（营养与食品卫生学专业论文）苹果渣中水溶性多糖的提取及其性质研究.pdf

甘肃农业大学2 0 0 9 届硕 ：学位论文 摘要 1 本研究以水为提取剂从苹果渣中分离得到苹果多糖，通过二次回归正交 旋转组合设计筛选出最优提取工艺为：温度8 4 ，时间4 1 h ，料水比1 ：5 2 ，在 此工艺条件下苹果多糖提取率为1 4 9 4 ，各因子对苹果多糖提取率作用的大小 依次为：温度 时间 料液比。 2 通过正交试验得到超声波辅助提取的较优工艺条件为：功率18 0 w ，温 度为7 0 ，时间1 2 0 m i n ，料液比1 ：3 0 。在试验范围内各因子对苹果多糖提取率 作用的大小依次为：温度 功率 料液比 时间。 3 通过苹果多糖醇沉工艺研究，确定苹果多糖的沉淀条件为浓缩4 倍，乙 醇添加量为4 倍。浸提次数的增加对多糖得率的提高影响不大，考虑到效率和经 济性，确定浸提一次即可。 。 4 通过s e v a g e 法、t c a 法和s e v a g e + t c a 法对苹果多糖进行脱蛋白研究， 结果显示：s e v a g e + t c a 法效果最好，蛋白脱除率为5 1 6 8 ，多糖损失率为 1 1 4 9 ；其次是t c a 法，单独使用s e v a g e 法的效果最差，其蛋白脱除率较低且 多糖损失率大。 5 分别用活性炭和树脂对苹果多糖溶液进行脱色。活性炭脱色的较优条件 为：温度为4 0 ，时间4 0 m i n ，p h 4 ，用量2 ，脱色率和多糖保留率分别为7 1 3 1 和6 2 7 9 ：树脂脱色的较优条件为：温度为5 0 c ，时间8 0 m i n ，p h 5 ，用量2 ，脱 色率和多糖保留率分别为8 2 6 9 和6 3 7 7 。 6 对多糖流变特性的分析显示，苹果多糖的粘度随温度的升高而下降，随 质量分数的增加而降低，随p h 的增加而降低，盐离子浓度对多糖的粘度变化影 响不大。 7 采用膜过滤法将苹果多糖按分子量大小分为五个分子段，不同分子量苹 果多糖由大到小所占体积比为：4 0 2 5 ：8 6 3 ：6 7 5 ：2 2 5 ：2 1 8 7 ：所占质量比为： 5 6 2 7 ：9 5 ：6 8 ：1 2 5 ：1 1 6 5 ：3 2 8 。 8 苹果多糖抗氧化活性的研究表明，苹果多糖对羟基自由基、超氧阴离子 均有很好的消除作用而且具有一定的还原能力，其中以分子量3 0 万以上部分效 果最好，但与v c 相比，结果偏低。 关键词：苹果多糖，脱色，脱蛋白，流变特性，膜分离，抗氧化 l 十肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t 1 t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，t i m e ，s o l i d s o l v e n tr a t i oo ne x t r a c t i o nr a t eo f w a t e r - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e so fa p p l ep o m a c eh a db e e nr e s e a r c h e db yq u a d r a t i c r e g r e s s i o nr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o n a ld e s i g n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a te x t r a c t i o nr a t e o fa p p l ep o m a c ew a sa f f e c t e db yf a c t o r sf r o mm o r es i g n i f i c a n tt ol e s sw i t h t e m p e r a t u r e t i m ea n ds o l i d s o l v e n t n 托b e s t e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea t ： t e m p e r a t u r e8 4 c ，t i m e 4 1h ，s o l v e n ta n ds o l i dr a t i ol ：5 2 1 1 1 e y i e l do ft h e p o l y s a e c h a r i d e so fa p p l ew a s14 9 4 u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s 2 m l eb e t t e rc o n d i t i o n so fu l t r a s o u n d - a s s i s t e de x t r a c t i o nw e r ea sf o l l o w s ：p o w e r 1 8 0 w ，t e m p e r a t u r e7 0 ，t i m e1 2 0 m i n ，s o l v e n ta n ds o l i dr a t i o1 ：3 0 ，b yo r t h o g o n a lt e s t n eo r d e ro ft h ee x t r a c t i o nf a c t o r sf r o mm o r es i g n i f i c a n