分析测定的物质对象可以分为三类：第一类物质是化学发光反应中 的反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物 质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式 来测定其他物质。化学发光法是一种优良的分析手段 1 - 4 ，因为它不需要激发光源， 第一部分化学发光综述 所测样品也不会产生背景发光，而且基本上不会对环境造成污染。因此，化学发光分析 的应用范围及应用前景非常广阔。 1 2 化学发光试剂的主要类型 1 2 1 鲁米诺及其衍生物化学发光体系 19 2 8 年，a l b r e c h t 发现了鲁米诺( 5 一氨基- 2 ，3 一二氢一1 ，4 二杂氮萘二酮，也称3 一氨 基一邻苯二甲酰肼) 在碱性介质中的化学发光行为，这是化学发光史上重要的一页5 1 。鲁 米诺结构简单、容易合成、有较好的水溶性，产生的化学发光的量子效率可达o 0 1 0 0 5 ， 是应用最广泛的发光试剂之一。图l 给出的是一个典型的鲁米诺化学发光光谱图，最大 发射波长位于4 2 0n n l 至4 5 0r i l l 之间，其发光反应会在开始的数秒内达到最大峰值又迅 速衰减。 l u m i n o lc i h e m i l u m i n e s c e n e e 图1 典型的鲁米诺化学发光光谱图 鲁米诺氧化发光的反应速度较慢，人们常向体系中加入某些酶类或无机催化剂，如 辣根过氧化酶、微过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶、过氧化氢酶等酶类，细 胞色素c ，血红蛋白、触珠蛋白等金属蛋白类，臭氧分子、卤素、过硫酸盐以及f e 3 + ， c u 2 + ，c 0 2 + 和它们的配合物等无机类催化剂。这些氧化剂、催化剂可氧化、催化鲁米诺 的化学发光反应，且发光强度与氧化剂、催化剂的浓度呈线性关系，由此可对这些物质 进行测定。有人对酚类衍生物增强辣根过氧化物酶一鲁米诺化学发光反应体系进行了研 究睁1 0 1 ，图2 所示。辣根过氧化物酶首先与过氧化氢反应形成氧化态的h r p ( h r p i ) ， h r p - i 再与鲁米诺阴离子反应生成半还原态的酶h r p - i i 和鲁米诺自由基。这个半还原 2 西北大学硕士学位论文 态的h r p - i i 可以继续被第二个分子的鲁米诺还原至原状态。 h r p r p i l h r p - i + h 2 0 l u m i n o i o l u m i n o l 图2 辣根过氧化物酶催化鲁米诺一h 2 0 2 体系发光过程示意图 鲁米诺的化学发光机理一般认为是研究的比较的透彻的，但到目前为止，其被氧化 的中间产物还没有得到统一的结论，只是确定了最终的发光物质是氨基邻苯二甲酸盐离 子，总的反应符合图3 给出的简单反应机理。 噶z ： o 慧三 n h 2on 。h a o 卜 。 三+ n 2 + h 矿 图3 鲁米诺化学发光简单反应机理 1 2 2 吖啶脂类化合物化学发光体系 g l u e 和p e t s c h 1 1 1 在1 9 3 5 年发现，光泽精( n ，n _ 二甲基一9 ，9 - 1 联g ( 啶二硝酸盐) 在碱性 介质中，可与还原性物质作用发光，后来又发现许多吖啶脂类化合物也具有这一特性。 光泽精只要在h 2 0 2 和o h 一存在下就能迅速产生化学发光，具有很高的发光效率，反应 机理如图4 所示。 3 第一部分化学发光综述 q 幻 l a 如 图4 光泽精化学发光机理示意图 朱智甲等采用j o n e s 柱的方法，在线还原产g e f e ( i i ) 12 1 、m o ( i i i ) 13 1 、v ( i i ) 【1 4 】、w ( i i i ) u5 1 ，研究了这些离子与光泽精的化学发光反应，并建立了相应的流动注射化学发光 分析法，分析效率高。此外，光泽精还可用于测定胍基化合物【1 6 1 。