（微生物学专业论文）白腐菌混合培养产漆酶及其机制和脱色效果研究.pdf

山东大学颀士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：日期：碰! 三! 竺 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密垢应遵守此规定) 论文作者签名：耄塑2 1 型导师签名：e l 期：埠 山东大学硕士学位论文 摘要 微生物混合培养或混合发酵比纯培养更快、更有效。混合培养虽然得到许多 肯定，取得了许多成果，并应用于实践，但对于混合培养体系的作用机理和相互 关系的研究甚少，以至于目前对于混合菌株对的筛选和组合还具有很大的随机 性。白腐菌是产漆酶的主要菌株，而漆酶在造纸、食品、纺织工业等方面都有比 较广泛的应用。 本实验室筛选到高产漆酶菌株杂色云芝c o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 一8 。将其种子 培养基和实验室筛选到的其他1l 株产漆酶菌株和纤维素酶菌株进行混合发酵产 酶。结果显示，第七天时l z 一8 和层孔菌w 1 混合所产漆酶是l z - 8 单独所产漆酶 的1 6 倍左右。对两种菌的接种比例和接种时间的研究表明：接种比例为l ：1 时，漆酶在第九天平均可达到最高值4 0 9 6i u m l ，分别是l z - 8 和w 1 单独培养 产漆酶的3 3 5 和4 8 4 倍。而在w 1 提前一天接种时效果最好，第九天漆酶酶活 分别是l z - 8 和w 1 单独培养的3 6 4 和4 8 7 倍。而通过平板共同培养发现：两菌 在平板上能够很好的共生。且在交接处有明显的分界线并有色素产生。对混合培 养所产的漆酶粗酶液的酶学性质研究表明：该酶的最适p h 为2 5 左右，在p h 5 0 - 9 0 的范围内，2 4 小时后酶活仍然能达到初始的8 5 左右。最适温度在5 5 ，在5 0 c 矛n6 0 条件下保温，稳定后酶活分别达到初始的5 3 和3 6 左右，7 0 和8 0 条件下，则只有初始的2 一4 。l z 一8 和w l 于5l 发酵罐中进行混合 培养产酶，结果显示仍然可以达到较高的酶活，说明该方法有一定的可行性和实 际应用的潜力。 对l z - 8 和w 1 单独培养不同天数所产酶液，分别采用不同比例进行混合，发 现直接混合的酶液并没有酶活提高的现象，说明混合培养酶活的提高并不是由于 两种酶液存在正协同作用。在培养生长的前期内，分别将l z - 8 和w 1 单独培养不 同天数的发酵液按照l ：1 混合后继续混合培养，结果显示：第3 天或第4 天混 合的发酵液，分别在混合的第2 天酶活就有很大的提升，这表明刺激酶活提高的 物质可能产生于第3 天或第4 天的发酵液中。对l z 一8 和w 1 单独培养第4 天的发 酵液进行过滤以除去菌体影响，分别加到对方第四天的含有菌体的发酵液中继续 培养。结果加入了w 1 过滤发酵液的l z - 8 培养基，在第5 天时的酶活是第4 天时 山东火学硕士学位论文 酶活的一倍多，而w 1 的培养基产酶情况没有明显变化。表明是w 1 发酵液中产生 了某种或某类物质，刺激了l z 一8 的产酶。而分别对混合培养，l z 一8 和w l 的粗 酶液进行活性染色，发现三种粗酶液显色条带有明显的不同。 将混合培养所产的漆酶粗酶液在0 5 8i u m l 的用量下对r b b r 、溴酚蓝、孔 雀绿、罗丹明b 、结晶紫和甲基橙进行脱色实验，其中以r b b r 和溴酚蓝脱色效 率最高，l 小时内脱色率就达到9 0 左右。对处理这两种染料的温度、转速和染 料浓度进行的实验表明：混合培养产生的粗酶液对这些因素并不敏感，在2 0 7 0 ，0 - 1 8 0r p m ，染料浓度2 0 0 - 6 0 0m g 1 的条件下，r b b r 和溴酚蓝的脱色率在 1 0 0m i n 内均分别达到9 6 和9 2 以上。而对处理前后的染料进行可见光扫描显 示，处理后染料的特征吸收完全消失。 关键词：混合培养，漆酶，优化，脱色率 6 山东大学硕士学位论文 a bs t r a c t m i x e dc u l t u r eo fm i c r o o r g a n i s mo rf e r m e n t a t i o ni sm o r ee f f e c t i v et h a ns i n g l e c u l t u r e m a n yr e s e a r c h e sa b o u tm i x e dc u l t u r eh a v eb e e np u b l i s h e da n du s e di n p r a c t i c e ，b u t t h es c r e e no fc o c u l t u r e f u n g i p a i ri s b l i n dd u et oi t su n c l e a r m e c h a n i s m l a c c a s ei sp r o d u c e db yw h i t e r o t ，m a i n l yu s e di np u l p i