（临床检验诊断学专业论文）微流控免疫芯片在病原菌快速检测中的研究.pdf

目录 i r l l i l 1 i j l i j i l lr f l f r l l r f l f f l l f l l r l f l l l l l l 1 l l l l y 18 0 2 0 4 3 英文缩写一览表l 英文摘要3 中文摘要6 论文正文微流控免疫芯片在病原菌快速检测中的研究 自 占8月u舀 第一部分基于微流控的病原菌检测p d m s 玻璃芯片的构建l o 材料与方法11 结果1 5 讨论1 7 ，j 、结l8 第二部分微流控免疫芯片捕获富集病原菌的实验研究1 9 第一节微流控芯片免疫富集腔捕获细菌的定性鉴定2 0 材料与方法2 0 结果2 2 讨论2 5 第二节微流控芯片免疫富集腔捕获效率定量测定2 7 材料与方法2 8 结果2 9 讨论3 2 ，j 、结3 4 第三部分微流控芯片中e c o l i0 1 5 7 ：h 7 生物发光检测的研究3 5 第一节微流控芯片生物发光检测条件优化3 5 材料与方法3 7 结果3 9 讨论4 4 第二节微流控芯片生物发光检测定量分析4 5 材料与方法4 6 结果4 8 讨论5 3 小结5 4 全文总结5 6 致谢5 9 参考文献6 0 文献综述微流控芯片技术在微生物检测中的应用6 6 参考文献7 7 在读期间发表的文章8 2 第二军医人学硕十学何论文 英文缩写英文名称 p d m s e l i s a p c r m e m s c e a t p e c o l i p e b p s s a m a o a p t e s n h s e d c m e s b s a p b s h g m c s c f u p m t c c d r l u s a m p h u s r s d 英文缩写一览表 p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e 中文名称 聚二甲基硅氧烷 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附剂测定 p o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e e s c h e r i c h i ac o l i p o s te x p o s u r eb a k e p o l y s t y r e n e s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r a c r i d i n eo r a n g e 聚合酶链式反应 微机电加工技术 毛细管电泳 三磷酸腺苷 大肠埃希菌 曝光后烘 聚苯乙烯 自组装单分子层 吖啶橙 3 一a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e 3 - 氨丙基三乙氧基硅烷 n - h y d r o x y s u c c i n i m i d en 烃基磺基琥珀酰亚胺 1 - e t h y l 3 - 【3 d i m e t h y l a m i n o p r o p y l c a r b 碳二亚胺盐酸盐 o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e 2 一( n m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d 2 - ( n 吗啡啉) 乙磺酸 s o d i u ms a l t b o v i n es e r u ma l b u m i n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 牛血清白蛋白 磷酸盐缓冲液 h i g h g r a d i e n tm a g n e t i cc o n c e n t r a t o r s微型高梯度磁场集中器 c o l o n yf o r m i n eu n i t p h o t o m u l t i p l i e rt u b e c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e r e l a t i v el i g h tu n i t s a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e h e m o l y t i cu r e m i cs y n d r o m e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n 菌落形成单位 光电倍增管 电荷耦合元件 相对发光强度 一磷酸腺苷 溶血性尿毒综合征 相对标准偏差 p c m s e n t e r i t i d