与鲁米诺相比，光泽 精有以下优点：一、光泽精的发光体n _ 甲基吖啶酮比鲁米诺的发光体3 一氨基邻苯二甲酸 发光效率更高、发光更强；二、光泽精的化学发光对某些还原剂非常敏感，如抗坏血酸、 尿酸、葡糖醛酚，检出限一般为1 1 01 t m ；三、含a - 羟羰基的化合物与光泽精会发生强 烈的化学反应，如甘油、羟基乙醛、二羟基丙酮脂等。 1 2 3 过氧化草酸脂化学发光体系 1 9 6 3 年，c h a n d r o s s 1 7 1 在进行氯化草酸与过氧化氢反应时，发现在苯等有机溶剂中 会发出微弱的蓝色光，加入葸等荧光物质时，发光强度显著增强。过氧化草酸脂化学发 光反应指芳基草酸脂、氧化剂( 通常为过氧化氢) 和某些荧光化合物的化学发光反应，是 目前己知的最有效的非酶化学发光反应，量子产率高达2 5 - 2 7 。如图5 所示，在化学 o k 一。望o - o h k 王。钟 r o 昙一舌一o r 嗨o 。f 卜。一冬一占一l 禽n ! 一j 。， l o h 只。一器。：臂 、 o ol ll l c cl 3吕| f _ f 一f h 1 7 f ：f l u o r o p h o t e 图5 过氧化草酸脂发光机理示意图 4 书上 心d 书 社器枫 坠删兰 两北大学硕士学位论文 反应中，芳基草酸脂与氧化剂发生化学反应，生成一种双氧基中间体储能物，然后将能 量转移给荧光物质，激发态的荧光物质回到基态产生光子。发生反应时，荧光物质的分 子结构通常保持不变，只是起转移能量和发射荧光的作用。化学光谱图与体系中的荧光 物质的荧光光谱相同。过氧化草酸醋类化学发光体系主要用于直接测定过氧化氢【1 锄0 1 ， 通过过氧化氢间接测定其它样品【2 1 2 4 1 ，也可以用于荧光物质【2 ”8 】的分析。 1 2 4 酸性高锰酸钾化学发光体系 酸性高锰酸钾是应用较广泛的发光试剂之一【2 9 1 。早在1 9 2 0 年，g r i n b e r g 3 0 】就报导了 以k m n 0 4 作为发光剂的化学发光现象，比发现鲁米诺化学发光现象还要早8 年。虽然 k m n 0 4 是一种很强的氧化剂，可以氧化很多物质，但是由于其发光强度极为微弱，往往 难以采用普通的光电转换装置获得有分析价值的信号，直到2 0 世纪6 0 年代末，有关 k m n 0 4 化学发光体系的研究报道并不多。1 9 7 7 年，l e b e d e v 和t s i b a n o v a 研究了k m n 0 4 与 1 2 种氨基酸的氧化还原反应，发现所有被测的的氨基酸都有发光现象，其中以谷氨酸和 天冬氨酸的化学发光最强。1 9 8 6 年以后，t o w n s h e n d 掣3 1 - 3 9 1 发表了一系列研究成果，大 大推动t k m n 0 4 化学发光研究的进展。此外，也有j k x 寸m n ( i i i ) 4 0 1 和m n ( ) 【4 1 。2 】的化学 发光现象进行了研究。 虽然高锰酸钾为氧化剂的化学发光反应己广泛的报导并应用于无机物、有机物的分 析【4 9 1 ，但在机理讨论方面，相对比较少。目前提出的化学发光机理主要有两类。第一 类，b 锄e t t 【5 0 - 5 1 1 、朱昌青等提出的发光体为激发态的锰或锰的络合物。第二类，吕九 如5 3 1 、陈国南等提出的发光体是单线态氧的二分子复合物。 ，1 2 5 钌( i i 卜联吡啶配合物化学发光体系 钌( i i 卜联吡啶的化学发光现象最早于1 9 6 6 年被l y t l e 发现。他们在强酸和强碱的 r u ( b p y ) 3 3 + 溶液中加入芳香胺，观察到了桔红色的发光现象，并测定了其发光波长为 5 9 5 n m 。近年来，用钌( i i 卜联吡啶配合物为发光试剂测定物质的报道比较多，如测定陪 替丁【5 5 】、氧氟沙型5 6 1 、四环烈5 7 1 、海洛因【5 8 】、d n a 5 9 1 、可待因f 6 0 】、甲状腺素【6 1 】、赛洛 西宾6 2 1 、茶丹宁【6 3 】、甲酸【删等。 