（理论物理专业论文）rna沉默途径的动力学研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 作为最新发现的广泛存在于真核生物中的基因表达调节机制，r n a 沉默途径有 许多不同的模式，调节细胞内多种生理和发育过程，从维持基因组稳定、发育时序 调节到病毒防御等。同时，i 矾a 沉默技术作为研究基因功能的一种十分有效的工具， 在基因组功能研究、基因治疗和药物开发等方面有着巨大的潜力。对r n a 沉默途 径的动力学机制的研究，有助于深入理解途径中各相关参数和进程对沉默效应的强 度和持续时间的影响，有助于实验的设计和监控。 为了解释r n a 沉默相关实验现象，人们提出了一些对认沉默途径的数学模型。 虽然这些数学模型能解释部分实验现象，但是也存在其局限性。如沉默途径中的某 些进程的假设与后来的实验发现不相符。因此，在现有的实验结论和理论研究的基 础上，本文深入研究了单细胞水平上核心r n a 沉默途径和植物中的转录后基因沉 默途径的动力学行为。 本文首先提出了r n a 介导m r n a 降解和翻译抑制的r n a 核心沉默途径的简 化数学模型，发现s r n a 的稳定性决定基因沉默的持续时间而s r n a 与同源m r n a 的结合速率决定基因沉默的程度，介导翻译抑制的s r n a 的水平需与m r n a 水平处 在同一数量级。 其次，本文提出了植物中的转录后基因沉默途径的基本数学模型，对其进行动 力学分析发现此模型不能解释转基因诱导的基因沉默现象。因此本文在基本模型的 基础上做两种扩展，异常r n a 片段的引物放大和s 函数形式放大。扩展后的数学 模型能解释沉默现象的剂量依赖，转基因诱导的自发基因沉默和避免自我毁灭的沉 默响应等沉默现象。在延展的沉默途径中，当转基因片段数处在某一中间值域时， 沉默途径的存在使得删5 斟a 水平随时振荡。 关键词：鼬蛆沉默途径，转录后基因沉默，转基因沉默，数学模型，动力学 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s a b s t r a c t a san e wd i s c o v e r e dg e n er e g u l a t i o nm e c h a n i s m ，r n as i l e n c i n gp a t h w a ye x i s t si ha w i d ev a d e t yo fe u k a r y o t i co r g 觚i s m s t h e r ea r ed i v e r s ep a t t e m so f 剐n as i l e n c i n g p a t h w a yw h i c hr e g u l a t e sv 撕o u sd e v e l o p m e n t a la i l dp h y s i 0 1 0 百c a lp r o c e s s e ss u c ha s m a i n t a i n i n gm eg e n o m es t a b i l i 啊d e v e l o p m e n t a lt i m i n g ，v i l l l sd e f e n s e 锄ds o o n m e a n w h i l e ，a sa 1 1e m c i e n te x p 嘶m e n t a lt 0 0 1f o rg e n e 缸l c t i o n ，砌呵as i l e n c i n gh a s e n o m o u s p o t e n t i a i i t y i nt h ef i e l do fm n c t i o n a l g e n o m i c s ，g e n et h e r a p y ，d r u g d e v e l o p m e n ta 1 1 ds oo n r e s e a u r c l l i n go nm ed y l l a m i cm e c h a n i s mo fr n as i l e n c i n g p a t h w a yi sh e l p m l t ou n d e r s t a l l dt h ei m p a c t so fp a r a m e t e r sa n dp r o c e s s e so nt h ee a e c t a 1 1 dd u r a t i o no fg e n es i l e n c i n ga n d p l a na n dm o n i t o rt h e r e a le x p 函m e n t s s e v e r a lm a t h e m a t i c a lm o d e l sh a v eb e e np r o p o s e dt o e x p l a i nm ee x p e r i m e n t a l p h e n o m e n ao fr n as i l e n c i n g a l m o u g ht h e s em o d e l sa