i s s t y p h i m i r i u m l m o n o c y t o g e n e s l i f 第三军医大学硕七学位论文 p l a t ec u l t i v a t i o nm e t h o d s a l m o n e l l ae n t e r i t i d i s s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s l a s e ri n d u c e d n u o r e s c e n c e 2 平板培养计数法 肠炎沙门菌 鼠伤寒沙门菌 单增李斯特菌 激光诱导荧光 第二军医人学硕十学何论文 r e s e a r c ho nt h em i c r o f l u i d i cc h i pu s e di nt h eq u i c k d e t e c t i o no fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m ab s t r a c t d e t e c t i o no fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nm a i n t a i n i n g t h ep u b l i ch e a l t ha n dr e s e a r c h e so nt h ed e t e c t i o np r o t o c o lo fp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s mh a s s u s t a i n e dc o n t i n u o u sd e v e l o p m e n t d e t e c t i o nm e t h o d sa tp r e s e n th a v es o m ed i s a d v a n t a g e s ， s u c ha sl o n gt i m eo fi n s p e c t i o n ，c o m p l e x i t yo fo p e r a t i o n ，l o ws e n s i t i v i t y ，e a s yt r e n do fe r r o r ， n e e d so fh i g h l ye x p e n s i v ee q u i p m e n to rw e l l t r a i n e dt e c h n i c i a n s m o r e o v e r , a l lt h ea n a l y s i s m u s tb ef i n i s h e di nl a b s ，w h i c hm e a n st h ei m p o s s i b i l i t yo ff i e l di n s p e c t i o no ns a m p l e s m i c r o f l u i d i cc h i p ，an o v e la n a l y t i c a lt e c h n o l o g y , h a sb e e nd e v e l o p e dq u i c k l yd u r i n g t h e s ey e a r sd u et oi t sa d v a n t a g e so fm i c r os t r u c t u r e ，i n t e g r a t i o n o ff u n c t i o n ，l o w c o n s u m p t i o no fs a m p l e sa n dr e a g e n t s ，h i g h f l u xo u t p u t ，s h o r tt i m eo fa n a l y z i n g ，a u t o m a t i o n a n dp o r t a b i l i t y i ti sa ni d e a lp l a t f o r mf o rp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s md e t e c t i o nb e c a u s et h e c h a r a c t e r i z a t i o na n dc o u n t i n go fm i c r o o r g a n i s mc a nb ef i n i s h e ds i m u l t a n e o u s l y ，t h ew h o l e 第二军医大学硕十学位论文 i n t e g r a t i o n u s i n gm i c r o b e a do fn a n o m e t e rt om i c r o m