（分析化学专业论文）单分子水平上核酸适体构象变化及量子点的成像研究.pdf

硕l ：学位论文 摘要 单分子检测能实时监测单分子行为和分子间相互作用，可揭示集团平均掩饰下的静 态不均一和动态波动等个体差异性，已在分子构象变化、生物分子相互作用和超灵敏检 测等方面得到广泛应用。本文基于全内反射荧光显微术( t i r f m ) ，在单分子和单颗粒 水平上对核酸适体( a p t a m e r ) 的构象变化以及量子点成像进行了研究，主要包括： 1 在单分子水平研究表面固定的核酸适体的构象变化。在三磷酸腺苷( a t p ) 核酸 适体的5 端标记生物素和荧光基团四甲基罗丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) ，3 端标 记猝灭基团d a b e y l 。利用生物素和亲和素相互作用，将a t p 核酸适体固定在玻片表面。 基于t i r f m 考察了核酸适体分子在a t p 或c d n a 作用下的荧光强度变化。结果表明， 无a t p 和c d n a 时，核酸适体分子荧光强度较弱，大多数处于闭环状念，少数处于无 规则卷曲状念。在a t p 作用下，无规卷曲状态的核酸适体分子变成闭环状态，荧光强度 下降。在c d n a 作用下，核酸适体分子变为双螺旋状态，荧光强度显著升高。而在c d n a 和a t p 同时存在下，随着a t p 浓度的增加，核酸适体分子由双螺旋状态转变为闭环状 态，荧光强度下降。本研究对发展基于核酸适体的生物传感器具有参考价值。 2 利用单分子成像发展了基于量子点标记核酸适体的高灵敏蛋白质检测方法。目标 蛋白凝血酶有两个核酸适体，结合位点办不相同。本文将其中一条核酸适体通过生物素 和亲和素的相互作用固定在玻片表面，另一条标记有量子点或荧光染料t m r 。凝血酶 与固定在玻片上的核酸适体以及荧光标记的核酸适体形成“三明治”结构，通过t i r f m 测定荧光信号。结果表明，以量子点为荧光标记，凝血酶检测的线性范围为0 1p m 到 1 0p m ，检测下限达到6 0f m 。以t m r 为荧光标记，凝血酶检测的线性范围为5p m 到 9 8p m ，检测下限为2 8p m 。可见，相比于t m r ，以量子点为荧光标记的检测下限降低 了4 7 倍。这归因于量子点的高摩尔吸光系数和强光稳定性等优越的光学特性。 3 基于单颗粒成像，研究了水溶性氨基化c d t e 量子点与1 丁基3 乙基咪哗四氟硼 酸盐离子液体( 【b e i m b f 4 ) 作用后单个颗粒荧光性质变化。结果表明，量子点刚进入 离子液体时，由于脂溶性离子液体的保护，量子点荧光强度和抗光漂白性能增强；随着 与离子液体作用时间的延长，量子点闪烁现象变得明显，荧光强度和抗光漂白性能都有 所减弱。红外光谱、荧光光谱以及量子点与n a b f 4 溶液作用的结果表明，量子点闪烁现 象、荧光强度和抗光漂白性能的变化可能是由于b f 4 结合到了量子点颗粒表面，并对量 子点产生了刻蚀作用，使量子点的表面缺陷增加。本工作有助于了解离子液体与量子点 的相互作用机理。 关键词：单分子检测；核酸适体；量子点；凝血酶；全内反射荧光 单分子水平上核酸适体构象变化及量子点的成像研究 a b s t r a c t t h es i n g l e m o l e c u l eb e h a v i o r a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm o l e c u l e sc a nb e r e a l - t i m em o n i t o r e d b ys i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n ( s m d ) t ou n v e i l m o l e c u l a r p r o p e r t i e so ft h es t a t i ci n h o m o g e n e i t i e sa n dd y n a m i cf l u c t u a t i o n s ，a n dt h em o l e c u l a r p r o p e r t i e s a r eh i d d e ni n a v e r a g e de n s e m b l e s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o nh a sb e e n w i d e l yu s e di nt h em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e ，b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sa n d u l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o na n ds oo n i nt h i sp a p e r , b a s e do nt o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o n f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( t i r f m ) ，t h ea p t a m e r sc o n f o r m a t i o nc h a n g ea n dq u a n t u m d o t si m a g i n gw e r es t u d i e d ，i n c l u d e ： 1 t h ec o n f i g u r a t i o nc h a n g eo fa p t a m e r sf i x e do ns l i d ew a ss t u d i e da tt h es i n g l e m o l e c u l el e v e l t h ea d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( a t p ) a p t a m e r sw e r el a b l e dw i t h f l u o r o p h o r et e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ( t m r ) a n db i o t i na t5 e n d ，q u e n c h e rd a b c y la t3 e n d t h ea p t a m e r sw e r ef