n g ，f o o da n dt e x t i l e ，a n d c o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 一8w a saf u n g u sw i t hg o o dl a c c a s ep r o d u c t i o nc a p a b i l i t y m i x e dc u l t u r ew a sc a r r i e do u tu s i n gl z 一8a n do t h e rl a c c a s e - p r o d u c t i o n _ f u n 百o r c e l l u l a s e - p r o d u c t i o n _ _ f u n g i t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl a c c a s ea c t i v i t yf r o mm i x e d c u l t u r eo fr i g i d o p o r u ss pw la n dc o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 一8w a s1 6t i m e sh i 曲e r , c o m p a r e dw i t hs i n g l e c u l t u r eo fl z - 8i nt h e7 t hd a y i n o c u l u mp r o p o r t i o na n d i n o c u l a t i o nt i m ew e r eo p t i m i z e da n ds h o w e dt h a tw h e ni n o c u l u mw a s1 ：1 ，a n d r i g i d o p o r u ss pw 1i n o c u l a t e do n ed a yb e f o r e ，t h el a c c a s ea c t i v i t yr e s e a r c h e d4 0 9 6 i u m l ，3 35t i m e sa n d4 8 4t i m e sh i g h e rt h a ns i n g l ec u l t u r eo fl a c c a s ea c t i v i t yo f c o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 8a n dr i g i d o p o r u ss pw lr e s p e c t i v e l yi nt h e9 t hd a y i n c u b a t i o n t h eo p t i m u mp ho ft h el a c c a s ei s2 5a n dl a c c a s ei ss t a b l ei nr a n g eo fp h 5 0 9 0 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s5 5 ca n dl a c c a s ea c t i v i t yi sa b o u t5 3 a n d3 6 1 w h e ni tw a ss t o r e da t5 0 a n d6 0 r e s p e c ti v e t y 1 i tw a sf o u n dt h a tt h et w of u n g ic o u l dc o c u l t u r e dw e l li nt h ep d am e d i u ma n d p r o d u c e dp i g m e n t si nt h ed i v i d i n gl i n e c r u d el a c c a s ep r o d u c e db yt h et w of u n g i u s i n gs i n g l ec u l t u r ew e r em i x e di nt h e5 t h 7 m ，9 m ，11 山d a y , l a c c a s ea c t i v i t ya s s a y s h o w e dt h a tt h e r ew a sn os y n e r g i s t i ce f f e c tb e t w e e nt h et w ol a c c a s e s t h e f e r m e n t a t i o no fs i n g l ec u l t u r eo ft h et w of u n g iw e r em i x e di nt h e3 r da n d4 1d a y , i t w a sf o u n dt h a tl a c c a s ep r o d u c t i o ni n c r e a s e dh i 豇l yi n2 4h o u r s s i n g l ec u l t u r eo ft h e t w of u n