tt ol e s sw a sa sf o l l o w s ： t e m p e r a t u r e p o w e r s o l i dl i q u i d t i m e 3 t h es t u d i e so fa p p l ep o l y s a c c h a r i d e sp r e c i p r a t i o np r o c e s ss h o w e dt h a tt h e b e t t e rc o n d i t i o n sw e r ec o n c e n t r a t e df o u r - f o l da n da d d i n ge t h a n o lo f4t i m e s i n c r e a s i n gt h ee x t r a c t e dt i m e sh a dn oi m p a c to nt h ee x t r a c t i o nr a t e ，c o n s i d e r i n gt h e e f f i c i e n c ya n de c o n o m y o fe x t r a t i o n ，e x t r a c t e do n et i m ew a sc h o s e n 4 s e v a g e ，t c aa n ds e v a g e + t c am e t h o d sh a db e e nu s e df o rr e m o v i n gp r o t e i n o fa p p l ep o l y s a c c h a r i d e s 刀豫r e s u l t ss h o w e dt h a t ：s e v a g e + t c am e t h o dh a dt h eb e s t t r e a t m n e t ，p r o t e i nr e m o v a lr a t eo f51 6 8 ，l o s tp o l y s a c c h a r i d e sr a t eo f1 1 4 9 ； f o l l o w e db yt c a ，t h ew o r s tt r e a t m e n tw a su s e db yo n l ys e v a g e ，t h el o w e s tr e m o v a l r a t eo fp r o t e i na n dt h eh i g h e s tl o s tp o l y s a c c h a r i d e sr a t e 5 a c t i v ec h a r c o a la n dp o r o u sr e s i nh a db e e nu s e df o rt h ea p p l ep o l y s a c c h a r i d e d e c o l o r i z a t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fd e c o l o r i z a t i o n 谢t ha c t i v ec h a r c o a lw e r ea s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r eo f4 0 ，t i m e4 0 m i n , p h 4 ，t h ea m o u n to f2 ，t h ed e c o l o r i z a t i o n a n dr e t e n t i o nr a t eo fp o l y s a c c h a r i d ew e r e71 31 a n d6 2 7 9 ，r e s p e c t i v e l y ；t h eb e t t e r c o n d i t i o n sf o rp o r o u sr e s i nd e c o l o r i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e5 0 ，t i m e 8 0 m i r bp h 5 ，t h ea m o u n to f2 ，t h ed e c o l o r i z a t i o na n dr e t e n t i o nr a t eo f p o l y s a c c h a r i d ew e r e8 2 6 9 a n d6 3 7 7 ，r e s p e c t i v e l y 6 t h es t u d i e so fr h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so fp o l y s a c c h a r i d e ss h o w e dt h a tt h e v i s c o s i t yo fa p p l ep o l y s a c c h a r i d e sw a sd e c r e a s e d 研t l lt h ei n c r e a s eo ft e m p e r a t u r e ， d e c r e a s e dw i t hi t sw e i g h tp e r c e n t e g e ，d e c r e a s e d 谢t ht h ei n c r e a s ei np ha n ds a l t c o n c e n t r a t i o