r er e l a t i v e l ys u c c e s s 如l ，t h e yh a v e 1 i m i t a t i o n s s o m eh y p o t h e s i so fp r o c e s s e si n v 0 1 v e di ni 矾as i l e n c i n gp a t l l w a yo ft h e s e m o d e l sa r ei nc o n n i c tw i t hn e _ w e x p e 矗【1 1 e n t a l o b s e r v a t i o n s b a s e do nt h el a t e s t e x p e d m e n t a lr e s u l t sa 1 1 dm e o r e t i c a lr e s e a f c h ，w ei n v e s t i g a t et h ek i n e t i cb e h a v i o ro ft h e c o r ep a c h w a yo fr n a s i l e n c i n ga n dp l a n tp o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n gi ns i n 9 1 ec e l l l e v e l f i r s t l y s i m p l i f i e dm a c h e m a t i c a lm o d e l so ft h ec o r ep a t h w a yo fr n as i l e n c i n g p a m w a yi nw m c hr n a m e d i a t e sm r n a sc l e a v a g ea 1 1 dt r a l l s l a t i o nr e p r e s s i o ni sp r o p o s e d ni sf o u n dm a tm es t a b i l i t yo fs r n asi m p a c t so nt h ed u r a t i o no fg e n es i l e n c i n ga n dt h e r a t eo ft h eb a i l d i n go fs i r n a st o 越a si m p a c t so nt h ee 位c to fg e n es i i e n c i n g t 1 1 e s i i 斟a sd o s a g en e e d e di nt h er n as i l e n c i n gp a t h w a yi nw h i c hs r n a sm e d i a t e t r a n s l a t i o n r 印r e s s i o n i n u s t lb ei i l廿l es a m eo r d e ro fm a 嘶t u d ew i mm 耻蛆s c o n c e n t r a t i o n s e c o n d l y ，b a s i cm a t h e m a t i c a lm o d e lo fp l a n tp o s t t r a l l s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g p a t h w a yi sp r o p o s e d ，t h ed y n a m i c so fi ti sa n a l y s i s e d ，i tc a n n o te x p l a i nt 1 7 a n s g e n ei n d u c e d s i l e n c i n g s ot w oe x t e n s i o n sa r ea d d e dt ot 1 1 eb a s i cm o d e l ，p r i m e da m p l i f i c a t i o no f g a i b a g er n a p i e c e sa n du n p r i m e d 刮m p l i f i c a t i o nb yas i 缪n o i d 羽= 1 1 p l i f i c a t i o n t h e e x t e n d e dm o d e l sp r o v i d ee x p l a n a t i o n sf o rd o s ed 印e n d e n td s r n ai n d u c e ds i l e n c i n g ， t r a n s g e n ei n d u c e ds i l e n c i n ga n ds t a b i l i t ya g a i n s ts e l f d i r e c t e dr e s p o n s e w h e nt h e n u m b e ro ft r a n s g e n ec o p i e si sw i m i nc e i r t a mv a l u