g iw e r ef i l t e r e da n da d d e di n t oc u l t u r eo fe a c ho t h e r , t h el a c c a s ea c t i v i t yw a s i m p r o v e dh i g h l yd u r i n gc u l t u r eo fc o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 一8 ，b u tl i t t l ei n f l u e n c eo n c u l t u r eo fw l ，s h o w e ds o m es u b s t a n c ew h i c hs t i m u l a t e dl a c c a s ep r o d u c t i o ne x i s t e di n l c u l t u r eo fr i g i d o p o r u ss pw 1i nt h e4 也d a y a c t i v ed y e i n go fl a c c a s ef r o m _ s i n g l e 7 山东大学硕士学位论文 c u l t u r ea n dm i x e dc u l t u r es h o w e dt h e r ew a sv i s i b l ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e s e1 a c c a s e s l a c c a s ep r o d u c e db ym i x e dc u l t u r ei n9d a yi n c u b a t i o nw e r eu s e df o rd y e l d e c 。1 。r i z a t i 。n - d e c 。1 。r i z a t i 。nw a sc a r r i e d 。u ti nc i t r a t ep h 。s p h a t eb u f f e r ( 5 0m m ，- p h 4 o ) i naf i n a lv o l u m eo f5m la n dd o s a g eo fl a c c a s ew a so 5 8i u m 1 a l lo ft h es i x d y e s ( r b b r 、b r o m o p h e n o lb l u e 、m a l a c h i t eg r e e n ，c r y s t a lv i o l e t ，m e t h y lo r a n g ea n d r h o d a m i n eb ) _ ( c o n c e n t r a t i o n ：2 0 0m 酊) c o u l db ed e c o l o r i z e db yt h el a c c a s e _ e s p e c i a l l y , o v e r9 0 o fc o l o rw a s _ d e c o l o r e di n1h f o rr b b ra n db r o m o p h e n o lb l u e e x p e r i m e n t sr e s u l t so ft h ed e c o l o r i z a t i o nc o n d i t i o n so fr b b ra n db r o m o p h e n o lb l u e s h o w e dt h e r ew a sl i t t l ed i f f e r e n c ei no 一18 0 r p m ，2 0 7 0 a n d2 0 0 - 6 0 0m e g l c o n c e n t r a t i o no fd y e s t h ea b s o r p t i o no fr b b ra n db r o m o p h e n o lb l u ea t 入m a x ( i n ) d i s a p p e a r e da f t e rl a c c a s et r e a t m e n t k e yw o r d s ：m i x e dc u l t u r e ，l a c c a s e ，o p t i m i z a t i o n ，d e c o l o r i z a t i o n ，d y e 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 微生物混合培养的研究概况 微生物是一种广泛存在的生物资源，在工业、农业、医药、食品等行业都具 有很大的应用价值。自然界中环境复杂，微生物的存在状态一般都是天然性的混 合培养，人们根据自己的所需从自然界中分离到特定的菌株从而进行纯培养。纯 培养摆脱了许多因素的干扰作用，便于对微生物的生理和遗传等特性的研究。但 是许多生化过程是单种微生物无法或只能微弱完成的，需要两种或两种以上的微 生物进行一定的协同作用。混合培养中的微生物可以互相促进对方的生长和代 谢，从而比纯培养更快、更有效 1 】。