e t e ra ss o l i dp h a s eb e a r e rp o s s e s s e s t h em e r i t so fn o to n l yi n c r e a s i n gs p e c i f i cs u r f a c eo fa n t i g e na n t i b o d yr e a c t i o n ，b u ta l s o b e i n ge a s yt of i l la n ds u p e r s e d e b e c a u s eo ft h em e r i to fh i g hs e n s i t i v i t yw i t h o u t l u m i n a i r e ， c o m p l i c a t e do p t i c a lp a t h so rm a r k i n gt h em i c r o o r g a n i s m ，q u a n t i t a t i n gm i c r o o r g a n i s mb y b i o l u m i n e s c e n ta s s a yo fa t p f i r e f l yl u c i f e r i n - - l u c i f e r a s es y s t e mc a no b t a i nt h ei n f o r m a t i o n o ft h en u m b e ra n da c t i v i t yo fm i c r o o r g a n i s m ，w h i c hi sa ni d e a lm e t h o df o ri n s p e c t i o nb a s e d o nm i c r o f l u i d i cc h i p h e r e i n ，t a k i n g e c o l io15 7 ：h 7a st h ed e t e c t i o nt a r g e t ，h i g h s p e c i f i c i t ya n d h i g h - c a p t u r e r a t ei m m u n e m i c r o b e a dc h a m b e rh a sb e e ni n t e g r a t e di n t oc h i p sm i c r o c h a n n e l ， o n l i n e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s f o rm i c r o o r g a n i s me n r i c h e dh a sb e e nc a r r i e do u tb ya t p b i o l u m i n e s c e n c e ， a n dt h e q u i c ki n s p e c t i o n s y s t e m i n t e g r a t i n g h i g h s p e c i f i c i t y c a p t u r e e n r i c h i n ga n dh i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t i o nh a sb e e ns e ta c c o r d i n g l y f i r s t l y , e n r i c h i n gc h a m b e rh a sb e e nd e s i g n e df o r t h ef i l l i n go fi m m u n e m i c r o b e a d ，a n d n u m e r i c a ls i m u l a t i o n so ff l o wf i e l d si nd i f f e r e n tm i c r o c h a n n e l sh a v eb e e n d o n eb y a n a s y ss o f t w a r e a c c o r d i n gt ot h er e s u l t ，h e x a g o nh a sb e e nc h o s e na st h es t r u c t u r ef o r i m m u n ee n r i c h i n gc h a m b e r t h e n ，b ys u r f a c es i l a n i z a t i o n o fm i c r o b e a do f5 0 i _ t ma n dc o v a l e n tl i n k a g ew i t h a n t i - e c o l io 15 7 ：h 7p o l y c l o n a la n