（分析化学专业论文）新型dna电致化学发光探针及其在dna分析中的应用研究.pdf

学位论文独创性声明 零入酝莹交羲学位论文是我誊警簿戆撂导芩遴蠢戆霹究玉器及双褥懿磅究 成采据我所知，滁文中已经注明引用的内容外，术论文不包含其他个人巴触发 表鬟撰写过螅蘩究残募。砖本文酶礤怒鲠窭蓬要贾藏酶令人雾纂体，鹭已在文孛 作了龌确说明并表零谢意。 箨毒签名：茎萎筮瑟箍絮：主塑， 学霞论文使焉授权声葫 率入党奈了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 擎筏蘧文辩向藿家生警部惩裳其搔定撬麴送交埝文酶毫子驻和缀菔叛。毒获将学 位论文用予非赢利目的的少纛复制并允许论文进入学校图书馆被蠢阅有权将学 位论文穗内寨籍入有美数器簿遘行梭索霄衩祷学位论文酶标题和擒要汇编离 菠撂密瓣学位论文囊黟密嚣逶建本麓定。、主 ， 学位论文作者签名：锡妊等滞签名：歹坛 一 群期：文口以j 搿精：j 螂f 3 攮葵 新型d n a 电致化学发光探针及其 在d n a 分析中的应用研究 摘要 脱氧援糖核酸( d n a ) 被称为生命体内的遗传物质，研究发现人类的许多 遗传疾病都与d n a 分子中碱基序列的变弊有关。检测与疾病有关的变异对基因 簿选、蘧转疾瘸豹睾期诊叛窝治疗其有卡分深远瓣意义。 d n a 杂交分析技术怒目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术 之一，跫定性或寇耋检测特异d n a 序鳓片段的裔力工其。葺蘸，它己广泛应用 在生命科学，尤其是医学的各个领域。传统的d n a 分子杂交采用的是放射性标 记的检测方法，这种方法鼓然灵敏度高，倪存在放射性物质对人体及环境的危害。 鑫2 0 世纪8 0 年代以来，务秘菲阏位素翔鹣、荧必素、生物素、撼惠辛撂避豹纯 学发光法和荧光分析法以及以电活性物质做标记的电化学方法相继问世，这些方 法虽然在定程凌上竞骚了弱位豢标记静缺臻，毽l 亟于存京灵敏瘦不够离袋检测 系统庞杂溅仪器价格昂贵戏标记物不稳定等缺陷，还不能完全取代传统方法。因 此寻求简荦、灵敏、可靠、价廉的非放射性标记的d n a 棱测方法其有十分重要 的现实意义。 电致化学发光( e c l ) 分析悬一种通过电极反应而产生化学发光的微避分析 方法。它将电纯学鼓本与纯学发是检测绥会起来，嚣蛰了眩纯学方法晕霹纯学发毙 方法的不飕具有灵敏度赢、选择性好、动力学范闰宽、梭测快速方便、仪器价 格便宣等优点，运凡年来谯分析化学，尤蕤在生物分析领域弓f 超了入们的极大关 注。本论文通过研究了多种e c l 滔性物质的发光性能，并以这些物质为橡记物 制备了多种高灵敏度的d n a e c l 探针，结合d n a 杂交技术和d n a 固定化技 零，垮裹灵敏度魏e c l 检测手段成耀于生鑫貔矮d n a 载窿魏识蹦及含爨测定， 为d n a 传感器的研究和熬因芯片的开发撼供了新的思路和方法。 摘篓 论文主要研究内容如下： 第一章绪论 简单介绍了e c l 分析方i 老的概念、原理和特点，熏点介绍了各种e c l 反应 类黧及其在分专 享彼学孛戆应翅，系统总结了各穰e c l 谨戆纂，震望了e c l 分据 的朱来发展方向。介绍了d n a 传感器的构造和各种d n a 传感器的原理、特点 及分析应用。最后阐述了本论文的目的和意义，指出论文的创新之处及主要研究 痰容。 第二章e c l 活性标记物的憔能研究及其e c l 分析体系的建立 磷究了环酸瓣类兹霞n - ( 4 氨基_ 蒸) 乙基舅簧米诺( a b e i ) 秘鲁米诺 ( l u m i n 0 1 ) 、吖啶酯类物质醛旗吖啶酯和羧嫠吖啶酯、抗癌药物道诺霉索( d n r ) 的e c l 行为，建忘了这凡种物质的e c l 分拼体系，并结合电化学、紫乡 可见 光谱、荧光先落簿手段 专论了京们静e c l 反应枫理，为d n a 懿e c l 分析奠定 了方法基础。 l a b e l 的e c l 性能研究及其e c l 分析体系的建立 a b e i 是一种环酰肼类衍生物，其分子结构上含有一个特殊的长臂功能团氨 基，嚣壹接露来辍记生物丈分予。本文研究了a b e i 豹e c l 性能，发现在碱性 溶液中，施 j 1 1 + 1 0 v ( v sa g a g c l ) 的电压时，a b e i 可猩p t 电极上产生很强的 e c l 信号，适爨h 2 0 2 的加入可催化这一发光反应。考察了各种影响因素，建立 了a b e l 熬e c l 分氍方法。蠢法漠定a b e l 鹣线蛙璃瘦藏滋为1 3 xl 驴6 。s l 旷豫t o o l l ，捡出限可以达到9 6 x1 0 0 3m o l l 。 2 f c a 镬琵l u m i n o l - h 2 0 2e c l 反应鹣磁突获萁e c l 分辑体系豹建藏 l u m i n o l 是最早被发现的e c l 物质，也怒目前为止发光效率最高的物质之一， 但由于其分子结构上缺乏合适的标识基团丽使其难以直接标记生物大分子。羧基 二菠铁( f c a ) 怒一季孛电使学潺整物震，葵分子结梅上豹羧基能够积釜饬大分子 摘要 作用，可用予标记生物大分予。本文研究t f c a 对l u m i n 0 1 h 2 0 2 的e c l 催化作用， 发现在低电位下，f c a 首 极大地催化l u m i n o l 和h 2 0 2 的e c l 反应，恧且壤化楼号 与f c a 懿浓度在5 ，o x l 0 9 2 0 x l o 4 m o l l 麴范围海呈嶷好憝线性关系，稔密隈霹 戳达到1 5 x 1 0 一m o l l 。