nh a dn oi m p a c to nt h ev i s c o s i t yo fa p p l ep o l y s a c c h a r i d e s 7 t h em o l e c u l ew e i g h to fa p p l ep o l y s a c c h a r i d e sh a db e e nd i v i d e di n t of i v ep a r t s i i 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 b y u l t r a f i l t r a t i o n t h ev o l u m er a t i oo fd i f f e r e n tm o l e c u l a r w e i g h t w a s ： 4 0 2 5 ：8 6 3 ：6 7 5 ：2 2 5 ：2 1 8 7 ；m a s sr a t i ow a s ：5 6 2 7 ：9 5 ：6 8 ：1 2 5 ：11 6 5 ：3 2 8 8 t h er e s e a r c ho fa p p l ep o l y s a c c h a r i d ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yi n d i c a t e dt h a ti th a d e f f e c to ne l i m i n a t i n g h y d r o x y l r a d i c a la n ds u p e r o x i d ea n i o n ，a n dh a sac e r t a i n r e d u c i n gp o w e r ；t h eb e s tp a r tw a sm o l e c u l a rw e i g h tm o r et h a n3 0 0t h o u s a n d s ，b u ti t s f u c t i o no fa n t i o x i d a t i o nw a sl o w e rt h a nv c k e yw o r d s ：a p p l ep o l y s a c c h a r i d e ；d e c o l o r i z a t i o n ；r e m o v i n gp r o t e i n ；r h e o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ；u l t r a f i l t r a t i o n ；a n t i o x i d a t i o n i i i 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕f ：学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 p 学位论文作者签名：冀名乏笔 签字日期：。7 年多月f ， 日 6 1 甘肃农业大学 学位论文版权认定和使用授权书 研究生姓名：里塞态 学位级别： 亟盟窥生 所在学院：盒晶型堂皇工程堂院 学科专业：营差墨盒昌里生堂 学位论文题目： 芏墨渣虫盔渣蛙多撞鲍逞塑拯甚：眭厦受究 本人于2 q q z 年j l 月上日至2 q q 窆年! 月一! 垒 日在导师鄞玉蓥熬援 指导下，从事：现岱壅些主些佳丕：= 芏星王巫旦担羞逯逐主茎墨渣丝绫金型压珏筮：怼墓 生的盛渣选垒撞厘基缝厦进短工担差的研究。 产权内容：芏墨渣虫丞渣蛙多糖的提取厘其性厦班究 现认定以下条款： 1 、本人毕业后发表与研究内容有关的文章，作者第一署名单位为甘肃农业大学。 2 、学位论文中包含的研究成果的知识产权归苴赢壅些太堂。未经指导教师和苴虚壅些太 竺同意，本人不得私自从事与课题有关的任何开发和盈利性活动。 3 、本人完全了解甘肃农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借用。本人授权甘肃农业大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：盔之务， 签字日期：刀巧! 年占月jf 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电 话：门d 6 弓霉乏 邮编： 日 月静冬多砂年 、研1 名 期 签 日师字 导 签 第一章文献综述与立题依据 1 1 多糖定义与种类 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) ，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分 子多聚物，水解时产生2 0 个以上单糖分子的糖类，也称为聚糖。自然界中糖类 主要以多糖形式存在，是含量最丰富的生物多聚物。常见的多糖多数由一种类型 的糖基组成，如淀粉( s t a r c h ) 、果胶( p e c t i n ) 、纤维素( c e l l u l o s e ) 等，也有的含有一 种以上的糖及其衍生物残基，如各种形式的粘多糖( m u c o i t i n ) ( 丁一芳等，2 0 0 6 ) 。 多糖广泛存在于动植物、微生物细胞中，是重要的生物大分子物质。