er a n g e ，t 1 1 ec o n c e n t r a t i o no fm r n a o s c i l l a t e sb e c a u s eo ft h ee x i s t e n c eo fi 斟as i l e n c i n g k e yw o r d s ： r n a s i l e n c i i l gp a t h w a y ；p o s t t r a i l s c 邱t i o n a lg e n es i l e n c i l l g ；t r a n s g e n e s i l e n c i n g ；m a t h e m a t i c a lm o d e l ；虹n e t i c s l l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 日期：翮年厂月朋 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：张 日期：声曙年y 月刀日 导师签名：，够唿 日期：彬妒砌伽日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童途塞堡变后溢卮! 旦圭生；旺生；旦三生筮查! 作者签名：切垆 日期：卿g 年厂月加日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章引言弟一早i 百 分子生物学，细胞生物学和神经生物学被认为是当代生物学研究的三大主题， 分子生物学的发展推动了细胞生物学和神经生物学的发展。基因表达调控研究作为 分子生物学的研究内容之一，是现代分子生物学的研究重点和热点。二十世纪九十 年代末发现的r n a 介导的基因沉默作为一种全新的基因表达调控机制，迅速成为 分子生物学研究的最新前沿和热点课题。对模式生物如粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r a c r a s s a ) 1 ，2 ，拟兰芥( 缸a b i d o p s i st h a l i a n a ) 3 ，4 】，秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i s e l e g a l l s ) 【5 】，果蝇( d r o s o 1 am e l m o g a s t e r ) 6 ，小鼠( m i c e ) 7 等生物体中r n a 沉默 途径的彼此独立的大量实验和理论研究正逐步揭示出这一基因调节机制的具体信 息。 1 1r n a 沉默途径的实验研究进展 f i r e 和m e l l o 等人在线虫中的实验确证了引入双链r n a ( d o u b l es t r a n d e dr n a s ) 较之顺义和反义砌姒更有效促进细胞中同源基因的蛋白质水平下降。因此d s r n a s 是基于i 斟a 的基因调控途径的触发物 8 】。此报告开启了生物科学家对天然调控小 对峪分子和r n a 调控体系的研究。随后，h a m i l t o n 和b a u l c o m b e 在分析植物中的 转基因诱导的转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默时，探测到与目标m r n a 互补 的2 5 n t 的反义r n a 的存在 9 ；h 猢o n 小组在果蝇细胞的r n a 沉默效应中也发现 了类似的2 5 n t 的r n a 分子 1 0 。这些小的砒忪分子被命名为s i r n a s ( s m a n i n t e f 甜n g 鼢妣s ) ，s i r n a s 被认为是基因沉默的效应分子。h a l l i l o n 等人对免疫纯化 r n a s e i i i 蛋白下的d s r n a 含量测定显示，一个r n a s e i i i 基因介导了r n 加的触发活 性。这个基因被命名为d i c e r - 1 ，对应的蛋白质被命名为d c i e r ，d i c e r 将长的d s 砌临 酶解为2 5 n t 的小砌姚片段 1 1 。至此，基因沉默途径中的第一步骤沉默触发 阶段浮出水面，长的d s r n a 经d c i e r 酶解得到2 5 n t 左右的s i 】心队s 。t u s c h l 等人在 果蝇细胞液中发现d s r n a 诱导的基因沉默是通过对目标m r n a 的降解实现的 1 2 】； 而h 锄o n 小组的实验则指出果蝇细胞液中存在着特异性降解d s 砌蛆同源转录产物 的核酸酶，且此核酸酶中包含有2 5 n t 的砌蛆分子 1 0 。这两个独立的研究证实了 鼢n 沉默由一个序列特异性核酸酶复合物实现的假设 8 】。此复合物被称为鼬忪诱 导的沉默复合物( i 斟ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，砌s c ) ，是按效果命名的。至此， 基因沉默途径的第二个步骤沉默效应阶段的轮廓也清晰地显现，s i r n a 整合到 s c 中，结合到同源m r n a 上并导致瑚r n a 的降解。