5 第一部分化学发光综述 1 2 6 其他化学发光体系 在酸性介质中，四价铈与高锰酸钾一样，具有很强的氧化能力，可以与多种还原性 无机物或者有机化合物发生氧化还原反应，已被应用于a 1 3 + 及许多有机化合物的化学发 光分析【6 5 _ 7 0 1 。此外，还有另外几种，如吐温8 0 【7 、钌( i i ) 邻菲咯啉等，这些发光试剂 应用不多，有待于开发研究。 1 3 化学发光分析法的应用 化学发光分析法是近3 0 年来迅速发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法，具有 仪器设备简单、操作方便、灵敏度高，线性范围宽和易于实现自动化等显著优点。另外， 新的发光试剂的合成、新体系的开发、与其它技术的联用进一步扩大了化学发光法的应 用范围，现已广泛应用于食品分析、生物分析、药物分析、环境保护检测等方面【7 7 4 1 。 1 3 1 在食品分析中的应用 民以食为天，食以安为先。食品和人类的生活密切相关。近年，在我国发生的食 品安全事件中，影响比较大的有：三聚氰胺、亚硝酸钠、苏丹红等，这些事实说明 我国的食品安全状况不容乐观。因此，建立快速灵敏的方法用于食品分析很重要。 应用于食品安全方面的快速检测技术，包括：比色法、酶联免疫法、免疫胶体金试 纸、生物传感器、便携式色谱质谱联用仪、生物化学发光检测仪等【7 5 】。这些技术， 有些还只处于定性或半定量水平，有些设备及检测费用太高，有些则需要复杂的样 品前处理过程。化学发光法具有仪器设备简单、操作方便、灵敏度高，线性范围宽 等优点，在食品质量监控、有益成分分析等方面发挥着越来越重要的作用。表l 给 出了近几年化学发光法在食品分析中的应用。 6 2 0 0 9 c o d k m n 0 4 - g l u t a r a l d e h y d e 2 0 0 9 马来酰肼 2 0 0 8 葡萄球菌 m 眦l c a r b o nn a n o t u b e s - c l - c c d 2 0 0 8 大肠杆菌l u m i n o l - h 2 0 2 - h r p 2 0 0 8 2 0 0 8 2 0 0 8 2 0 0 8 胺甲奈 灭虫威 棒曲霉素 儿茶酚 对苯二酚 儿茶酚 间苯二酚 h p l c ，l u m i n o l - k m n 0 4 o 1m g l 一1 6 0 n g m l - l 0 0 1n g m l - i 3 0 0 0 c e l lm l - 1 0 0 1m g l - 1 0 1 4 m g l - l 水样 蔬菜 豆奶 水样 7 7 7 8 7 9 8 0 蔬菜 8 1 l u m i n o l - h 2 0 2 0 0 1n gm l 一1 苹果汁8 2 l u m i n o l - h 2 0 2 - c u ( i i ) 0 1m m 茶饮料8 3 l u m i n o l - n a l 0 4 - g o l dn a n o p a r t i c l e s 2 0 0 8 二乙基一乙烯雌酚 c e r i u m ( i v ) - r h o d a m i n e6 g 2 0 0 7 亚硝酸盐l u m i n o l - k 4 f e ( c n ) 6 2 0 0 7 苏丹i l u m i n 0 1 - h 2 0 2 2 0 0 6 2 0 0 6 2 0 0 6 2 0 0 6 钴( 1 0 伏马菌素 氧氟沙星 诺氟沙星 环丙沙星 洛美沙星 盐酸克伦特罗 l u m i n o l - d i s s o l v e d o x y g e n e c l _ e l i s a h p l c ，c e ( r v ) 一r u ( b p y ) 3 2 + 一h n 0 3 l u m i n 0 1 _ h 2 0 2 2 1n g m l - 1 o 1n g m e - 1 8 3n g m e - 1 0 7 5p g m e - 1 4 n g m l - l 3 p g m e - 1 4 f g m e - 1 0 0 9n gm e - - 1 0 4 n g m l - 1 0 3 6 n g m e - 1 0 4 n g i l l r l 2 4 n g 功【l 一1 1 2 n m 自来水8 4 牛肉8 5 蔬菜、 8 6 水果 辣椒酱8 7 鸡蛋清8 8 谷类8 9 虾9 0 尿液9 l 2 。