混合培养虽然得到许多肯定，取得的许多 成果也应用于实践，但对于混合培养体系的作用机理和相互关系的研究甚少，以 至于目前对于菌株对的筛选和组合还具有很大的随机性。 混合培养的应用主要表现在以下几个方面。 首先，可以通过微生物混合培养生产代谢产物。在有益代谢产物发酵生产的 研究和应用中已取得了很大成绩。维生素c 二步发酵是一典型实例。其第二步 发酵是由大菌( 氧化葡萄糖酸杆菌，g l u c o n o b a c t e r i u mo x y d a n s ) 和小菌( 巨大芽 孢杆菌，b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 混合发酵完成。大菌能单独培养，却不生产v c 前体2 酮基l 古龙酸( 2 k g a ) ，小菌能生产2 k g a 却很难单独培养，两者混 合培养后，大菌不仅可以促进小菌的生长，还能刺激其产酸能力 2 。还有多种 维生素、氨基酸、有机酸等可通过混合菌培养产生。n i c h o l a sg u r i e f f 和p a u ll a n t 在处理工业废水的过程中利用混合培养产生聚苯氧烷酸酯( p h a ) 和生物气体， 不仅在经济上节省了成本，而且对环境的污染相对也比较温和 3 。 其次，在工业污染物和纤维素的生物降解等方面，微生物混合培养也有较广 泛的应用和研究。p i c h i a hs a r a v a n a n 从污水处理厂中分离出菌株，混合培养进行 降解苯酚的实验，最高降解率达到了1 5 7m gl 。1h 。1 4 。褐色球形固氮菌( az o t o b a c t e r 印) mi g i 2 和纤维素分解菌为拟康木霉( 丁r y e h o d e r map s e a d o k o n i n g i 月j ，d 突变株m1 0 3 混合培养结果显示自生固氮菌与纤维素分解菌在混合 培养的条件下，两菌的生长及固氮菌的固氮作用均高于两种菌各自单独培养， 9 山东大学硕士学位论文 相互之间能相互利用、相互促进 5 。三种高效纤维素分解菌以不同组合和比例 混合培养，c m c 酶活和滤纸失重率均显著高于单一培养。这表明，两种不同菌株组 成的混合菌分解纤维素能力明显强于其中任何单一菌种，为今后纤维素的固态发 酵生产和混合发酵降解纤维素废弃物提供了一定的依据 6 。 在利用混合菌产酶方面，混合培养的研究也越来越广泛。其中，尤为木素降 解酶( 漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶) 和纤维素酶系的报道较多。研究 中报道的内容多在于筛选相容的菌株，然后进行不同混合条件下产酶能力的检测 7 1o 。关于其机制等方面的研究国内外没有相关报道，所以这种混合条件摸索 的过程是随机的，以至于无法达到最佳的效果。 除了以上几方面，微生物混合培养在沼气发酵、食品发酵和石油采收等领域 同样显示其优势。 针对本论文的研究目的，下面就木素降解酶及其应用进行一下概述。 1 2 漆酶( 1 a c c a s e ) 介绍 1 2 1 漆酶的结构及特性 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，也是作用最广泛，研究的最多的一种木素降 解酶。一般来说，漆酶可分为真菌漆酶和漆树漆酶两种，但是近年来，研究发现 某些细菌也能分泌胞外漆酶。但真菌是产漆酶的主要菌，目前关于漆酶的结构和 特性的研究也是多围绕真菌漆酶展开的。 真菌漆酶经常以多聚体的形式存在，单体的分子量一般介于5 0k d a 到1 0 0 k d a 之间。其中一个重要的特点就是共价连接的碳水化合物占有1 0 4 5 ，这可能 就是酶高度稳定性的原因。关于真菌漆酶的晶体结构也曾有过相关的报道 1 1 ， 1 2 。一个具有催化活性的漆酶蛋白要求四个铜原子： i 型铜原子：顺磁性，在6 1 0n m 有蓝色吸收。 i i 型铜原子：顺磁性，非蓝色? i i i 型铜原子：反磁性，在3 3 0n m 有吸收的旋转连接的铜原子对。 i 型铜原子连接着三个保守配基，分别是两个组氨酸和一个半胱氨酸，另外 一个结合位点是可变的，在细菌中为甲硫氨酸，在真菌中为亮氨酸或苯丙氨酸。 1 0 山东大学硕士学位论文 普遍认为i 型铜原子这个区域主要影响着酶的氧化潜力，也负责着调节酶活力的 机制。k u m a r 于2 0 0 3 年发表的文献中提到，将苯丙氨酸转变成甲硫氨酸导致漆 酶的氧化潜力降低 1 3 。i 型铜原子是氧化底物的位置。i i 型铜原子在可见光谱 中没有吸收，并且在电子顺磁共振( e p r ) 中显示顺磁性。i i i 型铜原子与i i 型 铜原子在空间上很接近，其共同的特征是连接有酪氨酸和血蓝蛋白，并在3 3 0n m 处有吸收值，电子顺磁共振( e p r ) 显示其具有反磁性。 图1 1 漆酶的结构 i i 型铜原子和i i i 型铜原子形成一个三核中心，而还原分子氧生成h ：o 的反 应就发生在这个区域。其中i i 型铜原子连接两个组氨酸，i i l 型铜原子连接六 个组氨酸，两个反磁性铜原子之间靠羟基连接。 