随着分子生 物学研究的进展以及免疫物质的化学研究与发展，人们逐渐发现不同来源的多糖 具有广泛而复杂的生物学活性，糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结 构材料，更重要的是参与了生命现象中细胞的各种活动( f r a n z 等，1 9 8 9 ) ，一 些植物多糖具有降低胆固醇、降血糖、抑肿瘤、抗凝血以及免疫调节的生理活性， 在治疗肿瘤、免疫紊乱、糖尿病、血栓、肺炎等临床应用方面都有显著的疗效， 因此糖的研究开始逐步活跃起来。到目前为止，己有近3 0 0 种的多糖类化合物从 天然产物中被分离提取出来，我国从多种中草药材中提取活性多糖的纯度己达 9 8 以上，在活性多糖的分离、纯化、分子结构确定及量效关系控制等方面取得 重大突破，达到世界领先水平。但与蛋白质和核酸的飞跃式发展相比，糖类的研 究仍显不足。 1 2 多糖的来源与分布 天然多糖分布于高等动物、植物的细胞膜或微生物细胞壁中。根据来源，可 以将多糖分为五类：植物多糖、动物多糖、藻类多糖、真菌类多糖及细菌类多糖。 1 2 1 植物多糖 植物多糖是由许多相同或不同单糖以q 或1 3 糖苷键连接而成的多聚物化 合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一。植 物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花，从各种中草药和其他植物中都 可以提取分离出多糖( 石雪萍，2 0 0 5 ) 。植物多糖中一类是水溶性多糖，如淀粉、 甘肃农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 菊粉、果胶及不同植物胶或黏液。另一类是不可溶性多糖，如原果胶、纤维素、 半纤维素等。目前，研究比较深入的植物多糖有：当归多糖、南瓜多糖、茶叶多 糖、枸杞多糖，人参多糖、大枣多糖、刺五加多糖等。 1 2 2 动物多糖 动物组织中也存在着有用的多糖，主要是来源于多种哺乳动物。目前开发利 用的主要有从新鲜的猪肠薪膜或牛肺中提取的一种含有硫酸醋的粘多糖一肝素； 从新鲜或干燥的猪喉( 鼻) 软骨中提取的酸性粘多糖硫酸软骨素；从鸡冠、人脐 带、兔皮、羊眼球等中提取的由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖双糖重复单位所组成的 酸性多糖一透明质酸；从虾壳、蟹壳中提取的多糖一壳聚糖等，其中含硫的多糖 ( 尤其以肝素最著名) 是生物学上重要的多聚物( 谭竹钧，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 藻类多糖 全世界的藻类约有3 万多种，迄今为止被人们广泛利用的主要是红藻、绿藻 和褐藻三大类，约1 0 0 余种。海藻多糖系海藻中所含的各种高分子碳水化合物， 具有高粘度或凝固能力，细胞间富含粘质多糖、醛酸多糖和含硫多糖。这些多糖 除了具有免疫促进作用及抗肿瘤作用，还具有抗病毒作用( 丁源等，1 9 8 2 ) 。国 外治疗艾滋病的权威预言，从海藻中可以获得有价值的抗艾滋病的多糖药物。我 国海藻资源丰富且类别很多，从中开发有价值的多糖前途很大，目前己有人从海 藻中开发出具有降胆固醇、降血脂的多糖保健品。现行研究较多的藻类包括：紫 菜多糖、红藻多糖、海带多糖、多管藻多糖、螺旋藻多糖、羊栖菜多糖等( 钱彦 丛等，1 9 9 8 ) 。 1 2 4 真菌类多糖 真菌是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的组成部分，1 9 5 1 年美 国人r e i u yh 首次发现担子菌有抑瘤活性，日本的千原于1 9 6 9 年从香菇中分离 出抗肿瘤活性的多糖。实验表明：真菌多糖可以通过淋巴细胞、巨噬细胞、网状 内皮系统的作用而调节机体的免疫功能，提高身体抵抗病毒和细菌入侵的能力。 目前，已报道的具有免疫调节作用的菌类多糖有：香菇多糖、银耳孢糖、灰树花 多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、木耳多糖及虫草多糖等( 肖盛元等，1 9 9 9 ) 。 1 2 5 细菌类多糖 2 甘肃农业大学2 0 0 9 届坝t 学位论文 细菌类多糖一开始主要是作为疫苗研究。用于疫苗成份的细菌多糖主要有构 成细菌表面荚膜的荚膜多糖( c a p s u l ep o l y s a c c h a r i d e ，c p s ) 和细菌细胞壁外层l p s 中的0 一特异性多糖( o s p e c i f i cp o l y s a c c h a r i d e ，0 s p ) 两类。如肺炎球菌荚膜多糖、 脑膜炎球菌荚膜多糖、流感杆菌荚膜多糖等( 谢贵林等，2 0 0 5 ) 。其中肺炎球菌 等多糖在美国已经应用于临床。随着多糖研究的发展，人们发现一些细菌多糖可 以在人工控制条件下利用各种废渣、废液进行生产，减轻了环保压力。 1 3 多糖的提取及分离纯化 1 3 1 多糖的提取 1 3 1 1 溶剂提取法 溶剂提取法是从植物中提取多糖的常用方法，溶剂提取法首先对溶剂进行选 择，一般都应遵循相似相溶原理，多糖是极性较大的大分子化合物，应选择水、 醇等极性强的溶剂。而在所有溶剂中，水是典型的强极性溶剂，对植物组织的穿 透力强，提取效率高，在生产上使用安全。因此它能广泛用于各种植物多糖的提 取( 李小萍，2 0 0 4 ) 。