6 过氧化苯甲酰 l u m i n 。卜0 2 。4p g 札- 1 面粉9 2 m i c r o f l u i d i cc h i p “。 - 二一一 7 2 0 0 6 威百亩 l 岫。0 2 s u l f a p y r i d i n e s u l f a d i a z i n e 2 0 0 5 e s u l f a m e t h a z i n e s u l f a d o x i n e 闯苯二酚 2 0 0 5 闻苯三酚 苯酚 2 0 0 5 2 0 0 5 2 0 0 5 2 0 0 4 2 0 0 4 2 0 0 4 水杨酸 o x y t e t r a c y c l i n e t e t r a c y c l i n e m e t a c y c l i n e 乳酸 呋喃丹 脯氨酸 胺甲奈 过氧化苯甲酰 儿茶酚 卸p l c c e r i u m ( i v ) _ r h o d a m i n e 6 ( p h e n o l i c 陋y c l o d e x 蛐 l 如血o j - i g f e ( c n ) 6 l u m i n o l k m n 0 4 r u ( b p y ) 3 2 + l u m i n o i 】眦1 0 4 l u m i l l o j 0 2 5 3n g m l - i o 0 4 7 9 9 m l 一1 蔬菜 9 3 6 2n g n l l j 6 9 n gr n l - l 7 1n g1 1 1 l i 牛奶 1 3 6n g r n _ , - 1 9 5 4 0 n g m l 1 5 3n g m l - l 3 0 1n gm l i 红酒 9 6 1 8 0 n gr n l - i 一 3 0 n g 功l 】 5 0 n g m l - 1 蜂蜜 9 7 0 9n gm l 1 o 2 p m 。1 l - j 牛奶 9 8 2 0 n g m l - 1 生菜 9 9 l oj 1 m 白酒 1 0 0 4 9 n g m l - 1 蔬菜 】0 1 0 1 4 n g m l 一1 面粉 1 0 2 8 西北大学硕十学位论文 1 3 2 在生物分析方面的应用 化学发光分析方法以其方法应用的多元性和超灵敏的检测，已经广泛应用于生物技 术和分子生物学研究。包括酶活性的测定、氨基酸的测定、活性氧类物质分析、免疫检 验和单细胞免疫组织化学等。表2 列出了近年来化学发光法在生物分析方面的应用。 表2 化学发光法在生物分析方面的应用示例 9 第一部分化学发光综述 1 3 3 在生物碱分析方面的应用 生物碱是一类含氨的碱性有机化合物，在植物中分布较广，大部分都具有显著的生 理活性或者毒性。因此，生物碱的检测在疾病诊断、法医鉴定以及兴奋剂检测等方面都 具有十分重要的意义。表3 列出了近年来化学发光法在生物碱分析方面的应用。 1 0 西北大学硕士学位论文 表3 化学发光法在生物碱分析方面的应用示例 1 1 第一二部分研究报告 第二部分研究报告 2 1 流动注射化学发光法测定苹果汁中的棒曲霉素 2 1 1 鲁米诺一过氧化氢体系测定苹果汁中的棒曲霉素 2 1 1 1 前言 o 棒曲霉素( p a t u l i n ) 是由青霉属和曲霉属的真菌在腐烂的苹果中 代谢产生的，特别是扩展青霉1 3 9 _ 1 4 1 1 。由于棒曲霉素易溶于水，在 生产过程中很容易转移到苹果汁中【1 4 2 1 ，在酸性介质中具有良好的 热稳定性，因此很难通过加热的方式把它从苹果汁中除去【1 4 3 1 。有 人推测，由于棒曲霉素具有亲电性，通过与细胞内的基质( 如硫醇) 形成共价化合物，导致蛋白质失活而施展其毒性【1 似1 4 5 1 ，能够致癌、致畸形，甚至诱导 基因突变【1 徭1 4 7 1 。