1 2 2 漆酶的作用机制 漆酶的作用机理主要是多铜中心将电子从还原性底物传递给分子氧而不会 产生有毒的过氧化物中间体。具体过程为i 型铜原子通过对底物进行单电子氧 山东大学硕士学位论文 化，将电子传递给三核中心，从而还原分子氧生成水。底物的氧化可以产生活性 小分子进行非酶性的反应： 单体的横向连接：漆酶催化底物产生活性小分子，彼此相互作用形成由c _ c ，c - 叼和c _ - n 共价连接的二聚体或多聚体。在土壤中，天然存在或便宜的苯 酚类物质或芳香族胺类物质因此能够连接到有机腐质物上，在取代集团的反应 中，会伴随着一些去甲基化和脱卤反应，这可能就是漆酶在脱毒方面应用的基础 1 4 - 1 5 。在植物中，漆酶催化的苯酚类物质的连接是其脱木素过程的一部分。 聚合物的降解：漆酶可以使木素和腐质酸等自然聚合物降解 1 6 。由于位阻 现象，酶可能无法直接进入聚合体内，而是催化一些有机物( 如：藜芦醇) 和金 属离子产生活性小分子进入聚合体内破坏共价键，生成单体。因此，在生物处理 过程中，经常加入非生理性的氧化还原介体来提高漆酶的氧化性 1 7 。 芳香类物质环的断裂：漆酶在降解硝基芳香类物质和合成染料等物质中的应 用也有所报道。在降解合成染料和硝基芳香类物质方面也越来越受到关注 1 8 。 1 2 3 常用的漆酶产生菌 漆酶产生菌主要是白腐菌( w h i t e - r o tf u n g i ) 和褐腐菌( b r o w n r o tf u n g i ) 。 也有报道发现细菌培养液中也会检i i i ! i 漆酶活性 2 0 。 1 2 4 漆酶的研究及应用 在造纸领域中，漆酶在纸浆漂白中的应用是研究的焦点。烧碱法或硫酸盐法 高温蒸煮原料是传统的制浆方法，但这种传统的方法会使一部分纤维素和半纤维 素降解，影响纸浆得率，而且废液会对环境造成严重的污染。漆酶能够选择性降 解木素，不会损伤到纤维素和半纤维素，更重要的是不会产生有毒物质，并且可 以在常温、常压下进行1 2 1 。但单独使用漆酶处理纸浆会改变木素的结构，并且 会使木素小分子重新聚合，所以漆酶介体系统( l m s ) 也被越来越多的关注。它 的原理是漆酶先氧化介体，产生具有强氧化能力的物质，进而起到氧化的作用。 但介体一般比较昂贵，这限制了它的工业应用。 在纺染工业中，漆酶在染料及废水脱色方面的应用较为广泛。而根据染料的 化学结构不同，加入介体也会相应的起着不同的作用。有文献报导，野生革耳菌 1 2 山东大学硕士学位论文 所产的漆酶在没有任何介体作用的前提下，能够有效的降解蒽醌染料酸性绿2 7 ， 而在加入a b t s 作为介体的情况下，酶用量很少就能够有效降解叠氮和靛青类染 料酸性紫和靛红 2 2 。由于游离酶在处理染料以及纺织工业废水时，稳定性差， 重复利用率低，越来越多的研究关注到酶的固定化。将漆酶通过共价键连接到聚 甲基丙烯酸酯，其p h ，温度稳定性等都有所改善，重复利用1 7 次后，酶活仍能 达到原来的8 4 ，而在介体存在与否的条件下，能够有效的降解六种合成染料 2 3 。而在处理纺织工业废水时，其中含有大量的金属离子和有机成分，这对酶 处理的效果会造成一定的影响。t a h a rm e c h i c h i 考察了多种因素对漆酶处理 r b b r 效果的影响，发现f e c l 。抑制作用最大，h b t 基本无影响，芳香族物质也对 脱色起着一定的抑制作用。而漆酶抑制剂中，l - c y s 作用最明显，s d s 在1 01 1 1 m 时才有抑制作用，e d t a 完全没有任何抑制作用 2 4 。这些研究都为漆酶更好的 应用于纺织工业提供了一定基础。 由于漆酶能够作用于很多芳香类有机物，所以在环境污染的治理方面也具备 一定潜力。聚环类芳香族碳水化合物( p a h s ) 是土壤中的一类主要的污染物。 y u c h e n gw u 首次在文献中报导了用游离酶直接作用于是土壤，能够迅速的降解 土壤中的p a h s ，使土壤脱毒。最后通过检测显示酶完全失活，但土壤中的微生 物数量并未改变，表明漆酶有作为安全清洁土壤的潜力 2 5 。而目前漆酶的应用 关键在于价格昂贵，酶活产量比较低。如果在酶用量很少且保证失活率较低将大 大促进漆酶的工业化应用。j p g h o s h 在处理废水时，加入少量的p e g 后，酶用 量少了2 倍多，且失活率大大的降低，这表明漆酶有着廉价的工业应用前景 2 6 。 除了以上的一些应用，漆酶在食品工业、能源领域、食用和药用菌生产和生 物检测等方面也有广泛的应用前景 2 7 。 1 3 染料介绍 有色物质，采用适当的方法，使其他物质具有坚牢的颜色，这种有色物质称 为着色剂或称为染料。从染料着色的基质看，染料又可分为纺织品用染料、非纺 织品用染料和功能性染料。纺织品主要是指以天然县委和化学纤维经纺织而成的 织物，主要供给人们服装和装饰用布以及地毯用料等。纺织品用染料仍是染料的 主要应用领域。而非纺织用染料，主要是指应用于皮革、毛皮、纸张、橡胶、塑 山东大学硕士学位论文 料、涂料、油墨、食品、化妆品和感光材料以及石头、蜡类等行业着色用染料。 功能染料是2 0 世纪8 0 年代出现的一类新型染料，其具有一般染料的化学结构， 并在光、热、电等的作用下发生某些物理或化学的变化，从而具有某些特殊功能 或专门用途的一类化合物。