戳怼a 筝为d n a 标记物，方法可沼予d n a 的e c l 检测。 3吖啶酯类化含物的e c l 性能研究及其e c l 分析体系的建立 吖啶酯是一类较好的化学发光( c l ) 物质，而且其分予结构上食鸯特殊的 功能团，可用来标记生物大分子，实璎生物物质赡c l 分辑。毽骞关其e c l 性 缝熬研突去| 】较少。本文研究了谈纯1 0 - 乙羧基吖鼹一9 一羧酸苯翡( c a c p e i ) g l 对荦 酝萋苯萋一1 0 - 爷纂吖淀一9 一羧羧酪氟磷酸箍( m f p a ) 的e c l 行为，发琥在中性 烈0 3 介质中，这两种吖啶酯都能在一定的电位下产生很强的e c l 信号，考察 了各种影响因素，确定了发光的最佳条件，探讨了可能的发光机璁。在最佳条件 - fe c l 傧号与c a c p e i 及m f p a 的浓度分别操5 0 1 0 ”1 2 x 1 0 7 g m l 积 2 4 x 1 0 4 0 9 , 6 x 1 0 8 9 m l 范围内曼良好鲍线性关系。捡出限哥分裂达到2 4 x 1 0 d o g m l 移1 6 x 1 0 。o g m l 。魄c l 法豹灵敏度离1 0 0 0 倍。 4 道诺霉素的e c l 性能研究及其e c l 分析体系的建立 道诺霉素( d n r ) 是一种葸环类抗生素，具有广谱的抗肿瘸作用，在临床 上得到广泛的应用。与d n a 作用机理研究表明，d n r 以其特殊的蕙环平驻缝搀 可选择性她嵌入到d n a 豹双链结构嚣。因鼗霹搏为淤a 懿杂交指承裁。本文 磷究了d n r 抟e c l 符秀，发现在牵性k n 0 3 溶液中，d n r 可在3 0 v 醵上的电 毯下产生徽强的e c l 信专。考察了各种影响因素，确定了反应的最佳条件。探 讨了其可能的发光机理，建立了d n r 的e c l 分析方法。同时考察了常见有机物 对d n r 测定的予扰情况。方法测定d n r 的线性响威范围为1 6 l 乙1 2 l o 5 m o 垤，检出限可以达到5 6 x 1 0 一m o l l 。与分糍技术联用，该方法可爨予药携及 人体代遴物中d n r 含霪鲍测定。凝露霹建d n r 俸戈d n a 杂交指示裁，翅掰建 立游e c l 方法对d n a 进行分析捻测。 摘要 第三牵d n a 在霾体支持携上熬霾定纯霹究 1d n a 在黼体支持物上翡溺定纯方法 在d n a 传感器研究中，如何把d n a 嬲定在固体支持物表面是一个关键性 的闯黻，因为它直接关系到传感器的灵敏度、稳定饿和选择性。本节总结了几种 鬻咫夔d n a 霾定缘方法，圭要包括壤瓣法、共俊键会法、分子自筑装法、囊锈 素、亲合素法和组合法，并结合实例指出每一种方法的优缺点。 2 d n a 在靴电极上的固定化研究 研究了一种新的在p t 电板上固定d n a 的方法。首先在p t 电极上以电化学 聚会黪方式修饰一层导电聚会物毗略貘，然麓姆这一修馋亳壤捶入裂s s d n a 豹 酸性溶液中，在+ o 5 v ( v sa g a g c l ) 的恒电位下静电吸附2 0 0 s ，具有多孔结构 莠带蠢歪毫赘静聚l 豫漆貘对带有受亳旖静s s d n a 分予有强懋静啜辩俸璃，麸焉 将s s d n a 固定在p t 电极上。利用电化学、紫外可见光谱扫描和e c l 检测等手 段研究了各种条件包括溶液的酸度、i l 眈咯浓发、聚合时间、聚合方式、d n a 吸 附时阀、吸附方式等慰s s d n a 匿定愤况的影嚷，选择出了最佳盼固定纯条传。 实验结果证明，这种嗣定化方法不仅固定量多，灵敏腱高，而且稳定性好，固定 上去懿d n a 憝牢露圭| 鏊啜醛程聚躐咯膜主，群篌在裹辫子强爱瓣毫薅矮溶滚串也 不易脱落。固定在电极上的s s d n a 对其互补序列有选择性地响应，最低响应值 可达劐t 0 | 2 m 0 1 l 。 第四章d n a - e c l 探针的制备及其在d n a 分析中的应用 采用直接标记法寒续米鬏粒趣接撂逗法将三静不麓夔e c l 活毪纺震标诧在 已知序列的s s d n a 片段上，制备了三种不同的s s d n a e c l 探针，与固定在电 投主豹嚣标s s d n a 遴行杂交爱应，通过e c l 检测实现对舀标d n a 豹序列谈辅 及含爨测定，获得满意结果。 毒 捅费 la b e l d n ae c l 探针的制备及应用 在昧瞧溶液孛劳脊求溶往碳二暇胺( e d a c ) 熬存在下，使含有氢基的a b e i 与磷酸修饰s s d n a 作用，通过磷酸基与氨基之间的键合作用将a b e i 直接标记 在s s d n a 上，铡备成a b e i s s d n a 探针。分剐周e c l 法、紫夕 可见光漤法寇 电纯学法对其进行表征。然后与溜定在电极上的s s d n a 进行杂交反应，用e c l 法测定杂交信号，实观对目标s s d n a 的序列识别及含量测定。该探针能准确识 别出三城基错配序列，对互李 序列麓响应可达戮3 l f f ”m o 拢。 2f c a d n a 探针的制备及应用 奁e d a c 鲍活纯下，f c a 分予绫梅主豹羧蒺与n h 2 。s s d n a 上静氨萋豫翅， 将f c a 赢接标记在n h 2 - s s d n a 上，制备成f c a s s d n a 探针。分别用e c l 法、 紫外可见光谱法和电化学法对其进行表征。然后与固定在电极上的s s d n a 进行 杂交爱疲，震e c l 法溅定杂交信号，辗摇发光臻弩戆太枣对嚣拣d n a 进行谈嗣 及定量。