包含第一步骤和第二步骤的 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 基因沉默途径广泛地存在于几乎所有的真核生物中，因此被称之为核心r n a 沉默 途径。在线虫和植物中引入少量的d s r n a ，导致同源基因的表达水平大幅度降低， 沉默现象持续较长时间，且从注入d s r n a 的细胞中扩散到临近细胞中 3 ，5 ；暗示 着线虫和植物中存在着i 矾a 依赖的r n a 聚合酶( r n a d 印e n d e mi 斟ap o l y m e r a s e ， r d r p ) 对沉默的触发物和或效应分子的合成机制。对r n a 沉默缺陷株的遗传筛选 证实r d r p 是r n a 沉默途径所需要的基因之一 1 3 ，1 4 】。m a l 【e y e v 和b 锄f o r d 等人 的研究报告则确切地指出粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 中的重组蛋白q d e 一1 具 有r n a 聚合酶活性，能以单链i n a 分子为模版合成双链r n a 分子 1 5 】。由r d i 心 介导的以单链砌妊分子为模版合成长短不同的双链r n a 分子的进程为基因沉默途 径的第三个步骤沉默信号分子的倍增阶段。真菌、植物和线虫中包含此进程， 而果蝇和老鼠中暂时还没有发现r m o 同源物。关于基因沉默途径中沉默信号分子 的倍增机制，最新的实验结果如下。p a l ( 和f i r e 与s i j e n 小组的两个独立的研究显 示，线虫中的s i 砌妊分子分为两类，一类是之前已经被确定的5 端单磷酸基的双链 s i i n a 分子，而另一类则是由r d i 心合成的5 端三磷酸基的单链的反义r n a 分子 1 6 ，1 7 。a 1 e x 等人对拟兰芥中的s i 对蛆对应的基因序列进行分析发现，绝大多数 s i 砒临对应于含有两个已知m i c r o r n a ，s i r n a 互补位点的基因的互补位点之间的序 列。在此基础上，他们提出，高表达水平的m r n a 被连续两次的随机剪切，得到的 片段作为r m 固的模版合成d s r n a 1 8 】。 t u s c l l l 等人在2 0 0 1 年首次实现了在哺乳动物细胞中，如人体胚胎肾细胞和h e l a 细胞中，2 i n t 的s i 砌姒特异性抑制内源基因和外源基因表达 1 9 】。p a s q u i n e l l i 和 r u v h m 等人则在2 0 0 2 年首次发现线虫细胞中存在一种调节发育转变的小r n a 分 子( s m a l lt e m p o r a lr n a s ，s t r n a s ) 2 0 。研究发现m i c r 0 砒叮a 介导的基因沉默途径和 s i r n a 介导的基因沉默途径有很多相似之处。 1 2r n a 沉默途径的动力学研究进展 在理论研究方面，近年来，人们开始提出一些r n a 沉默途径的动力学模型，试 图从理论上阐明r n a 沉默机制，研究机制中各种参数对沉默效应的具体影响。这些 研究工作依据沉默途径中是否含有r ( 1 r p 的放大效应，分为两个部分： 不含有r d i 冲的核心的r n a 沉默途径的研究如下：r a a b 和s t 印h a l l 叩o u l o s 利用荧 光成像技术研究了老鼠肝细胞瘤细胞中s i r n a 诱导的基因沉默现象，实验显示，不 同初始计量的s i r n a 和转染时间导致不同的沉默效应，而沉默效应在m r n a 水平和 蛋白质水平的体现是不同的。在实验的基础上提出了一个砌怆沉默途径的动力学方 程，从理论上探讨可能有助于在更复杂的沉默实验中关键参数的选择方法；还提出 2 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s 了一个数学方程组来描述r n a 沉默在两个相互联系的基因网络中的作用 2 1 。 b 耐1 e t t 和d a v i s 用荧光成像技术研究了老鼠细胞和活体的s i r n a 诱导的基因沉默现 象，提出s i r n a 从细胞外输运到细胞内触发r n a 沉默途径的全过程的一个动力学方 程，讨论各种可控因素( 如使用剂量，目标m r n a 半寿命，目标蛋白半寿命，细胞 分裂周期) 对砌姒沉默效应的影响。他们发现在试管和活体中，快速分裂的细胞中 沉默大约能维持一个星期而在非分裂细胞中沉默能维持到长达三个星期，细胞分裂 引起的s i r n a 的稀释是在快速分裂的细胞中决定荧光蛋白基因敲除持续时间的主要 控制因素。在分裂很慢的细胞中，使用的s i r n a 剂量的不同，将使得基因沉默的程 度和持续时间不同；如果细胞中目标蛋白相对稳定，则较小的沉默效应和较短的持 续时间不会对细胞的生命活动产生影响 2 2 。m a l p h e t t e s 和f u s s e n e g g e r 在实验的基础 上提出了哺乳动物细胞中的s i r n a 介导的基因沉默动力学方程组，研究了s i r n a 转 录时间对目标基因转录和目标瑚r n a 翻译的影响，模拟了s i i 矾a 诱导的m r n a 降解 速率。