功能性染料已经成为染料的一个重要的研究领域。 进入2 0 世纪9 0 年代以后，中国染料工业发展速度非常迅速。1 9 9 3 年，中 国染料产量达1 7 3 2 万吨，超过美国和德国而居世界第一位。目前，中国染料生 产产值已达1 0 6 亿人民币。染料生产量及产值增加的同时，品种也不断增多，目 前中国可生产的染料品种达1 2 0 0 多个，经常生产的品种6 0 0 多个，生产品种超 过10 0 个的有分散染料、活性染料和酸性染料 2 8 】。 而随着染料工业的迅速发展，染料对环境也造成了越来越多的伤害。国家还 颁布了许多禁用染料，如联苯胺。本文实验中所提及的六种染料：溴酚蓝、r b b r 、 孔雀绿、罗丹明b 、甲基橙和结晶紫。其中溴酚蓝和孔雀绿属于三苯甲烷类染料， r b b r 属于蒽醌类染料，罗丹明b 属于荧光类染料，甲基橙属于偶氮类染料，而 结晶紫则属于三芳甲烷染料。部分染料的结构式如下： 、n 一， n i 、n ) 结晶紫 n l 罗丹明b r b b r 1 4 8 0 3 n 覆 山东大学硕士学位论文 漆酶由于其作用机理的特异性，在染料脱色方面有着广泛的应用和深入的研 究。而对于工业上的应用中，主要集中在纺染、造纸等行业中废水的处理方面。 但是，工业废水中染料成分复杂，所以在研究漆酶在染料脱色方面的应用中，相 关也有文献报导过对多种不同染料的脱色作用，确定漆酶对多种工业用染料的降 解作用 2 9 3 0 】。也有研究尝试过加入介体，如：2 ，2 连氮9 2 ( 3 乙基苯并噻唑6 一 磺酸) 、藜芦醇、h b t ，以增加漆酶对染料的脱色范围以及脱色率 3 1 1 ，但是这些 介体相对来说都比较昂贵，这对实际应用来说有着很大的局限性。而目前相关染 料脱色的报导漆酶用量大部分集中在1 0u m l 以下，但是漆酶的产量普遍不高， 而游离酶具有很多的不稳定性和不可重复性，所以也有越来越多的研究关注于漆 酶的固定化以加强其稳定性和重复利用性 3 2 】。在某些文献中报导中提到纯酶明 显比粗酶液处理效果好 3 3 】，这可能是由于粗酶液中存在很多金属离子以及其他 的发酵产物。某些金属离子如f e 2 + 、c r 3 + 对漆酶有一定的抑制作用，而许多未知 的发酵产物也有可能对漆酶产生一定的影响。由于生物酶脱色具有一定的安全性 和有效性，所以越来越受到关注。除了对漆酶种类和漆酶处理条件方面的优化后， 也有一些研究会去探讨不同酶( 如过氧化物酶等) 对不同染料的脱色潜力 3 4 。 1 4 本研究的目的和意义 微生物培养经历了自然状态下共同生长到纯培养阶段，纯培养虽然有助于对 微生物的代谢和微生物的是生理生化方面的研究和了解，但是许多复杂的代谢活 动是单种微生物无法完成或很难完成的。自然界中存在着微生物多样性，同一个 环境中多种微生物之间存在着某种相互依存和互补的关系，所以混合培养能弥补 单种微生物代谢单一等方面的缺点，有利于更好的利用资源，从而进行有效的代 谢活动。但是长期以来人们对混合培养菌株对的筛选方面都是进行大批量的筛 选，然后进行培养条件的优化等方面。对于混合培养之间真正的作用机制了解甚 少。而国内外对于混合培养产漆酶方面的文献很少。对于其中的机制基本没有相 关的研究发表。但是对于混合培养机制的了解有助于人们了解自然界中微生物间 中可能存在的某种关系，以及在特定条件下发挥作用的关键所在，为以后混合培 养的筛选和优化等方面提供良好的理论基础。本文研究中，经过实验筛选到混合 培养有助于漆酶大幅度提高的菌株对，对其培养条件进行了优化。在机理方面也 山东大学硕士学位论文 做了一部分尝试，以期说明混合培养促进漆酶提高的原因何在。 而漆酶对于染料脱色方面的应用也越来越广泛，对于混合培养产生的漆酶粗 酶液酶活较高，在工业应用方面具有一定的潜力。选定了六种不同类的染料进行 脱色实验，并进行条件的摸索，以确定漆酶在染料脱色方面的应用潜力，为这方 面的应用提供一定的理论基础和应用参考。 1 6 山东大学硕士学位论文 第二二章混合培养菌株对的筛选及培养条件的优化 2 1 导言 微生物培养经历了自然界混合生长到纯培养的阶段，纯培养虽然有利于对微 生物代谓 途径等的了解，但代谢过程的许多作用是纯培养无法完成或很难完成 的。而且自然界中本身就是多种微生物共同生长，互相利用，互相补充的。 混合培养在发酵过程中有利于微生物间的相互协调，从而提高产物的效率或 降低培养基的要求等。因此也越来越多的被人们所关注，而在混合培养产漆酶方 面也有很多的文献报导，但大多是简单的关于菌株对筛选的报导，进一步的研究 很少。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌株培养 菌株：c o r i o l u sv e r s i c o l o rl z 一8 ，本实验室筛选保藏。 r i g i d o p o r u ss pw l ，本实验室筛选保藏。 种子培养基：2 葡萄糖+ o 5 酵母浸粉，p h 自然。 种子培养：从培养斜面上切取l c m 见方菌块2 块，切碎接于种子培养基，3 0 ，1 8 0r p m 培养四天。 