一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提 取液可直接离心除去不溶物；然后利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度 乙醇多次沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙 醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性 质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇 沉淀最为普遍( 韦巍等，2 0 0 5 ) 。李义等首次报导了马兰水溶性多糖的水提醇沉 工艺。水浸提法是多糖提取的传统方法，此法操作简便，有自身的优点。但由于 水作为溶剂难以完全溶出其中的多糖物质，所以需要多次浸提，操作时间长，收 率低。 1 3 1 2 酸提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。近来许多研究证明，酸 提植物多糖，具有较高的生理活性，且其中一些功能非水提植物多糖所能取代， 但酸提法也有其特殊性，只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，而且操作起 来有一定的难度，因为酸性条件下有可能会引起多糖中糖苷键的断裂。刘贝贝等 采用五因子二次正交旋转设计研究了酸浓度、料液比、提取时间、提取温度、提 取次数等5 个因素对酸提取菜籽饼粕中多糖的得率的影响。 3 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 3 1 3 碱提法 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多 糖。因为有些多糖在碱性较强时会水解，故碱的浓度应得到有效控制( a k i r ay 等，1 9 8 6 ) ，常采用稀碱提取，提取液应迅速中和后透析、浓缩与醇沉而获得多 糖沉淀。梁永欣等通过水、酸、碱3 种不同提取方法的正交实验，发现3 种提取 方法的多糖含量以碱提法的提取效果最好。 1 3 1 4 酶提法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取 过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，可加速多 糖的释放和提取。常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等( 许燕燕，2 0 0 6 ) 。 俞兰苓等以脱脂米糠为原料，研究比较酶法、热水法、微波辅助法等提取米糠多 糖的工艺，发现脱脂米糠预煮后采用蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶三种酶联合处理 的米糠多糖得率最高。关于各种酶在多种植物多糖提取中的应用的报道不断增 多。 1 3 1 5 超声波提取 超声波可在液体中产生空化作用，而空化作用产生的冲击波和剪切力可破坏 细胞壁和细胞膜的结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜与细胞壁的穿透力。在 超声波法提取中，超声波破碎过程是一个物理过程，超声波产生的热效应、机械 效应和空化作用可破坏细胞，使水溶性多糖更易于提取出来，浸提过程中无化学 反应发生，被浸提的化学成分结构和性质不会发生变化。徐雅琴等用超声波提取 南瓜多糖发现超声波可大大缩短提取时间，提高提取率，得到的多糖结构和性质 也不会改变。 1 3 1 6 微波提取 微波是频率介于3 0 0 m h z 和3 0 0 g h z 之间的电磁波，微波提取的原理是微射 线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞 内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于 细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。此法 提取时间短，提取率高，是强化固液提取过程颇具发展潜力的一项新型辅助提取 技术。张桂青等研究了微波辅助提取技术对菊花多糖提取的影响，结果发现微波 助提可以明显提高菊花多糖的提取得率，缩短提取时间，但有时会造成提取物的 4 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 组分更加复杂，分离困难。 1 3 1 7 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取技术( s f e ) 是近2 0 年来发展起来的提取技术它既是提取 技术，又是较理想的分离技术。超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d s ) 是一种温度和压 力处于其临界点以上的兼具液体和气体性质的流体。其粘度小，接近于气体，而 密度又接近于液体，扩散系数为液体的1 0 - 1 0 0 倍，具有良好的溶解特性和传质 特性。超临界流体萃取就是根据超临界流体对溶质有很强的溶解能力，且在温度 和压力变化时，流体的密度、黏度和扩散系数随之变化，溶质的亲和力也随之变 化，从而使不同性质的溶质被分段萃取出来，达到萃取、分离的目的。用于超临 界流体的物质很多，但最常用的是二氧化碳，利用超临界二氧化碳萃取技术提取 功能食品的功效成分，对于提高功效成分的纯度和活性具有重要的作用( 李志军 等) 。张健钟就用s f e c 0 2 从石竹科的雪灵芝中提取出了总皂苷及多糖。 