i x e do nt h es l i d ew i t ht h ei n t e r a c t i o no fb i o t i na n da v i d i n b a s e do nt i r f m ，t h ea p t a m e r sw e r es t u d i e di nt h ep r e s e n c eo fa t po rc d n a t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw i t h o u ta t pa n de d n a ，f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h ea p t a m e r sw a s w e a k ，a n dt h em a j o r i t yo ft h ea p t a m e r sw e r ec l o s e d l o o p ，a n daf e wo fa p t a m e r sw e r e r a n d o mc o i l i nt h ep r e s e n c eo fa t p , a p t a m e r sc h a n g e di n t oc l o s e dl o o pf r o mr a n d o m c o i l ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c l i n e d i nt h ep r e s e n c eo fe d n a ，t h ea p t a m e r s f o r m e dd o u b l eh e l i x ，a n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n c r e a s e d i nt h ep r e s e n c eo fe d n a a n da t p , w i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so fa t p i n c r e a s e d ，t h ea p t a m e r sc h a n g e di n t oc l o s e d l o o pf r o md o u b l eh e l i x ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c l i n e d t h em e t h o dp r o v i d e s ar e f e r e n c et od e v e l o pt h eb i o s e n s o r sb a s e do na p t a m e r 2 t h em e t h o df o rt h eu l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fp r o t e i nw a sd e v e l o p e db y q u a n t u md o t sl a b e l e da p t a m e r sw i t hs i n g l e m o l e c u l ei m a g i n g t h r o m b i na st a r g e t p r o t e i nh a st w oa p t a m e r s ，a n dt h eb i n d i n gs i t e sa r ed if f e r e n t i nt h i sp a p e r , a na p t a m e r w a sf i x e do ns l i d ew i t ht h ei n t e r a c t i o no fb i o t i na n da v i d i n ，a n da n o t h e ra p t a m e rw a s l a b e l e dw i t hq u a n t u md o t so rt m r s a n d w i c ha s s a yw a sf o r m e db yt h r o m b i na n dt h e a p t a m e rf i x e do nt h es l i d ea n dt h ef l u o r e s c e n t - l a b e l e da p t a m e r , a n dt h e nd e t e c t e dt h e f l u o r e s c e n c es i g n a lb yt i r f m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu s i n gt h eq u a n t u md o t sa s f l u o r e s c e n tl a b e l i n g ，t h el i n e a rr e l a t i o n s h i pf o rt h r o m b i nd e t e c t i o nw a so b t a i n e di nt h e r a n g eo f0 1 t o10p m ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tr e a c h e d6 0 f m u s i n gt m ra s f l u o r e s c e n tl a b e l i n g ，t h el i n e a rr e l a t i o n s h i pf o rt h r o m b i nd e t e c t i o nw a so b t a i n e di nt h e r a n g eo f5t o9 8p m ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s2 8p m s o ，c o m p a r e dt ot h et m r ， q u a n t u md o t s c a nd e c r e a s et h ed e t e c t i o nl i m i tt o4 7t i m e s i ti sa t t r i b u t e dt h e q u a n t u m d o t ss u p e r i o ro p t i c a lp r o p e r t i e so ft h el a r g em o l a ra b s o r p t i v i t y