t i b o d y ，b i o - f u n c t i o n a l i z a t i o no fm i c r o b e a dh a sb e e n c o m p l e t e d f i l l i n g t h em i c r o b e a d si n t o h e x a g o nc h a m b e ra n dl e t t i n g t h e mi nt h e a r r a n g e m e n to fm o n o l a y e ra n du n i f o r m i t y ，t h ee n r i c h i n gc h a m b e rh a sb e e nf o r m e d b y o b s e r v i n gt h ec a p t u r eo fe c o l io 15 7 ：h 7s t a i n e db ya oi nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，i th a s b e e np r o v e dt h a ti m m u n ee n r i c h i n gc h a m b e rc a l l c a p t u r e e n r i c h b a c t e r i a e f f e c t i v e l y c a p t u r er a t eh a sb e e ne v a l u a t e db yp l a t ec u l t u r em e t h o d t h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no f p a r a m e t e r so fs a m p l ei n j e c t i o na n dw a s h i n g ，t h er e a l b a c t e r i ac a p t u r er a t eo fi m m u n e e n r i c h i n gc h a m b e rf o r m e db yt h ew a y o ff i l l i n gi m m u n em i c r o b e a dh a sr e a c h e d91 7 5 9 5 6 2 f i n a l l y , b i o l u m i n e s c e n c ei n s p e c t i o n o ft h eb a c t e r i ac a p t u r e di nt h ec h i ph a sb e e n f i n i s h e dt h r o u g ha t p f i r e f l yl u c i f e r i n - - l u c i f e r a s es y s t e ma n du l t r aw e a kc h e m i l u m i n e s c e n c e a n a l y z e r ，a n dc o n d i t i o n so fl u m i n a t i o n r e a c t i o ni nt h ec h i ph a v eb e e no p t i m i z e d t h e m e t h o do fq u a n t i t a t i n gb a c t e r i ab yt h el u m i n o u si n t e n s i t yo fr e a c t i o ni ss e tu pt h r o u g ht h e d r a w i n go fs t a n d a r dc u r v eo fb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o n i u m i n a t i o ni n t e n s i t y i th a s b e e n 4 第二军医人学硕十学何论文 p r o v e dt h a tt h ea c c u r a c yr a t i n g ，s e n s i t i v i t ya n dd e g r e eo fp r e c i s i o na r eh i g ha n ds t a b i l i t y g o o da c c o r d i n gt o t h ee v a l u a t i o no ft h em e t h o d sl i n e a rr a n g e ，d e t e c t a b i l i t y ，c o n f i d e n c e ， r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y t h es t