与已有实验结果一致，数学模拟显示，相互作用的s i 心a s m r n a s 的相对浓 度和转录产物上s i r n a 特异性结合位点的数目调节着靶m r n a 的降解速率，m r n a 的稳定水平，和删 斟a 编码蛋白质的动力学过程 2 3 。 r m 心对沉默信号的倍增进程的r n a 沉默途径的研究如下：b e r g s 仰m 等人提出 了一个含r d r p 的r n a 沉默途径的数学模型，指出r d r p 的单向放大进程可能解释实 验中发现的r n a 沉默效应对d s r n a 初始剂量的依赖，从而给内源基因提供了一个安 全机制，应对偶然发生的指向自身基因，给细胞带来毁灭效应的沉默响应【2 4 。 g r o e n e n b o o m 等人提出了一个鼢队沉默的核心动力学模型和包含有模版放大和非模 版放大的动力学模型，并在此基础上提出了三个扩展：加入s i r n a 降解酶、基于异 常r n a 片段的模版放大和非模版放。数学模型结果显示，没有放大效应的核心动力 学模型只有瞬时沉默效应，而含有放大效应的模型在放大效应较小时，也只有瞬时 沉默效应，在放大效应较强时，只有持久沉默效应，但无论有没有放大效应，都得 不到在实验中观察到的转基因沉默现象。三个扩展数学模型都能在某种程度上同时 显示出沉默现象的剂量依赖和转基因沉默现象。作者给出了不同类型的沉默现象的 一致解释，并指出不同物种沉默现象的差异性 2 5 。 还有一些科学家将i 矾a 沉默途径整合到其它生化途径中，研究r n a 沉默在系 统中的作用。其中，觚i e r o 、j a c l ( s o n 和飚r s c l l e r 提出了一个数学模型来描述肿瘤 的生长，免疫逃避，和s i 砌叮a 治疗效应。模型结果显示s i r n a 的连续注入能有效地将 迅速蔓延的肿瘤细胞转化为沉寂的停止扩散的细胞，消除了扩散肿瘤逃避免疫系统 的能力 2 6 】。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 3 本文的内容安排 本文的具体内容安排如下：第二章为砌妊沉默途径的基本介绍，包括真核基 因的基因表达调控基础知识，r n a 沉默途径的研究简史，r n a 途径的分子机制； 第三章主要介绍已有的对妊沉默途径的动力学模型，包括如何给出生化反应的数 学描述，各种生物体中如老鼠中的核心鼬忪沉默途径的数学模型和涉及到信号倍 增阶段的砌姒沉默途径的数学模型。 第四章是本文的核心内容。本文分别研究了细胞水平上介导m r n a 降解和介导 m r n a 翻译抑制的核心r n a 沉默途径动力学，发现在介导m r n a 降解的核心途径 中，小r n a 分子的稳定性越好，沉默强度和沉默持续时间越长；而介导翻译抑制 的内源或连续引入的小r n a 分子的表达水平需要与m r n a 表达水平相当，才能有 效介导基因沉默。在最新的实验研究的基础上，本文还提出了植物中的转录后基因 沉默途径的动力学基本方程，研究其动力学，发现无法解释转基因沉默现象；随后 在基本模型中加入两个延展。对延展模型进行动力学分析发现，两个模型都能解释 沉默效应的剂量依赖、转基因诱导的基因沉默和细胞中不会产生毁灭自身的沉默响 应；且由于沉默途径的存在，当m r n a 转录水平较高时，m r n a 的表达水平随时 振荡。 第五章则是总结和展望。 4 硕士学位论文 m a s t e r st 1 1 e s i s 第二章r n a 沉默途径 r n a 沉默途径将细胞中存在的较长的砒妊分子，特别是双链r n a 分子，转 化为长度约为2 1 2 5 n t 的双链小r n a 信号分子。这些小r n a 分子引导蛋白质效应 复合体指向序列同源的1 1 1 】埘a ，抑制其转录、翻译或者催化其降解，从而导致同源 基因无法表达为蛋白质 2 7 。 r n a 沉默作为一种基因表达调节机制，广泛存在于真核生物中；调节细胞内多 种生理和发育过程，从维持基因组稳定 2 8 、发育调节 2 9 到病毒防御 3 0 等。同时 r n a 沉默技术作为研究基因功能的一种十分有效的工具，在基因组功能研究 3 l 】、 基因治疗 3 2 、药物开发【3 3 等方面有着巨大的潜力。 2 1 真核基因表达调控的一般规律 3 4 ，3 5 众所周知，蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，是生物生命活动的 体现者；而所有生物的遗传信息，都是以基因的形式储藏在细胞内的脱氧核糖核酸 d n a ( 或核糖核酸r n a ) 分子中。决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸( 主 要是脱氧核糖核酸) 分子编码，表现为特定的核苷酸序列。随着个体的发育，承载 着遗传信息的d n a 分子，有序地通过密码子反密码子系统转录形成相应的信使 r n a ( m r n a ) ，再翻译为蛋白质分子，执行各种生理生化功能，完成生命的全过 程。