实验结果证明，该探针能凇确识别出三碱基错配序列，对互补序列的响 应可以达到5 1 0 0 1 m o l l 。 3l u m i u o l o s i 0 2 纳米颗粒标记s s d n a 探针的制铸及应用 纳米技术以其独特的优势引起了人们的极大必注。纳米颗救标记是d n a 分 祈孛静一令崭薪漂越。零文首次戳l u m i n o l 为核孝才料，翻爝菠穰徽乳液毅拳，制 备了掺杂有l u m i n o l 的s i 0 2 纳米颗粒，并在纳米颗粒表面修饰一层壳聚糖，使 其能与d n a 结合，从褥制备成l u m i n 0 1 s i 0 2 纳米颗粒标记鳃s s d n a 探钤。结 合d n a 聚交技术及嵩灵敏度豹l u m i n o le c l 检测方法对不鞠序列的目标d n a 进行识别及定量。实骏结果证明，这种探针对d n a 的序列特征具有更强的识别 能力，对纛羚序列静晌疲其毒更篱戆灵敏度。捡滋限可戬达囊2 l o 珏m o l l 。 关键词d n a 电致化学发光探针：d n a 固定化：d n a 杂交；d n a 序列识别及 含量溅定：电致健学发宠捡溅；续凑颞粒标记 a b s t r a c t 一 s t u d y o nn o v e ld n a e l e c 重l o c h e m i l h m i n e s c e 娃c ep r o b e s a n dt h e i r a p p l i c a t i o n s t od n a a s s a y a 嚣s t r 矗c 篁 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) i s k n o w na si n h e r i t e ds u b s t a n c ei nl i f eb o d y w i t h t h e i n c r e a s i n go f k n o w l e d g e a b o u th u m a n b e i n g s d i s e a s e si ti sf o u n dt h a tt h em u t a t i o n s o f h a s es e q u e n c ei nd n a a r er e s p o n s i b l ef o rn u m e r o u si n h e r i t e dh u m a nd i s o r d e r s - i n o r d e rt om a k ee a r l yd i a g n o s i sa n d c u r ef o rd i s e a s e , m u c he f f o r ti sn e e d e d t od e t e c tt h e s p e c i f i cd n a s e q u e n c e s r e l a t e dt od i s e a s e s ，w h i c hi sa l s oh e l p f u lf o rt h e s e l e c t i o no f g e n e s a n dt h ed e v e l o p m e n t o f d r u g s m o s to ft h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d sf o rt h ea n a l y s i so fs p e c i f i cd n as e q u e n c e sa l e b 硒e do nt h en u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o n s i n g l e s t r a n d e ds s - d n ap r o b e b i n d st oi t s c o m p l e m e n t a r ys t r a n d ( t a r g e ts e q u e n c e ) t of o r mad o u b l e s t r a n d e d ( d s ) d n a w i t h h i g he f f i c i e n c y t h es i g n a lp r o v i d e db yt h ep r o b ei s am e a s l t r eo f & d e g r e eo f h y b r i d i z a t i o n 州m o n a ld n ap r o b e s 瓣l a b e l e dw i t hr a d i o i s o t o p e si e 3 2 p , 1 2 5 i ，3 h o r ”s a l t h o u g ht h i s m e t h o dg i v e sh i g hs e n s i t i v i t y , t h er a d i o a c t i v el a b e l sp r e s e n tm a n y p r o b l e m ss u c ha sap o t e n t i a l h a z a r dt oa n a l y s ta n de n v i r o n m e n t ，w h i c hl i m i t e di t s a p p l i c a t i o ni nd n a d i a g n o s t i cl a b o r a t o r i e s 。