产酶培养基( l ) ：土豆1 5 0 ：豆饼粉1 0 ；k 2 h p 0 4 3 ：n a i l z p 0 41 5 ：m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 ：p e g 4 0 0 03 ：n a c l0 1 ：c a c l 20 0 1 ：c u s 0 4 5 h 2 00 0 0 2 5 ：m n s 0 4 h ：0 0 0 0 0 0 5 p h 自然，3 0 0m l 三角瓶每瓶分装8 0m l 。 产酶培养：按1 0 ( “v ) 接种量接种子悬液于产酶培养基中摇床发酵培养。 p d a 培养基( g l ) ：马铃薯2 0 0 ；葡萄糖2 0 ；琼脂1 5 - 2 0 ，p h 自然。其中 马铃薯要去皮切块煮沸3 0 分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂。 2 2 2 菌株对的筛选 按1 ：1 ( v v )比例，将不同菌和l z 8 的种子接于产酶培养基，3 0 ，1 8 0r p m 培 1 7 山东大学硕士学位论文 养，第三天开始测定漆酶酶活。 2 2 3 漆酶粗酶液制备及酶活测定 发酵液经8 层纱布过滤，1 0 0 0 0r p m 离心5m i n ，上清即为粗酶液。 漆酶测定方法：3m l 反应体系，酶液2 0l l1 ，1 0m ma b t s1 0 0l al ，于p h 4 的 5 0m m 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液中，3 0 。c ，4 2 0n 1 测定3 分钟内吸光值的变化 3 5 】。 2 2 4 平板培养观察 将l z 一8 和w l 接于p d a 平板培养7 天后，取直径lc r n 的菌块，相隔2c m 接 种于同一p d a 平板上，记录观察。该部分实验参考了相关文献 3 6 】。 2 2 5 接种比例的优化 将l z 一8 和w 1 的种子按6 ：2 、5 ：3 、4 ：4 、3 ：5 、2 ：6 ( v v ) 的比例接于产酶培养基， 总接种量为1 0 ( v v ) ，装液量为8 0m l 3 0 0m l 。3 0 。c ，1 8 0r p m 条件下培养， 每天取样，测定其产酶曲线。 2 2 6 接种时间的优化 将l z - 8 和w 1 的种子按1 ：1 ( v ) 的比例，分别于培养不同天数接于产酶培养基 测定其产酶曲线。 2 2 7 混合培养碳源和氮源的优化 分别以葡萄糖、乳糖、糊精、麸皮、土豆、玉米芯粉、淀粉、蔗糖为碳源， 按优化的比例和接种时间进行产酶发酵培养，测定第七天的漆酶酶活差异。 用不同浓度的最适碳源进行产酶发酵培养，测定第七天的酶活。 分别以豆饼粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵为 氮源进行产酶发酵，测定第七天酶活。 用不同浓度的最适氮源进行产酶发酵，测定第七天酶活。 山东大学硕士学位论文 2 。2 8 发酵罐产酶 5l 发酵罐装入3l 产酶培养基，将培养好的l z - 8 和w 1 种子以1 ：1 的比 例接种于培养基中于3 0 ，2 4 0r p m 进行培养，第三天开始检测漆酶酶活。 2 2 9 主要仪器和药品 2 2 9 1 主要仪器 u v - 2 5 5 0 分光光度计( 日本岛津) ； 4 k 1 5 高速冷冻离心机( s i g m a 公司) 2 2 9 2 主要药品 2 ，2 一连氮x 2 ( 3 乙基苯并噻唑6 一磺酸) ( 简称a b t s ) ( s i g m a 公司) ； 玉米芯粉( 市场购得) ； 其他试剂皆为国产分析纯。 2 3 结果和讨论 2 3 1 混合培养促进产酶的菌株筛选 将l z 。8 与11 株实验室保存的菌株进行混合培养，测定其第三天到第七天 的漆酶酶活，以l z 8 的发酵液为对照，结果如图2 1 ，2 2 ，2 3 所示，l z 一8 和 w 1 的混合培养发酵产酶有所提高，第七天时可达到l z 8 单独产酶的1 5 倍左右。 针对其是否有继续提高酶活的可能，对l z 。8 和w l 混合培养的发酵条件进行了 优化并对其相互作用的机制进行了实验。 1 9 山东大学硕士学位论文 il z - 8 o g o 蜒 罐 目 昌 、- ， ，崾 嚣 2 0 0 34567 时间( d ) 图2 1l z 8 与四株纤维素酶产生菌混合培养漆酶产生情况 遵一随虐卜 34567 时间( d ) ! l z 一8 l 圈l z - 8 + w 1 l 豳l z 一8 l z 一6 l 目l z 8 + 3 7 0 2 l 唧l z 一8 + p c 日i 图2 2l z 一8 与四株木素降解酶产生菌混合培养漆酶产生情况 3 ll 4567 时间( d ) 5 l z 因l z 豳l z 皿i 。z 8 + z c f 8 + 1 1 4 图2 3l z 8 与三株真菌混合培养漆酶产生情况 2 0 o 8 6 4 2 0 山东大学硕士学位论文 2 3 2 菌株相互关系形态观察 将不同真菌共培养在同一平板，通过两种菌落的生长情况，可以有效指示混 合培养过程的共生性。如图2 - 4 ，l z 一8 和w 1 在平板上有较好的共生性。共培养 第三天菌丝开始接触，在接触的地方有明显的分界线。