科学家把这个从d n a 到蛋白质的过程称为基因表达( g e n ee x p r e s s i o n ) ，对这个 过程的调节就称为基因表达调控( g e n er e g u l a t i o n 或g e n ec o n 臼- 0 1 ) 。基因表达调控是 现阶段分子生物学研究的中心课题。 细胞中所利用的大多数基本调控机制一般执行如下规律：一个体系在需要时被 打开，不需要时被关闭。这种“开一关”( o n o 行) 活性一般是通过调节转录来建立 的，也就是说m r n a 的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“o 伍 状态时，也可能有本底水平的基本表达，常常是每世代每个细胞只合成1 或2 个 m r n a 分子和极少量的蛋白质分子。即“o 行这个术语的实际意思是，基因表达量 特别低，很难甚至无法被观测到。 真核生物有细胞核结构，染色质( d n a 与蛋白质的结合体) 被包裹在细胞核内， 基因的转录发生在核内，翻译( 蛋白质合成) 则发生在核膜外的细胞质中，转录和翻 译过程在空间和时间上都被分隔开来，加上真核基因有插入序列，结构基因被分隔 成不同的片段，因此真核细胞基因调控是多级调控系统，主要发生在三个彼此相对 独立的水平上：( 1 ) 转录水平的调控( t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ) ，决定某个基因是否 硕士学位论文 m 人s t e r st i i e s i s 会被转录，并决定转录的频率：( 2 ) 加工水平的调控( r n ap r o c e s s i n g ) ，决定初始 m r n a 转录物被加工成能翻译成为多肽的信使r n a ( m r n a ) 的途径；( 3 ) 翻译水平 的调控( t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n ) ，决定某种m r n a 是否会真正得到翻译，如果能得到 翻译，还决定翻译的频率和时间长短。 图2 1 ：遗传信息传递过程简图。左图为普适不总图，右图为真核细胞中基因表达不恿图。 2 。2r n a 沉默途径 2 2 1r n a 沉默途径的发现过程 在二十世纪五十年代初d n a 双螺旋结构学说提出后，很长一段时间内，人们 认为r n a 只是遗传信息从d n a 到蛋白质传递过程的中介；在基因表达调控体系中， 介导基因表达调控的是各种蛋白质。 1 9 8 4 年，m i z u n o 等人在大肠杆菌中发现了一类小分子r n a ( 长度为1 0 0 3 0 0 个核苷酸) 通过与特定m r n a 的部分序列反向互补配对从而调节m r n a 的翻译水 平。这种小分子r n a 与目标m r n a ( 通常称为正义链) 反向互补，因此被称为反 义r n a 。这是首次发现r n a 具有基因表达调控功能。由反义r n a 引发的基因不 被表达的现象称为反义沉默 3 6 。 1 9 9 0 年，j o r g e n s e n 的研究小组在矮牵牛花( p e t u n i a ) 中导入与花青素合成有关的 查耳酮酶( c h s a ) 的基因，想要得到更纯的紫色花，结果这些转基因矮牵牛花出现了 杂色甚至是白色的花。实验发现，基因的转录水平并没有降低，但是胞质内c h s a m r n a 缺失 3 7 。此种转基因片段的表达或者病毒的转染在细胞中被抑制，而细胞 内存在的与转基因片段或病毒同源的内源基因也被沉默的现象被称之为共抑制 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s ( c o s u p p r e s s i o n ) ，因为基因沉默发生在转录后阶段，因此也被称之为转录后基因沉 默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 。 1 9 9 5 年g u o 和k e w p h u e s 试图用反义核糖核酸来阻断p a r 1 基因的表达以研究 其功能。确证反义核糖核酸抑制了基因表达，出乎意料的是用作阴性对照的正义核 糖核酸也抑制了基因表达【3 8 。 1 9 9 6 年，c o g o n i 等人试图用一种名为粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 的真菌 大规模制造橙红色素时( 此真菌含有一个基因a l l 能指导合成橙红色素) ，发现转基 因真菌a 1 1 基因被稳定抑制并显示出白化显型。实验证实，在所有发生基因沉默的 真菌中，未剪切的a l l1 1 1 刚a 前体浓度水平与野生型真菌相同，但是成熟的a l lm r n a 被大量降解【3 9 。这种现象被称为消除( q u e l l i n g ) 。 1 9 9 8 年2 月，f i r e 和m e l l o 等人在n a m r e 杂志上发表了名为秀丽隐杆线 虫中由双链r n a 触发的高效特异性遗传干扰( p o t e n ta 1 1 ds p e c i f i cg e n e t i c i n t e r f e r e n c eb yd o u b l e s t r 孤d e dr n a i n 国p ，z d 砌口6 西出p ，唧珊) 的文章。