i no r d e rt oo v e r c o m et h e s ep r o b l e m sa s e r i o u so fn o n - r a d i o a c t i v ed n ap m b e ss u c ha sf l u o r e s c e n t , c h e m i l u m i n e s c e n ta n d e l e c t r o c h e m i c a lp r o b e sh a v eb e e nd e v e l o p e d a l t h o u g ht h e s en e wm e t h o d sd i s p l a y m a n ya d v a n t a g e s ，t h e yh a v en o tb e e nu s e dt o t a k ep l a c ec o m p l e t e l yt h et r a d i t i o n a l m e t h o db e c a u s eo fl o ws e n s i t i v i t yo rc o m p l e xe q u i p m e n t o ro t h e r s h o r t c o m i n g s s o i t i sn e c e s s a r yt od e v e l o po t h e rr a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fs p e c i f i c d n a s e q u e n c e s ，w h i c h c a na l s ob eu s e de a s i l yi nn o n s p e c i a l i z e dl a b o r a t o r i e s ， e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e e l ) i sat e c h n i q u et h a tc o m b i n e sc h e m i l u m i n e s c e n c e 6 a b 5 1 i 蚺l 1 f c l ) a n de l e c t r o c h e m i s t r y ( e c ) t h ec l r e a c t i o nw a si n i t i a t e d 姆a l le l e c t r o c h e m i c a l r e a c t i o na te l e c t r o d es u r f a c e 。s u c ha r te l e c t r o i n i t i a t i o nr e a c t i o ni n t r o d u c e sal a r g e n u m b e ro fa d d i t i o n a la d v a n t a g e s s u c ha sh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y , r a p i da n d c o n v e n i e n to p e r a t i o na n dr e l a t i v e l ys i m p l ei n s t r u m e n t a t i o ns y s t e m 。d u et o t h e s e i n h e r e n ta d v a n t a g e s ，e c lm e t h o dh a sa t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o nf r o ma l la n a l y t i c a l f i e l d s ，e s p e c i a l l yf r o mb i o c h e m i c a la n a l y s i s i nt h i sd i s s e r t a t i o nw ef o c u s e do nt h e p r e p a r a t i o no fa 耍喇t y p e o fd n a p r o b e sw h i c h w e r el a b e l e dw i t he c la c t i v a t e d s u b s t a n c e s b a s e do nc o u p l i n gw i t ht h ed n ah y b r i d i z a t i o na n di m m o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s ，w eh a v ed e v e l o p e dn e w e c lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs p e c i a l d n a s e q u e n c e c o m p a r e dw i t h o t h e rm e t h o d st h en e wm e t h o d sa r es i m p l e , r a p i da s w e l l 雒s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t