u d yo f t h ec h i p sp e r f o r m a n c ep r o v e st h eh i g h s p e c i f i c i t yo ft h i sm i c r o b i o l o g i c a ld e t e c t i o ns y s t e ma n dt h a tt h es y s t e mc a nb eu s e dt o q u a n t i t a t ee c o l io 15 7 ：h 7i nt h ep o r ks a m p l e sa c c u r a t e l y f r o mt h ea b o v e m e n t i o n e d ，t h ee s t a b l i s h m e n to fm i c r o o r g a n i s mq u i c ki n s p e c t i o n s y s t e m w i t hh i g hs p e c i f i c i t ya n dh i g h s e n s i t i v i t yh a sp r o v i d e d ap l a t f o r mf o r t h e d e v e l o p m e n to ft h es y s t e mf o rt h eh i g h l y s e n s i t i v es p o tq u i c ki n s p e c t i o nf o rp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m k e y w o r d s ：p a t h o g e n s ，e c o l io15 7 ：h 7 ，r a p i dd e t e c t i o n ，m i c r o f l u i d i c c h i p ， i m m u n o s e p a r a t i o n ，m i c r o b e a d s ，a t p b i o l u m i n e s c e n c e 5 第二军医大学硕十学位论文 微流控免疫芯片在病原菌快速检测中的研究 摘要 病原菌的常规检测包括非选择性和选择性培养、生化反应和血清学鉴定等步骤， 其操作繁琐，周期长( 5 7 d ) ，费时费力，不能满足当代社会对环境、食品安全监督和 传染性疾病快速诊断的需要。近年来，随着生物技术的发展而建立起来的快速检测技 术( 如免疫分析技术、p c r 技术等) 虽然能够在较短时l 日j 内鉴定病原菌，但仍存在如灵 敏度较低、假阳性和假阴性率高、操作复杂、成本昂贵等缺陷，因此发展能够准确、 敏感、快速地检测病原菌的技术方法刻不容缓。 微流控芯片作为新出现的微分析技术平台，以其结构缩微化、功能集成化、样品 和试剂耗量低、高通量输出、分析时间短、易于便携和自动化等优势，近年来在微生 物检测中的发展非常迅速。但现有的微流控芯片微生物检测的研究主要是针对微生物 研究中的某一单元或步骤，如富集分选、预处理或分离检测展开的，缺乏集样品处理、 稀少样本富集分选和检测于一体的整合技术或方法，整个研究也处于起步阶段。而如 何将病原菌检测各个环节的操作过程集成于一张微流控芯片上，并形成自动化的病原 菌检测系统，是当今微流控芯片用于病原菌检测所面临的挑战。 鉴于当今社会对病原菌快速检测的要求和现有检测技术的缺陷，本研究构建了一 个微流控免疫分析芯片，在芯片上丌展了病原菌的分选富集和生物发光检测研究。微 流控芯片免疫分选技术具有抗体和试剂耗量低、反应速度快、易于集成和实现自动化 的优势：而以具有纳米至微米级尺寸粒径的微珠作为抗体的固相载体，不但可以增大 抗原抗体反应的比表面积，而且其易于填充和更换的特点可以使芯片各单元功能更加 分明，另外芯片构型简单、价格低廉，易于构建和普及。利用a t p 萤火虫荧光素虫 荧光素酶体系的生物发光分析对微生物进行定量，可因光子产生率高而达到极高的灵 敏度，不需光源和复杂的光路，也无需对微生物进行标记，即可得到微生物数量和活 性的信息，是可集成于微流控芯片上的理想检测方法。 因此，本研究以e c o l i0 1 5 7 ：h 7 为检测目标，将针对该细菌的高特异性和高捕 获率的免疫微珠富集腔设计于芯片微通道中，并采用a t p 生物发光体系对富集到的细 菌进行在线定量分析，建立了集高特异性捕获富集和高灵敏度检测为一体的病原菌快 速检测法。 研究首先根据实验目的，设计p d m s 玻璃微流控芯片的微通道构型和尺寸，芯片 6 第二军医人学硕+ 学何论文 包括流体传输、免疫捕获和发光检测三个功能性区域。通过模塑法完成了芯片的制作， 并对制作工艺和封接方式进行了优化。 其次，通过对粒径为5 0 9 m 的玻璃微珠表面进行硅烷化处理和抗e c o l i0 1 5 7 ：h 7 多克隆抗体的共价连接，完成了玻璃微珠的生物功能化修饰。