世界上的许多国家都已严格控制棒曲霉素在食品中的污染1 4 8 1 ，世界 卫生组织把棒曲霉素在食品中的最高含量限定为5 0p gk g - 1 。 目前，测定棒曲霉素的方法有：高效液相色谱法【1 4 9 - 1 5 4 1 ，气质联用1 5 5 - 1 5 8 1 ，薄层色 谱【1 5 9 】，胶束毛细管电色剖1 6 0 _ 1 6 3 1 ，同位素稀释、法【1 阵1 6 5 1 。化学发光法，由于其具有高的 灵敏度和效率，简单的仪器装置，低的试剂消耗，以及简单的操作程序而被广泛应用于 食品分析中。本文首次建立了化学发光法结合流动注射测定棒曲霉素的新方法。鲁米诺 一过氧化氢化学发光体系的研究很多，是非常经典的体系。研究发现，棒曲霉素能够显 著增大鲁米诺一过氧化氢化学发光体系的发光强度，发光强度的增加值与样品浓度呈良 好的线性关系，检测范围o 0 5 8 0n gm l - 1 ，检出限为o 0 1n gm r l ( 3 0 ) 。在流速为2 0m l m i n - 1 时，完成一次测定，包括进样和冲洗需2 5s ，r s d 小于4 o ( n = 5 ) 。本法已成功应 用于苹果汁中棒曲霉素的测定，回收率为9 3 4 1 0 6 9 。 1 2 西北大学硕上学位论文 2 1 1 2 实验部分 试剂 ( 1 ) 2 5 1 0 _ 2m o ll - 1l u m i n o l 储备液：称取0 4 4gl u m i n o l ( f l u k a ，b i o c h e m i k a ) ，溶解于1 0 0 m l 0 1m o ll - 1n a o h 中。 ( 2 ) o 1m o ll - 1h 2 0 2 储备液：准确移取o 2 5m l3 3 h 2 0 2 ( 分析纯) ，a n - 次去离子水定 溶于2 5m l 容量瓶中。分析液由储备液逐级稀释得到。 ( 3 ) 3 2 8m gl - 1 的棒曲霉素标准溶液由陕西省进出口检验检疫局提供，于4o c 下避光冷 藏。分析液由储备液逐级稀释后使用。 实验中使用的水均为二次水经m i l l i - q ( m i l l i p o r e ，b e d f o r d ，m a ，u s a ) 纯化后使用；所 用试剂均为分析纯。 实验装置 i f f l - d d 流动注射化学发光分析仪( 西安瑞迈电子科技有限公司，西安) ；所选泵管 均为聚四氟乙烯管p t f e ( i d 1m m ) ；u v l 7 0 0 紫外可见分光光度计( 岛津，日本) 。 实验方法 如图6 所示，共有四道平行管路。以二次去离子水为载液，启动蠕动泵，液体流速 为2 0m l m i n - 1 。待基线稳定后，通过六通阀定量注入1 0 0 此的鲁米诺和过氧化氢的混 合溶液，与氢氧化钠溶液混合于流通池中产生化学发光。发光强度用光电倍增管接收， 信号经放大后由记录仪记录化学发光强度值( 厶) 。同法当通入样品溶液后再记录发光强 度伍) 。化学发光强度增加值( 山= 厶一i o ) 与样品溶液浓度在一定范围内呈线性关系。 1 3 第二部分研究报告 l u m i n o l + h 2 0 2 c a r r i e r s a m p l e n a o h p u m p e 土习 u l v a l v e l l 图6 流动注射化学发光法测定棒曲霉素的实验装置示意图 d e t e c t o r 口 l 由 r e c o r d e r 按照g 6 k m e n 和a c 一1 5 0 】所提出的方法，量取苹果汁5m l ( 准确至o 1m e ) 置于1 2 5 m l 分液漏斗中，加入2 0 0m l 水和2 5 0m l 乙酸乙酯，振荡1m i n ，静置分层。将水层 置于另一分液漏斗，用乙酸乙酯重复提取两次( 每次用量2 5 0m e ) 。弃去水层，合并三 次乙酸乙酯提取液于原分液漏斗，并加入1 0 0m l 碳酸钠溶液( 浓度为1 4gl - 1 ) ，立即摇 荡，静置分层( 此净化操作应尽可能在2m i n 内完成) 。