h ed i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ff o u rc h a p t e r s a s f o l l o w i n g s ： c h a p t e rl ：i n t r o d u c e dt h ee c l a n di t sa p p l i c a t i o ni na n a l y t i c a lc h e m i s t r yf i e l d ，p a i d m o r ea t t e n t i o nt ot h et y p e so fe c l r e a c t i o na n de c ls e n s o r s r e v i e w e dt h ed n a s e n s o r s ，i n c l u d i n gt h e i rp r i n c i p l e s ，a d v a n t a g e a n d d i s a d v a n t a g e a tl a s tp o i n t e d o u tt h e p u r p o s eo f t h e d i s s e r t a t i o n c h a p t e r2 ：s t u d yo nt h ee c l b e h a v i o r so fs e v e r a ls u b s t a n c e sa n de s t a b l i s h m e n to f e c l a n a l y t i c a ls y s t e m s 1t h ee c lb e h a _ d o ro fn - ( 4 - a r n i n o b u t y l ) - n - e t h y l i s o t u m i n o t ( a b e l ) w a ss t u d i e d a n df o u n da b e lc o u l d p r o d u c e e m i s s i o nl i g h tw h e no x i d i z e da ta + 1 ，0v f v sa g a g c i ) p o t e n t i a l i na l k a l i n es o l u t i o n t h ea d d i t i o no fh 2 0 2m a r k e d l yi m p r o v e dt h ee c l s e n s i t i v i t y t h ee f f e c t e d f a c t o r s 鼹t h ee c lw e r ee x a m i n e d + u n d e r o p t i m a lc o n d i t i o n s a b e it o o kal i n e a rr e s p o n s et oe c l i n t e n s i t yi nt h er a n g eo f1 3 x 1 0 6 6 5 x i 0 2 m o l l t h e d e t e c t i o n l i m i t i s 2 2x 1 0 。恺m o l l a t as i g n a l t o n o i s er a t i o o f 3 2t h ec a t a l y t i cr e a c t i o no ff e r r o c e n e c a r b o x y t i ea c i d ( f c a ) t ol u m i n o la n d h y d r o g e np e r o x i d ew a si n v e s t i g a t e d i tw a s f o u n dt h ec h e m i l u r n i n e s c e n ti n t e n s i t yo f 了 a b s t r a c i l u m i n o lw i t hh y d r o g e np e r o x i d ec a l l b e g r e a t l ye n h a n c e db ye l e c t r o c h e m i c a l l y o x i d i z i n go f f c aa tl o wp o t e n t i a li n i r i sb u f f e rs o l u t i o n u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s t h ee c l i n t e n s i t ye x h i b i t sag o o d l i n e a rr e s p o n s ew i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f f c a i nt h e r a n g e o f 5 0 x 1 0 9 2 0 x 1 0 毒m o l l t h e d e t e c t i o n l i m i t i s l 5 x 1 0 g m o l l 3a s t u d y o nt h ee c lo f a c r i d i n u me s t e r s i n c l u d i n g 1 0 - 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