植物多糖的提取方法和技术在不断的革新，越来越多的新技术新方法被应用 到多糖提取过程中来，但由于这些新的提取方法设备成本较高，目前的工作主要 集中于工艺实验研究，还缺少对提取机理和提取效果的深层次研究，暂时不能广 泛应用于多糖的大量生产。 1 3 2 多糖的除杂 1 3 2 1 脱蛋白 经有机溶剂沉淀获得的活性多糖中，还含有大分子蛋白质、脂类、有机溶剂 不溶的一些低分子量有机物及无机物。首先将多糖粗提物中的游离蛋白脱去，再 去除其它小分子杂质。游离蛋白去除的方法有s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法、三 氯乙酸法及酶法。常用的四种方法中s e v a g e 法是脱除蛋白质的经典方法，但存 在着有机试剂用量大，耗时较长，易造成样品损失的缺点( 徐建祥等，1 9 9 8 ) ； 三氟三氯乙烷法效率高，但溶剂易挥发；三氯乙酸法作用剧烈，对含吠喃糖残基 的活性多糖有破坏作用；木瓜蛋白酶法适用于结合蛋白。因此，有研究者提出采 用以上中两种或者多种方法的联用。一般认为酶法和s e v a g e 联用是一种很有效 的植物多糖中脱蛋白方法( 刘成梅等，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 2 脱色工艺 多糖中常含有一些色素( 游离色素或结合色素) ，根据其不同性质采取不同的 方法。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法( 纤维素、 气 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 硅藻土、高龄土、活性炭) 等( 杨云等，2 0 0 4 ) 。d e a e 一纤维素是目前最常用的 脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色的目的，而且可以分离。 1 3 3 多糖的分离纯化 多糖分离纯化的方法很多，只用某一种方法往往不能得到纯的多糖，有时需 结合两种以上的方法才行。常用的方法有以下几种( 盛家荣等，1 9 9 9 ) ： 1 3 3 1 沉淀法 a 分步沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的 性质，逐次按比例由小至大加入这些醇或酮( 常用乙醇) 分步沉淀。这种方法适宜 于分离各种溶解度相差较大的多糖。 b 盐析法：根据不同多糖在不同浓度盐溶液中具有不同溶解度的性质，加入 不同盐析剂使之逐步析出。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，以硫酸 铵为佳。这种方法实质上是分步沉淀法的一种。 c 金属络合物法：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而 沉淀的性质来进行分离。常用的络合剂有菲林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅 等。得到的络合物沉淀经水充分洗涤后，用5 ( v ) 无机酸乙醇液或硫化氢分解。 d 季铵盐沉淀法：根据长链季铵盐能与酸性多糖成盐，形成不溶性多糖化合 物的特性，以分离酸性及中性多糖。常用的季铵盐是十六烷基溴代三甲基铵 ( c t a b ) 及其碱( c t a o h ) 和十六烷基吡啶( c p c ) 。实验时必须严格控制多糖混合 物的p h 小于9 及无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来。 1 3 3 2 柱层析法 a 纤维素柱层析：常用不同浓度乙醇水溶液由低到高进行洗脱，将各种多糖 分离。 b 纤维素阴离子交换柱层析：此法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。 常用的交换剂为d e a e - 纤维素和e c t e o l a 纤维素。在p h 6 时，酸性多糖能吸 附于交换剂上，中性多糖不吸附。然后用p h 相同强度不同的缓冲液将酸性强弱 不同的多糖分别洗脱出来。但如果柱为碱性，则中性多糖也能吸附。另外中性多 糖还能与硼砂形成络合物，所以有时将柱处理为硼砂型后，用不同浓度的硼砂溶 液洗脱，也能将不同中性多糖分离开来。阴离子交换柱层析是目前最常用的方法。 c 凝胶柱层析：它是根据多糖分子的大小和性状不同而达到分离目的的。常 用的凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 及琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 及d e a e s e p h a d e x 。 6 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于o 0 2 。凝胶 柱层析也是多糖分离中常用的一种方法。此外，还有一些其它方法：如制备性区 域电泳法、超滤法、亲和层析、制备性高压液相层析、用活性炭及硅胶作载体的 柱层析等纯化方法。 1 3 3 3 纯度鉴定 经过分级纯化的多糖，在测定结构前须纯度鉴定。多糖的纯度不能用通常化 合物的纯度标准进行衡量，因为多糖纯品在结构上也并不是完全一致的，我们通 常所说的多糖纯品实际上是一定分子量范围的均一组分。目前，检查纯度最常用 的方法主要有：比旋度法、超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、光谱扫描法、 纸层析、g c 、h p l c 、冰融法等。