再用乙酸乙酯提取碳酸钠水层一 次。弃去碳酸钠水层，合并乙酸乙酯提取液。加入5 滴乙酸，全部转移至旋转蒸发仪内， 于4 0o c , - 4 5o c 下，蒸至剩余溶液1 2m l 。用乙酸乙酯将此溶液转移至5m l 棕色小瓶 内于4 0o c 下用氮气吹干。用1 0m l 乙酸盐缓冲溶液( p h _ 4 ) 溶解残留物，低温下保存、 备用。 2 1 1 3 结果和讨论 l u m i n o 卜h 2 0 2 化学发光动力学曲线 在动态条件下，对l u m i n o l - h 2 0 2 - p a t u l i n 化学发光动力学曲线进行了试验，如图 2 1 1 2 所示。l u m i n o l - h 2 0 2 化学发光体系在6s 内化学发光值达到最大，2 5s 后化学发 光值趋于零。可以看出，棒曲霉素存在时化学发光值显著增大，并与浓度成正比。 1 4 西北大学硕七学位论文 置 均 重3 5 0 口 一 23 0 0 曩 趸2 5 0 o 0 5l1 52 t i m e r a i n 图7 流动注射化学发光动力学曲线 a ：l u m i n o l - h 2 0 2 的化学发光强度 b ：l u m i n o l - h 2 0 z - p a t u l i n ( o 0 5n gm l - 1 ) 的化学发光强度 c ：l u m i n o l - h 2 0 z - p a t u l i n ( 0 1n gm l - 1 ) 的化学发光强度 d ：l u m i n o l - h 2 0 z - p a t u l i n ( 1n gm l - 1 ) 的化学发光强度 l u m i n o l 和h e 0 2 浓麦对化学发光强受的影响 本实验考察了不同浓度的鲁米诺( 1 0 x 1 0 6 - 2 5 x 1 0 5m o ll - 1 ) 和过氧化氢 ( 1 0 x 1 0 - 7 1 0 x 1 0 - - 4m o ll - 1 ) 对该化学发光反应的影响。结果表明，当鲁米诺和过氧化氢 浓度分别为1 o x l o 一5m o ll - t f f l 2 1 0 x 1 0 5m o l 1 时，化学发光强度达到最大值。因此， 1 o x l o _ 5m o ll - 1 鲁米诺和1 0 x 1 0 _ 5m o ll - 1 过氧化氢被用在该实验中。 n a o h 浓麦对化学发光强度的影响 众所周知，鲁米诺的化学发光反应是在碱性介质中进行的。试验中直接引入n a o h 溶液与鲁米诺逋氧化氢化学发光体系及样品溶液混合，使化学发光反应在适宜的p h 值 发生。实验考察了0 o l 0 2 5m o ll - 1 的n a o h 对该化学发光反应的影响。当n a o h 的浓 度为0 0 2 5m o ll - 1 时，化学发光强度达到最大值。因此选定n a o h 浓度为0 0 2 5m o ll - 1 。 流速和混合管长发对化学发光强麦的影响 实验发现发光强度随着流速的增加而增加，同时高的流速也能导致不稳定的基线会 1 5 第二部分研究报告 降低测定精度且浪费试剂，低的流速引起了峰扩展，且降低了采样频率；实验流速选取 2 0m lm i n - 1 有较高的化学发光强度值且重现性较好。实验发现，位于流通池前的混合管 长度为5c m 时体系具有较高的灵敏度和重现性，因此混合管的长度选定为5c m 。 在优化条件下，当棒曲霉素的浓度在0 0 5 8 0n gm l - 1 范围内时，化学发光的增加值 ( i = i 广i o ) 与棒曲霉素的浓度呈正比，其线性方程为：出c l = 1 1 4 , 1 , 4 铀+ 2 5 2 8 4 ，线性相 关系数( r 2 ) 为0 9 9 7 3 ，检出限为0 0 1n g m l - 1 ，在流速为2 0 m l m i n - 1 时，完成一次测定， 包括进样和洗涤需2 5s ，r s d 小于4 o ( n _ 5 ) 。 