将玻璃微珠填充于芯片 微通道的六边形腔内，通过探索微珠传输流速和方式，构建了一个呈单层均匀排列的 芯片免疫微珠富集腔。并在荧光显微镜下观察经吖啶橙染色的e c o l i0 1 5 7 ：h 7 在芯 片内的捕获，进而验证了免疫富集腔能够有效捕获富集到细菌。利用平板培养计数法 评价了芯片免疫富集腔的捕获效率，通过对芯片进样和冲洗的参数的优化，使填充有 免疫玻璃微珠的免疫富集腔对细菌样品的实际捕获率达到9 1 7 5 - - 9 5 6 2 。 最后，通过a t p 一萤火虫荧光素虫荧光素酶体系和微弱发光检测仪实现了对芯片 内捕获到的细菌的生物发光检测，并对芯片内发光反应的各种条件进行了优化。通过 细菌浓度一发光强度回归方程的拟合，建立了用生物发光反应的发光强度对细菌进行 定量的方法。对方法的线性范围、可靠性、重现性、稳定性和特异性进行评价，证明 了该微流控芯片病原菌检测系统特异性高，并能对猪肉样品中的e c o l i0 1 5 7 ：h 7 进 行准确定量。 综上所述，本研究建立了一个特异性好、准确度高的微流控芯片病原菌快速检测 菌检测过程控制在2 0 m i n 以内，为进一步开展病原菌 了囔实的基础。 5 7 ：h 7 ，快速检测，微流控芯片，免疫分选，微珠， 7 第三军医大学硕十学位论文 微流控免疫芯片在病原菌快速检测中的研究 j l l _ 月i j看 病原菌是可以侵犯人体、引起感染甚至传染性疾病的一类细菌，尤其是毒力强的 强致病菌，具有致病量低、致病力强、易大量繁殖和污染途径多等流行病学特征，容 易通过污染食物、水源和环境引起传染性疾病，并在人群中传播、扩散，长期以来一 直是人类社会健康安全的潜在威胁。因此，对其进行快速、准确、灵敏的检测为有效 控制传染性疾病的扩散、维护公众健康安全具有至关重要的作用。 目前，常规的病原菌检测方法主要有培养法、免疫学检测法和分子生物学法。其 中传统的细菌培养法和生化鉴定法简单、直观、费用低，能够准确获知样品中细菌数 量和特性，被认为是“会标准”而常用作对照方法。但该法特异性低、耗时费力、对培 养环境和操作人员要求严格，不适宜病原菌的快速诊断【l ，2 j 。免疫学检测方法利用抗 原一抗体的识别和结合，较培养法更加特异和快速，是一种可以定性和定量的综合技 术，常用方法包括酶联免疫吸附试验( e l i s a ) t 3 4 j 、化学发光免疫分析法【5 】、免疫胶体 金技术【6 。8 1 等，检测限通常为1 0 3 1 0 5 c f u m l ，但对于低细菌数量的样品往往需要富集 或增菌过程【9 l 。聚合酶链反应( p c r ) 及其相关技术具有高度的特异性和灵敏度，应用已 极为广泛【l o ，但方法过度敏感，致使假阳性率高；另一方面，用r t - p c r 检测低含 量样品时，若m r n a 转录水平低或样本中存在抑制性物质也可导致p c r 敏感性降低， 造成假阴性结果；并且p c r 扩增也同时会对检测中的错误起到放大作用，从而降低方 法的准确性和特异性。 相对于现有检测技术的缺陷，2 0 世纪9 0 年代初期出现的微流控芯片技术以其高 度的集成化、微型化、分析手段的多样化、分析速度快、准确度高等特点，在技术上 呈现出独特的优势，适合致病菌快速检测的多项要求。微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p ) 又称芯片实验室( 1 a b o i lac h i p ) ，是把化学和生物学等领域中所涉及的样品制备、反应、 分离、检测等基本操作单元集成到一块几或几十平方厘米的芯片上，由微通道形成网 络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种高 新技术平台【1 2 1 。其突出优势有以下几点：首先，微流控芯片系统具有多种操作单元灵 活组合、整体可控和规模集成的特点，可将整个病原菌的样品处理和检测分析过程整 合在一块芯片上；第二，通过m e m s 加工，可以很容易地在芯片上刻蚀密集的分析 通道阵列，大大增加了分析通量，并且芯片每一通道之问均相互独立，避免了样本的 8 第二军医人学硕十学何论文 交叉干扰，分离分析过程完全在一个相对密闭的通道中进行，降低了操作者被感染的 危险性。第三，鉴于芯片微通道的结构( 微升级或纳升级) ，微尺度下的高比表面积， 流体传质、传热快，有效地降低了样品和试剂的消耗量，大大缩短整个分析时间，达 到快速分析的目的。因此，利用微流控芯片进行病原菌的研究越来越受到人们的重视， 国内外科学家已经开始利用该技术针对细菌的预处理【1 3 , 1 4 j 、细菌的富集分选1 5 以0 1 以及 细菌和毒素的检测1 6 , 2 1 , 2 2 等进行了探索性的研究。例如，利用微流控芯片微通道的构 型对细菌颗粒的机械阻滞，b a o 2 0 l 等以排列在微通道中的微珠阵列完成了对e c o l i 0 1 5 7 ：h 7 等细菌的富集和在线电溶菌，并用激光诱导荧光技术检测溶菌产物的自体 荧光，所测得荧光强度与细菌数量有良好的线性关系，是一种无需标记、简单快速的 细菌定量技术。