前三种方法误差较大，而g c 和h p l c 是近年 来用于测定多糖纯度的新方法，具有快速、高分辨率和重现性好的优点，是目前 最常用的方法，在国内外已得到广泛应用。 1 3 3 4 多糖结构分析 多糖的结构分析主要以一级结构为主，因为多糖二级及以上结构是以一级 结构为基础的。分析多糖结构有许多方法，包括化学方法、物理方法和生物方 法( 周鹏等，2 0 0 1 ) 。化学方法中主要有下列几种方法：水解法( 包括完全酸水 解、部分酸水解、乙酞解和甲醇解) 、高碘酸氧化法、s m i t h 降解、甲基化反应。 物理方法对多糖结构的分析具有快速、准确性高等特点，是糖链结构分析不可缺 少的手段。多糖高级结构的分析主要采用物理方法。主要的物理分析方法有：x 一射线衍射、色谱法( g c 、h p l c 、c e ) 、质谱技术( g c - - m s ，m s - - m s 联 用、同位素标记等) 、电泳技术、红外光谱等。对多糖的高级结构研究的方法还 有很多，除了上面提到的外，还有圆二色谱( c d ) 、原子力显微镜( a f m ) 等方法。 但是因为多糖的复杂性，至今还没有一种有效的研究多糖全结构的方法。将不同 的研究方法联用是研究多糖高级结构的发展方向。生物学方法主要是利用特异性 糖苷酶进行的酶法分析，酶促反应具有高度专一的特性，副产物少，在糖链的结 构分析中是一种很好的方法。多糖链中糖苷键类型可以利用a 一糖苷酶和b 一糖 苷酶对多糖底物的催化反应来确认，利用酶法分析糖链连接方式。此外，还可以 利用免疫学方法来分析糖的结构，其原理为：抗原和抗体会相互结合，一定结构 的多糖( 寡糖) 会抑制抗原一抗体的结合，不同的糖( 半抗原) 有不同的抑制常数。 当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制，通过测定其抑制常数再 7 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 与己知结构的糖链相比较，有相近抑制常数的多粒其结构+ b 舶州：。 荣等， 2 0 0 3 ) 。 1 4 立题依据 1 4 1 苹果多糖研究现状 我国是世界苹果栽培与加工第一大国。据资料和权威人士报道，至2 0 0 6 2 0 0 7 年，我国苹果种植面积约2 6 7 万h m 2 ，总产量约2 5 0 0 万吨，占全球苹果总产量 6 0 0 0 5 0 0 0 万吨的4 0 5 0 ( 庞伟，2 0 0 7 ) 。产出鲜果2 5 用于加工，浓缩苹果汁 是最主要的产品形式。也是世界最主要的苹果加工产品，占世界苹果加工品总量 的9 0 以上( 刘英杰，2 0 0 5 ) 。目前苹果加工主要集中在陕西、山东、山西和河 南等省区，相对比较集中。近两年来我国苹果汁出口量增加，带动了苹果栽培规 模和果汁产业双双的进一步增长。在果汁产业迅猛发展的同时，果渣的排放量也 逐年增大。据果汁厂经验，每生产1 吨浓缩苹果汁产生1 - 3 吨湿果渣，我国现年 果汁产量约1 0 0 万吨，排放果渣量达到1 3 0 - - 1 5 0 万吨，形成了新型的农业资源 ( 仇农学，2 0 0 6 ) 。 新鲜苹果渣中7 0 以上是水，另外还含有可溶性糖、维生素等丰富的营养物 质，且其p n 偏酸性，适宜微生物的生长繁殖。排出的苹果渣如果不及时处理， 短时间内就会滋生大量微生物，从而腐烂、变酸、变臭。既严重地污染了环境， 又造成资源的极大浪费。国内外各果汁加工企业都非常重视苹果渣的合理利用。 先后在饲料开发、果胶、膳食纤维、柠檬酸、酶制剂、低聚糖研究方面进行了大 量工作，并有部分产品已经走向产业化。然而，一方面因苹果渣富含纤维质组分， 作为饲料对其生物质利用率低，果渣增值少：另一方面，包括果胶在内的功能性 产品生产会产生大量的纤维质二次残渣，难以达到生产上消灭性利用的要求。因 此，寻找可持续、低成本、多元化的苹果渣开发途径也是苹果加工业面临的当务 之急( 马惠玲等，2 0 0 3 ) 。 苹果多糖主要包括可溶性糖、淀粉、果胶、纤维素、半纤维素、木质素等， 含量可达5 5 - - 6 0 0 0 ( a n d r e s s 等，2 0 0 3 ) ，主要存在于果皮与果肉固形组织中， 由于绝大多数不易溶于水，故在榨汁后有相当数量保留于苹果残渣之中，经果胶 等功能性组分生产，仍有相当比例的多糖残留于余渣中，因此，苹果渣成为研究 和获取苹果多糖的常用原料。吴卫华报道果渣中果胶和粗纤维含量约3 0 3 3 8 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 3 8 5 5 。马惠玲等测出总糖、淀粉、果胶、半纤维素、纤维素、木质素、单宁、 全氮、蛋白质含量分别为4 6 7g k g 、2 2 2 2g 瓜g 、1 3 6 3g k g 、7 8 6g k g 、9 1 5g k g 、 9 5 7g k g 、1 2 3g c k g 、8 0g k g 、4 5 1g k g ( 干基) 。m a s o o d ifa 等报导苹果渣含 2 9 4 中性纤维，1 3 0 果胶。f o o ly 等得出苹果渣含总膳食纤维( 果胶、纤维 素、半纤维素的总和) 5 5 5 6 。y o n gj i nc h o 等测出苹果渣含有中性糖3 8 3 ， 淀粉5 2 ，碳水化合物7 0 9 。a n d r e a ss c h i e b e r 等发现苹果渣中含中性全糖 6 0 0 、半乳糖醛酸5 o 、脂类物质1 0 、蛋白质4 0 、多酚1 1 8 ，中性全 糖由5 3 1 的阿拉伯糖、4 9 的葡萄糖和2 o 的鼠李糖组成。