他们在进行 线虫的基因表达沉默的研究中，分别注射了肌丝蛋白的正义，反义和双链砌悄，结 果双链对临比之任何一条单链都更有效地得到基因沉默现象，明确指出了双链 r n a 是基因沉默的触发物。沉默效应在被注射的线虫和他们的子代中都很明显 8 】。 这种在细胞中引入外源d s r n a 使某一功能基因沉默的方法被称为r n a 干扰( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 。这一发现对于从理论上理解砒叮a 介导的基因沉默途径非常重 要，同时对于实验上研究和利用此途径具有十分重要的意义，导致了天然调控小 砒妊分子和砌呛调控体系的发现，刷新了人们对于基因信息流动的调控机制的认 识，开启了基因组功能研究的新局面。f i r e 和m e l l o 也因此而获得2 0 0 6 年n o b e l 生理或医学奖。 1 9 9 9 年，h a m i l t o n 和b a u l c o m b e 分析了植物中的转基因诱导的p t g s 和病毒诱 导的p t g s ，探测到与目标m r n a 互补的2 5 n t 的反义i 斟a 的存在 9 】。2 0 0 0 年， h a n n o n 小组在果蝇细胞的r n a 沉默系统中也发现了类似的2 5 n t 的r n a 分子 1 0 】。 这些小的r n a 分子被命名为s i 砌叮a ( s m a l l i n t e f e r i n gr n a ) 。 2 0 0 1 年，t u s c h l 等人首次实现了在哺乳动物细胞中，如人体胚胎肾细胞和h e l a 细胞中，2 i n t 的s i r n a 介导的内源基因和外源基因沉默 1 9 。 2 0 0 1 年，h a i l n o n 等人对免疫纯化r n a s e i i i 蛋白下的d s r n a 含量测定显示一个 i 斟2 l s e i i i 基因介导了砌蛆i 的触发活性。这个基因被命名为d i c e r - l 。对应的蛋白质 被命名为d c i e r ，d i c e r 将长的d s r n a 酶解为2 5 核苷的小r n a 片段【1 1 。 1 9 9 8 年f i r e 等人在线虫中的r n a 沉默途径的开创性研究中就预测细胞内存在 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 一个序列特异性核酸酶复合物 8 。关于此复合物的活性研究则是两个独立的研究小 组在果蝇细胞液上所做的工作。第一份研究报告由t u s c h l 等人在1 9 9 9 年发表，报 告中指出在果蝇细胞液中d s r n a 能诱导基因沉默，基因沉默是通过目标m r n a 的 降解实现的 1 2 。第二份报告由h a 玎n o n 小组在2 0 0 0 年发表，指出存在着特异性降 解d s r n a 同源转录产物的核酸酶活性反应的存在，且此核酸酶中包含有2 5 n t 的 对峪分子 1 0 】。这些报告证实了r n a 沉默由一个序列特异性核酸酶复合物实现的 假设。此复合物被称为黔淡诱导的沉默复合物( 鼬暇i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ， s c ) ，是按效果命名的。 在顺义转基因相关的r n a 沉默的早期实验研究中，人们假设细胞内基因沉默 的序列特异性是通过r n a 依赖的r n a 聚合酶( i 斟a d 印e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ， r d i 心) 将目标m r n a 拷贝成互补的r n a 片段实现的 4 0 。线虫和植物中r n a 沉 默令人吃惊的效用程度，扩散和持续时间则暗示存在着r d r p 对诱导m 叭信号分 子的倍增机制。对砌临沉默缺陷株的遗传筛选证实r d i 心是r n a 沉默途径所需要 的基因之一 1 3 ，1 4 。m a k e y e v 和b 锄f o r d2 0 0 2 年的研究报告则确切地指出粗糙脉孢 菌( n e u r o s p o r ac r 2 l s s a ) 中的重组蛋白q d e 1 具有r n a 聚合酶活性，能以单链r n a 分子为模版合成双链r n a 【1 5 。 2 0 0 2 年p a s q u i n e l l i 和r u v k u n 等人首次发现细胞中存在一类m i c r 0 r n k 线虫 中调节发育转变的一种时序调节小r n a 分子( s m a l lt e m p o r a l 鼢认s ，s t r n a s ) 。在线 虫四个不同的幼虫期，细胞系有完全不同的特性。1 i n 4 缺陷株中断了幼虫发育的时 序调控，使得细胞发育滞留在第一幼虫期。相反的发育现象如细胞系提前进入第二 幼虫期则出现在l i n 1 4 的线虫缺陷株中。