b e y o r 2 3 】等用微流控芯片免疫磁分选技术对e c o l i 进行富集，再用离线 的p c r 和毛细管电泳( c e ) 进行检测，可达到7 0 的捕获率和2 c f u m l 。1 的检出限。从 现有的研究来看，微流控芯片技术的发展和应用为病原菌的检测研究提供了新的方法 和思路，但主要是针对病原菌研究中的某一单元或步骤，如细菌富集分选、细菌的预 处理或分离检测展丌的，缺乏整体技术，且整个研究处于起步阶段。 因此，本研究拟利用微流控芯片技术线性尺寸小、物理量梯度高、比表面积大等 特点，结合免疫亲和原理，以肠出血型大肠埃希菌e c o l i0 1 5 7 ：h 7 为研究对象，建 立一个高效、敏感、特异的可同时进行细菌捕获富集和定量分析的微流控芯片检测方 法，将高效率的免疫分选技术和高灵敏度的生物发光检测法整合于一块微芯片上；同 时考察该检测方法的影响因素，确定其在e c o l i0 1 5 7 ：h 7 检测的线性范围、可靠性、 重现性、稳定性和特异性等基本参数，以期在病原菌的检测中得到准确的定性及定量 鉴定结果，同时也为病原菌的检测和相关感染性疾病的临床诊断提供一种与传统检测 方法完全不同的新检测方法和思路。 本研究主要包括三部分内容： 第一部分：设计微流控芯片的构型和尺寸，使其可以实现芯片上病原菌的捕获 富集和在线生物发光定量检测。选择具有生物相容性的高分子复合材料按照设计构型 制作微流控芯片，并在芯片中构建具有高捕获效率的免疫富集腔。 第二部分：研究微流控免疫芯片对病原菌的捕获富集效率，为提高该方法检测病 原菌的准确度、灵敏度和分析速度奠定实验基础。 第三部分：建立微流控芯片病原菌生物发光检测法，优化生物发光检测条件；对 芯片性能进行评价，包括准确度、重现性、稳定性和特异性实验；并运用所构建的芯 片系统和建立的分析方法，针对食品样品进行了应用性的初步研究。 9 第三军医人学硕十学位论文 第一部分基于微流控的病原菌检测p d m s 玻璃芯片的构建 微流控芯片由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，可将细菌检测的各项 操作过程整合于一块芯片上。因此，本研究拟将病原菌的捕获富集和检测技术应用于 具有高度集成化、微缩化和高反应效率等优点的微流控芯片上，从而建立一种新型的 病原菌快速检测方法。 目前，已有研究分别实现了芯片上细菌的捕获富集和定量检测。在捕获富集方 面，研究者利用芯片微通道中的微坝等特殊结构对细菌形成机械阻滞作用【l9 】；或是在 芯片内施加非均一电场，利用介电电泳力实现对细菌的富集【2 4 0 5 j ；还有研究将免疫分 选技术整合于芯片中实现病原菌的特异性筛选 2 8 2 9 1 。前两种方法选择性低，难以特异 性地分选出目标病原菌，而且芯片结构较为复杂、加工难度大：而免疫分选技术不但 特异性高、富集速度快，并且所需芯片结构简单、无需特殊设备，另外该方法技术成 熟、操作简单、易于在微流控芯片上实现。在细菌检测方面，高灵敏的荧光技术或激 光诱导荧光检测方法的仪器结构复杂、体积庞大、成本高昂，难以微缩集成于微流控 芯片上；电化学检测器以体积微小的电极作为信号探测器，易装配于微流控芯片中， 但细菌的电化学检测响应速度慢1 2 6 , 2 7 ，重现性差；而利用病原菌自身内含的a t p 化学 发光检测，灵敏度高、检测范围宽、反应迅速、设备构架简单，易于集成至微流控芯 片上，并可以通过a t p 的含量反映病原菌的活性。因此，本研究拟将基于微珠的免疫 分选技术和化学发光分析整合于微流控芯片上，实现病原菌的在线捕获，富集和定量检 测，并依此对芯片构型进行设计。该芯片包括三个功能模块：第一，用以进行样品及 试剂传输的流体传输通道；第二，对目标病原菌进行特异性捕获的免疫富集腔；第三， 用于发光信号采集的发光检测区域。整个检测过程通过微通道内的液流传输，分步实 现目标病原菌的捕获富集、裂解和发光检测。 微流控芯片构建的基础首先是芯片的选材和制作，为了使制作的芯片性能良好， 具有较强的实用性，本研究拟采用聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ，p d m s ) 为材 料，通过模塑法制作成型。p d m s 又称硅橡胶，属于高分子聚合物，其突出的优势在 于：透光性好，能透过2 5 0 n m 以上的紫外与可见光；耐用，有一定的化学惰性：无毒， 具有良好的生物相容性：能可逆和重复变形而不发生永久性破坏：价格低廉，适合于 大批量制作一次性微流控芯片；用其所制得的芯片微通道表面可进行多种改性修饰； 制得芯片不仅能与自身可逆结合，还能与玻璃、硅、二氧化硅和氧化性多聚物可逆结 合。