陈锦屏等报道苹 果渣还含有丰富的维生素和果酸。a n d r e a s 等发现其组分中含中性多糖6 0 o 、 半乳糖醛酸5 o 、脂类物质1 o 、蛋白质4 0 、多酚1 1 8 ；中性多糖的单体 由分别占提取干物质5 3 1 的阿拉伯糖、4 9 的葡萄糖和2 0 的鼠李2 5 糖组成。 r e n a r d 等对苹果渣提取果胶后的残渣碱液浸提，得到以木葡聚糖为主的多糖产 物。k a t r i 等采用酶解法液化苹果渣，水提醇沉获得9 7 1 9 6 的粘性多糖。 苹果果实多糖的研究与开发已有半个多世纪的历史，其典型代表为苹果果胶 产品的生产及其功能性应用( 田三德等，2 0 0 3 ) 。迄今为止，国内外围绕着果胶 的高产率和高胶凝度对苹果果胶多糖及其生物活性进行了深入研究。果胶是一种 粘多糖，常见苹果果胶生产工艺为酸提醇沉法，以苹果干渣为原料，果胶得率 1 0 左右。现有多糖构效理论认为，产品粘度与活性成反比，苹果果胶尚被证实 具有抑瘤、抗氧化活性( 王宪青等，2 0 0 5 ) ，其余残留碳水化合物中不乏存在其 它活性多糖的可能，不以追求高粘度为指标时，改变工艺条件提取的果胶产品的 生物活性亦或会更高。而除果胶外，苹果渣尚含有大量其它多糖，其制备工艺与 功能的研究鲜有报道。不同苹果渣样品中碳水化合物总量及各组分的含量均不 同，依原料果的品种、生产地点、成熟度等而变化；苹果多糖的单体组成亦有不 同。因此，针对苹果果实中多糖的多样性与理化性质的差别，采取不同工艺分级 提取，分离，系统测试与筛选，有望全面认识苹果多糖的组成与功能活性，为新 型活性物质的挖掘、或开辟以活性为目标苹果多糖生产的新工艺提供依据，对提 高苹果渣的综合利用能力，保证苹果加工清洁生产和可持续发展具有重要意义。 1 4 2 苹果多糖的活性基础 1 4 2 1 苹果纤维的生物活性 苹果纤维具有降低胆固醇、降低饲料能值、减少蛋白质的吸收等的作用。s l y 9 甘肃农业大学2 0 0 9 届硕f ：学位论文 m r 等用苹果渣对猩猩的喂养实验和e g a s h i r ay 等用苹果渣对小白鼠饲喂实验 表明苹果渣具有降低胆固醇的作用。m a f i al e o n t o w i e z 等通过实验证明了苹果渣 具有脂质降解的特性，以10 的干苹果渣加0 3 的胆固醇饲喂w i s t a r 雄鼠4 0 天，结果明显阻止了原生质脂质的升高( p 0 0 5 ) ，使原生质胆固醇总量降低了 2 0 ，h d 卜胆固醇降低了3 2 6 ，并降低了总磷酸脂的浓度，而未加胆固醇组 分苹果渣的饲喂对以上指标无显著影响，对脂类过氧化物的含量无作用，用于食 用胆固醇的老鼠，这一特性更加突出。b o b e kp 用高胆固醇血症的老鼠实验，给 刚断奶后的老鼠以o 3 的胆固醇饲喂1 0 周( 将其作为对照) 后，给其中几组在 对照组饲喂基础上添加5 的纤维素，其余的喂饲干燥的苹果渣( 可溶性物质含 量为1 0 3 ) ，通过放射性同位素测定结果表明果渣的加入并未影响胆固醇的吸 收率，血清中的胆固醇的含量也未改变，但促进了肝脏和心脏部位中胆固醇的分 解，分别降低了1 1 和1 8 - - - 2 1 ，并且出现了肝内胆固醇代谢酶h m a c o a 活性适应地下降，降为原来的一半，原生质降解的胆固醇增加6 0 - - 1 2 0 ；原 生质内胆固醇骨架物质共轭双烯浓度减少，从而降低了血红细胞内的氧化酶系 一s o d 、c a t 、g s h 活性，是活性氧水平较低的适应性反应。f e k e t es 等给肥猫 食物中混入一定比例的苹果渣( 1 0 、2 0 、4 0 ) 进行喂养，发现混入的比例 愈高，营养物质的消化吸收率愈低，在1 0 、2 0 的比例下能值就下降了，但脂 肪的利用率只有轻微改变，粗蛋白的吸收率大大降低。因此建议在保证正常营养 的前提下，食料中加入一定比例的苹果渣能够降低热量值，适于作为肥宠物的食 谱，实际应用时应根据蛋白质的需求量和添加料对蛋白质的稀释比例来准确计算 纤维质配料的加入比例。因此，苹果粗纤维具有降低胆固醇、降低饲料能值、减 少蛋白质等保健和减肥的功效。 1 4 2 2 苹果果胶的生物活性 果胶是从植物组织中提取的一种多糖，亦称为果胶多糖，通常认为由果胶 酸酯( p e c t i n i ca c i d ) 和果胶酸( p e c t i ca c i d ) 组成，虽然原果胶、果胶酸酯、果胶酸一 起通称为果胶物质，可是原果胶( p r o t o p e c t i n ) 于不溶于水通常不能被提取出来。 果胶多糖是水溶性膳食纤维的主要组分。研究表明，食用水溶性纤维，可降低餐 后血糖生成和血胰岛素升高反应。由于膳食纤维有粘性，可降低碳水化合物移动 性和吸收率，这样碳水化合物底物在细胞或组织水平被纤维基质包裹，而使其消 化和吸收减少。不消化的碳水化合物在结肠发酵时生成短链脂肪酸，及其对全身 1 0 甘肃农业火学2 0 0 9 届硕十学位论文 葡萄糖和脂类代谢有影响，于是碳水化合物的发酵作用可以加强抑制人体肝脏葡 萄糖的生成，以及抑制非脂化脂肪酸水平，这样就可降低空腹血糖水平和改善葡 萄糖耐受量( 赵英雄，2 0 0 4 ) 。多方资料提到苹果果胶多糖或苹果膳食纤维具有 抑瘤、抗氧化等生物活性，但是对苹果多糖的结构与活性的系统研究在国内外鲜 有报导。s l y 等用苹果渣对猩猩的喂养实验和e g a s h i r ay 等用苹果渣对小白鼠饲 喂实验表明苹果渣具有降低胆固醇的作用。m a r i al e o n t o w i c z 等通过实验证明了 苹果渣具有促进脂质降解的特性，推测苹果