l i n 4 编码2 2 n t 的非编码砌叮a ，此l 心渔分 子序列与l i n 1 4 基因的3 端非翻译区的7 个保守位点部分互补，l i n - 4 的r n a 绑定 到l i n 一1 4 编码的砌她的3 端非翻译区上，抑制其翻译为蛋白质。在第一幼虫期l i n - 1 4 编码的核蛋白水平的下调触发细胞系进入第二幼虫期的发育进程 2 0 。 砌峪沉默途径的研究在不同生物体中的不同机制和某一机制的具体细节及参 与沉默途径的各蛋白质复合体的结构和功能上继续着。 对于不同生物的彼此独立的研究，汇聚为r n a 沉默途径的共同范例。这个范 例的组成部分为：( 1 ) 沉默诱导物为d s r n a ，( 2 ) 以同源依赖的方式锁定目标m r n a ， ( 3 ) 在不同生物的对临沉默途径中所需要的蛋白质有着相似的结构和功能 2 8 】。 2 2 2 真核生物中r n a 沉默途径的分子机制 很多因素都可能触发砌妊沉默途径，但所有沉默途径在初始阶段有个共同点 就是双链或含双链结构的i 斟a 的存在。一个简化了的r n a 核心沉默途径可以分为 硕士学位论文 m 人s t e r st h e s i s 两步：第一步为基因沉默的触发阶段，含双链结构域的信号r n a 分子被r n a s e 酶酶解为小的双链r n a 分子。第二步为基因沉默的效应阶段，小的双链r n a 分子 结合到鼬妊诱导的沉默复合物上，在蛋白质复合体组装过程中，小r n a 分子解旋 为单链，通过碱基互补配对与同源d n a 或m r n a 结合，使转录停止、目标1 1 1 刚a 被降解或翻译过程被抑制，从而同源基因无法表达为蛋白质而被沉默。有的生物体 如真菌、植物和线虫中的r n a 沉默途径还有第三步，基因沉默信号的倍增阶段， 即r n a 依赖的r n a 聚合酶( r d r p ) 介导的二级信号砌呵a 分子的合成，此进程的存 在使得少量初级d s r n a s i r n a 能诱发强烈的持久的基因沉默现象。 d s r n a 的合成1 4 1 4 2 l r n a 沉默途径的触发物中研究得最为透彻的是双链r n a ( d s 对姒) ，能在细胞内 由内源基因的双向转录、反转重复序列或“发夹序列的转录、重叠转录抄本和病 毒感染过程中以r n a 为模版的r n a 聚合酶合成；也可以通过注射、浸泡、喂食含 有d s 砌蛆表达基因的质粒而引入细胞中，从而触发r n a 沉默途径。 s 谂斟a 的成熟1 3 4 2 。4 3 。4 4 1 不同来源和结构的双链或含双链结构的r n a 分子由不同的加工途径被酶解为 更短的具有双链结构的效应分子，由内源基因转录的带有环状结构的转录抄本最后 生成m i c r o m 叮a ，而长的双链d s r n a 分子被酶解的成熟产物是s i 砒怕。在r n a 干 扰实验中所使用的小m 临分子，不管其来源如何，一般被称之为s i r n a s 。内源的 s i 砌悄分子又可以分为至少三种不同的子集：t 啪s a c t i n gs i r n a s ( t a l s i r n a s ) 、 r e p e a t a s s o c i a t e ds i r n a s ( r a s i r n a s ) 和s m a l ls c a nr n a s ( s c l l i 之n a s ) 。 d s 鼬町a 经d i c e r 酶解得到长度为2 1 2 5 n t 的，5 端磷酸化，3 有2 n t 尾巴的双链 s i 对叮a 。得到最多赞同的s i 砌怕合成模型如下：d c i e r 中的两个r n a s e i i i 域结合成 一种伪二聚体的形式，得到一个活性位点。每个r n a s e i 域切割双链中的一条单链， 生成一个新的终端。2 n to v e r h a i l g 来自于二聚体中单体相对的定位，而2 n t 的长度则 是终端绑定n 坦域和活性位点之间的距离。不同的物种中，d c i e r 执行的d s 砌妊到 s i r n a 的酶解过程对a t p 的需求不同。 d i c e r 是一个高度保守的蛋白质，大小约为2 0 0 k d a ，在几乎所有的真核生物中 都存在。d i c e r 包含一个很长的n 端片段，一个d u f 2 8 3 域，一个p a z ( p i 谢a 曜o n a u t e z w i l l e ) 域，两个串联的r n a s e 域，和一个双链i 矾a 绑定域。 其中，p a z 域识别和连接3 端2 核苷尾巴的d s r n a ，i 斟a s e i 域则酶解d s r n a 为 2 1 2 5 n t 的小双链r n a ，d c i e r 中其它域的作用则还未知。果蝇中d i c e r 对d s r n a 的酶解需要a t p ，人的细胞中没有观察到d i c e r 的酶解作用对a t p 的需求。 9 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s 很多生物体拥有超过一个d i c e r 基因，不同的d i c e r 加工不同来源的d s i 矾a