模塑法制作芯片的流程如图l 所示，采用光刻和蚀刻的方法制造出微通道凸突的 1 0 第二军医人学硕十学位论文 阳模，并在阳模上浇注液态的高分子聚合物，在一定温度下固化后使高分子材料从阳 模上剥离，可制得带有微通道的芯片盖片，与玻璃等材质制得的基片封接后，即可制 成成型的芯片。本部分研究将探讨制作过程中p d m s 用量、芯片封接方式等因素对芯 片性能如芯片厚度、光洁度、粘合性、密封性和亲水性的影响，从而能够以快速简便 的制作方法制得重现性高、微通道密封良好、易于实现流体操控、有良好的生物相容 性的微流控芯片。 萋塞一蒸_ 曩一u 凳v p 蓉e b _ 量一盏一萎一聋一翌一蓥 图1 芯片制作基本流程 材料与方法 一材料与仪器 1 主要试剂 18 4s i l i c o n ee l a s t o m e rk i t ( 美国d o wc o m i n g 公司) ； 单组分室温硫化硅橡胶( 四川自贡中昊晨光化工研究院) ； 二甲基二氯硅烷( 化学纯，上海远帆助剂厂) ； 一次性使用静脉输液针( 0 4 5 1 5 ，上海康来企业发展集团有限公司) ； p i r a n h a 清洗液：h 2 s 0 4 ( 9 8 ) ：h 2 0 2 ( 3 0 ) = 3 ：1 ； 丙酮( 分析纯，成都市科龙化工试剂厂) ； 无水乙醇( 分析纯，重庆j i i 东化工有限公司) 。 2 主要仪器设备 z f 2 型三用紫外仪( 上海市安亭电子仪器厂) ； s i m p l i c i t y 水纯化系统( 美国m i l l i p o r e 公司) ； c q 5 0 型超声波清洗器( 上海洁净超声波设备厂) ； d z f 3 型真空干燥箱( 上海恒温设备厂) ； t s 6 0 型注射泵( 保定兰格恒流泵有限公司) ； s u 8 芯片模板( 中国科学院大连化物所) 。 第二军医大学硕七学位论文 二实验方法 1 芯片结构的设计 设计聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 玻璃复合芯片的结构如图2 ，整个芯片系统分为3 个区域：流体传输区域，包括2 个储液池( a 、b ) 分别位于芯片的两端( a 为玻珠、样 品和发光试剂入口，b 为废液池) ，a 和b 的直径分别为1 5 m m 和3 m m ；以及微通道 位于芯片中央( a 为入口通道，c 为出口通道) ，通道a 宽2 0 0 1 t m 、深7 0 9 m 、长l c m ， 通道c 宽2 0 0 9 m ，深3 0 9 m ，长1 8 c m 。免疫富集腔( b ) ，为微通道中央的六边形微腔， 腔体全长7 m m 、宽3 m m 、深7 0 9 m ，富集腔两边三角形部分的孔径角为7 0 。；腔内填 充有经抗体修饰的玻璃微珠，微珠粒径为5 0 i t m ，略小于腔体深度，使其在微腔内呈 单层排列；发光检测区域，为通道c 或储液池b 。 在此基础上构建了基于微流控免疫芯片的病原菌检测系统( 图3 ) 。该系统以注射泵 为微流体控制装置，采用b p c l 一2 一k g c 微弱发光测量仪和工作站对生物发光信号进行 采集、放大和分析。 1 2 第二军医人学硕十学何论文 n n n n o n d j t 图2 芯片构犁图 a ：入口储液池：b ：出口储液池： a ：入口通道：b ：免疫富集腔：c ：出口通道 ii ；敌粼分析 a 弩采蜒 图3 微流控芯片病原凶检测系统 2 p d m s 玻璃复合芯片的制作 2 1s u 8 胶模具的制作 用c a d 软件绘制芯片构型图案，用光学图形发生器将图案转移到以镀铬玻璃板 上制成光刻掩模；再将玻璃基片用p i r a n h a 清洗液煮沸清洗1 5 m i n ，用去离子水冲洗数 遍后，氮气吹干；然后在玻璃基片上甩一层几十g m 厚的s u 一8 光刻负胶，并通过前 烘将s u 8 光刻胶中的溶剂挥发：接下来在光刻机上利用掩模对固化后的s u 8 负胶进 第三军医大学硕士学位论文 行曝光；最后，经过p e b ( p o s te x p o s u r eb a k e ，曝光后烘) 烘焙，用s u 8 负胶显影液显 影，留下来的s u 一8 胶图案即为模具，该模具可以反复使用。 2 2 模塑法制作p d m s 盖片 2 2 1 模板的硅烷化处理 将模板置于直径为7 c m 的平皿中，另取一洁净烧杯，在其中加入2 3 m l 二甲基 二氯硅烷，将上述平皿和烧杯同时放入玻璃干燥器中，密封1 5 m i n 。此过程中挥发的 二甲基二氯硅烷沉降于s u 一8 模板表面使其硅烷化。 2 2 2p d m s 预聚物的固化 按照模板的面积【6 c m 3 c m ( 长宽) 】、所需芯片厚度( 1 m m ) 和p d m s 密度 ( o 8 2 0 8 9 m l 。1 ) ，计算p d m s 用量为1 4 8 9 。以1 0 ：1 比例称取1 4 7 2 6 9p d m s 基质和 0 1 5 2 l g 固化液于一次性塑料杯中，用玻棒顺同一方向搅动