干扰实验 在优化条件下，以o 2n gm l - 1 棒曲霉素的标准溶液对外来物质以标准加入法进行 干扰实验。所允许的相对误差为m 0 时，结果表明分别对于果糖、甲醇、乙醇的最大 允许量为1 0 0 肛gm l - 1 ；对于盐酸赖氨酸的最大允许量为2 嵋m i , - 1 ；对于c r ，n 0 3 一， a c 一，r ，s 0 4 2 - ，p 0 4 ，c r 2 0 7 ，硼酸盐，苹果酸，尿素的最大允许量为1p gm l - 1 ；对 于m 9 2 + ，c a 2 + ，b a 2 + ，z n 2 + ，l - t h r e o n i n e 的最大允许量为0 0 5l - t gm l _ 1 ；对于c u 2 + ，f e 3 + ， m n 2 + 为o 5n g m l - 1 。 在0 1 、1 0 、1 0 0n gm l - 1 的不同浓度的棒曲霉素存在时，将1 0 0g t l 的鲁米诺一过氧 化氢溶液注入到该体系中，记录所产生的化学发光强度，从而达到对该流动体系的稳定 性的验证。该实验持续了6 天，且每天的使用时间是8 小时，在这期间所得到的结果被 列在表4 。从表中可以看出，r s d 小于3 ，该体系具有良好的稳定性。 1 6 西北大学硕上学位论文 表4l u m i n o l - h 2 0 2 - p a t u l i n 发光体系的稳定性实验 时f - d a y 不同浓度( n gm l - 1 ) 棒曲霉素时发光强度及r s d ( ) 0 r s do 1 r s d 1 o r s d1 0 0 r s d 时间对棒曲霉素的影响 为了解时间对棒曲霉素的影响，做如下实验：准确移取两份不等量的样品溶液至1 0 0 m l 容量瓶，分别定容至刻度，最终浓度分别为o 0 5n gm l - 1 ，0 5n gm l - 1 。室温下，每 隔一定的时间测量其化学发光的强度值及空白值，记录下化学发光强度的增加值，变化 曲线如图8 所示。化学发光强度的增加值在不断增大，5 5 小时后达到最大，随后开始下 降，并基本保持不变。可推测棒曲霉素的含量也发生了类似的变化，或者是其结构发生 了变化。因此，对棒曲霉素进行测量时应在尽可能短的时间内完成。 1 3 0 0 9 0 0 5 0 0 1 0 0 o3 06 09 0 时间m 图8 时间对棒曲霉素的影响 ：0 5n gm l - 1 ：0 0 5n gm e - 1 1 7 第二部分研究报告 温麦对棒曲霉素的影响 为了解温度对棒曲霉素的影响，做如下实验：配制一系列0 0 5n gm l - 1 及0 5n gm l - 1 的棒曲霉素样品溶液分别放置于冰水浴、1 8o c 、5 0o c 、7 0o c 、1 0 0 0 c 水浴中2h ，分别 测定放置水浴前后的化学发光值，并记录下发光强度的增加值。如图9 所示，在冰水浴 中发光强度的增加值几乎为零，随后发光强度的增加值随着温度的升高而变大，在7 0o c 时达到最大，1 0 0o c 时有略微增加。该实验结果进一步表明，棒曲霉素的热稳定性非常 强，在苹果汁产品的加工过程中，很难通过加热的方式将其除去。此外，在进行棒曲霉 素的化学发光的测定过程中，配制的棒曲霉素溶液最好放置于冰水浴中。 1 2 0 0 9 0 0 j 砉 6 0 0 3 0 0 0 o3 06 09 0 温度p c 图9 温度对棒曲霉素的影响 ：0 5n g m l _ 1 ：0 0 5n g m l - 1 应用：苹果汁样中棒曲霉素的分析。 苹果汁样品由陕西省进出口检验检疫局提供，用上述方法处理的苹果汁样品溶液及 棒曲霉素标准溶液结合标准加入法直接用本实验方法进行测定，棒曲霉素的含量列于表 5 中。测定的8 组数据，相对标准偏差小于4 o ，回收率在9 3 4 1 0 7 0 之间。 1 8 两北大学硕上学位论文 表5 苹果汁样中棒曲霉素的测定 司能的反应机理 本文通过使用紫外吸收和动态化学发光法对l u m i n o l - h 2 0 2 - p a t u l i n 的化学发光反应 机理进行了深入的研究，且结果被列在表6 。棒曲霉素的紫外检测波