第五天开始有色素产生， 而且w l 已表现出优势，覆盖到l z 一8 的菌丝表面。第七天的时候，色素很明显( 图 2 - 5 ) ，显微镜观察显示，两者菌丝相互交错，这与文献 3 6 中结果类似。这可能 是由于在接触的地方由于相互作用，而产生一些具有氧化性的自由基，从而发生 氧化作用，使边缘的菌丝呈现出一种显色反应。至于其具体的解释和原理，还没 有相关文献确切的报导，而氧化性自由基的产生也只是一种推测。 图2 - 4w 1 和l z 8 平板共培养第三天菌落形态观察 k 习 刁 图2 5w 1 和l z - 8 平板共培养第七天菌落形态观察 妙瞵k 山东大学硕士学位论文 2 3 3 混合培养条件优化 2 3 3 1 最适混合比例 将l z 一8 和w 1 两种真菌分别培养得到的种子，以总接种量8m l ( 1 0 ，v v ) 分别以6 ：2 ，5 ：3 ，4 ：4 ，2 ：6 比例( v v ) 接种于产酶培养基中。图2 6 显示了 不同接种比例混合培养过程产漆酶情况，可以看出，两菌株相同体积( 4 ：4 ) 接 种时效果相对较好，此时培养第9 天酶活达到最大，为4 0 9 5i u m l ，分别是乙z 一8 单独培养时酶活的3 3 5 倍和w l 单独培养时的4 8 4 倍。同时，还可以看出，无 论l z - 8 和w l 是以何种比例接种到产酶培养基中发酵产酶，混合培养比单独培养 时漆酶产量都有提高，而且酶活大幅度增长开始于第四天到第五天，第四天后的 每次检测都会发现酶活比前一天有明显的提高，直到达到最大值开始下降。原因 可能是培养到第四天时，发酵液中开始产生了某种物质，能够刺激菌株的产酶， 使漆酶的酶活提高。 1234567891 0l l 图2 - 6l z 8 和w l 不同接种比例下的产酶曲线 2 3 3 2 最适混合时间 将l z - 8 和w 1 分别培养不同天数的发酵液，以1 ：1 比例进行混合培养，对 不同混合培养时间产酶情况进行研究，结果见图2 7 。l z 一8 提前接入1 天，2 天，3 天，分别标为l z 一8 ( + 1 ) ，l z 一8 ( + 2 ) ，l z 一8 ( + 3 ) ，w 1 提前接入分别标为 w l ( + 1 ) ，w l ( + 2 ) ，w l ( + 3 ) 。可以看出，w l 提前一天接入时效果较好，第9 天左右 0 o o o o o o o o 0 o o o o o o o o o 5 0 5 0 5 o 5 o 5 o 4 4 3 3 2 2 1 l - 旨j h v 蜒鞋 山东大学硕士学位论文 酶活达到最高，分别是l z - 8 单独培养产酶时的3 6 4 倍和w 1 单独培养的4 8 7 倍。而l z 一8 和w 1 同时接入时也能达到很高的酶活。l z 一8 提前接入不同天数时 的产酶情况均优于两株菌单独培养时的产酶量，而将w 1 提前3 天接入产酶培养 基，混合培养产酶与单独培养时没有明显变化。这可能是由于实验中使用的产酶 培养基是针对l z 一8 优化的 3 7 ，在产酶培养基中l z 一8 的生长产酶相对于w 1 具 有一定的优势，而w 1 提前接入可以保证两菌可以保持相同的生长趋势。但将w l 太早接入，培养基中的营养耗费太多，使l z 一8 没有足够的碳源以及无机盐保证 l i 代谢所需，影响了l z - 8 的生长产酶，从而降低了发酵液的漆酶活力。 i 但是，与图2 6 中将种子同时接入时的产酶情况不同的是，w 1 提前一天接 入的培养方法，在第4 天开始没有出现酶活大幅度上升的现象。图2 - 7 显示，w 1 提前一天接入，第4 天到第5 天的酶活增加低入w 1 和l z - 8 同时接入和w l 提前 2 天接入时的酶活增加量。但从第5 天开始，w l 提前一天接入，更有利于产生对 产酶有促进作用的物质。而产生的这种物质刚好可以在l z 一8 产酶阶段发挥到较 好的刺激作用。如果提前2 天，该物质也可以促进l z - 8 产漆酶，但由于培养基 成分消耗，又影响了l z - 8 的生长，总体而言使产漆酶能力减弱。而w 1 和l z 一8 同时接入时，由于这种起刺激作用的物质的产生需要一定的时间，因而使产酶时 间延长，如图2 - 7 表明，在第7 天后，w 1 和l z 一8 同时接入时的漆酶活力已接近 于w l 提前1 天接入时的酶活。这可能表明这种刺激作用或刺激物的产生也有一 定的持续时间，而w 1 提前一天接入可以保证这种刺激作用能够在产酶的阶段发 挥更好的作用。 5 0 0 567891 01 1 时间( d ) * l z 一8 _ 卜w 1 ( + 3 ) + l z - 8 ( + 1 ) - 1 卜w l ( + 2 ) + l z - 8 ( + 2 ) 争w 1 ( + 1 ) 卜l z - 8 ( + 3 ) 十w l 图2 7l z 8 和w l 不同接种时间下的产酶曲线 山东大学硕士学位论文 2 3 3 3 最佳碳源种类和浓度 试验中初始使用的培养基是针对l z 一8 单独培养产漆酶优化出的培养基， 由于培养基成分的不同能够有效影响菌株的生长和产酶，而混合培养的产酶可能 i l 和单独培养有差异，所以我们对混合培养时培养基碳源种类和用量进行了优化。 i 图2 8