a n ds t r o n g p h o t o s t a b i l i t y 3 t h es i n g l e p a r t i c l e f l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so fw a t e r s o l u b l e a m i n o c d t e q u a n t u md o t st r e a t e dw i t h1 - b u t y l 3 e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ( b e i m b f 4 ) i o n i cl i q u i d sw e r es t u d i e dw i t hs i n g l e m o l e c u l ei m a g i n g q u a n t u md o t sw e r e e x t r a c t e d i n t ot h e i o n i c l i q u i d s ，t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f q u a n t u m d o t sa n d a n t i - p h o t o b l e a c h i n gw e r e e n h a n c e di n t h ef i r s th o u r , b e c a u s eo ft h ep r o t e c t i o no f h v d r o p h o b i c i o n i c l i q u i d s t h e n ，t h e b l i n k i n g b e c a m e a p p a r e n t a n d a n t i p h o t o b l e a c h i n gc a p a c i t y d e c r e a s e dw i t ht h et i m e i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dt h er e s u l t so fq u a n t u md o t st r e a t e dw i t hn a b f 4 s o l u t i o n s h o w e dt h a tt h ec h a n g e so fb l i n k i n ga n da n t i p h o t o b l e a c h i n gm a y b ed u et ot h eb f 4 。 b i n d i n gt ot h es u r f a c eo fq u a n t u md o t sa n dt h eb f 4 。e t c h e sq u a n t u m d o t s ，w h i c hl e a dt o t h ei n c r e a s eo fs u r f a c ed e f e c t so fq u a n t u md o t s t h i sw o r ki sc o n t r i b u t e dt oi n v e s t i g a t e t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fq u a n t u md o t sa n di o n i cl i q u i d s k e yw o r d s ：s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n ；a p t a m e r ；q u a n t u md o t s ；t h r o m b i n ；t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c e i v 本文常用英文缩略词表 缩略词 中文名称 缩略词 中文名称 a b a 三磷酸腺苗核酸适体 a t p b s a c a c d n a d n a e d a c 三磷酸腺苷 牛血清白蛋白 巯基乙胺 互补脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸 l 乙基3 - ( 3 一二甲基氨丙基) 碳 二亚胺盐酸盐 e m c c d 电子倍增电荷耦合器件 f i t c f r e t g f p i l s 异硫氰酸荧光素 荧光共振能量转移 绿色荧光蛋白 离子液体 n h s p b s p d m s p e p m t q d s s a t r i s t g a t b a t l r f t m r u v v i s n 羟基琥珀酰弧胺 磷酸缓冲液 聚二甲基硅氧烷 藻红蛋白 光电倍增管 量子点 链霉亲和素 三羟甲基氨基甲烷 巯基乙酸 凝血酶核酸适体 全内反射荧光 四甲基罗丹明 紫外可见 硕上学位论文 第1 章绪论 单分子检测是指在单分子水平上对生物分子的构象变化、动力学、分子之间 相互作用以及对单个分子操纵的研究【l 2 】，是分析化学的最低检测限和最终追求目 标1 3 j 。单分子检测能够提供传统的宏观测量方法得不到的分子在微环境中的个体信 息，并实现目标的高灵敏检测。单分子检测方法是2 0 世纪8 0 年代发展起来的， 检测灵敏度达到单分子水平的一系列高灵敏检测技术，主要有扫描探针技术【4 】和光 学成像技术【5 j 。光学成像技术由于具有非离子低能量辐射、高敏感性等优点，可实 现实时监测和无创伤检测，已成为单分子检测研究中最常用的方法。 1 1 单分子光学成像概述 1 1 1 单分子光学成像的研究目的 对分析化学和生命科学中有关分子事件和相互作用的认识，大部分是基于所 有的分子在特定时间内以完全相同的方式运动这一种假设作为自 提的集团平均水 平的结果，而集团平均研究有两个缺点：一是动态不整，其原因在于分子所处介 质是非均相。二是静态不整，其原因是分子的分子量或所处的状态不同。而单分 子研究，避免了这些缺点，因为它可以得到单个分子的分布状态，通过分析其分 布情况的峰形和峰位得出分子所处的状态，或者追踪单个分子的运动情况，再综 合分析各个分子的相似性和差异性等，进而得到分子的动力学信息【6 1 。故单分子成 像至少可以进行以下三个方面的研究【7 】： 1 、可以实时监测分子的运动：用荧光标记的方法实时记录分子的动态变化和 动力学过程，如大分子的定位、运动轨迹等。 2 、可以揭示集团平均所覆盖的分子特征：单分子研究可以区分不同分子处于 单线基态、单受激态和最低三重态三种电子态，而不是集团平均中的不合理平均。 如单个量子点颗粒的闪烁现象，是集团平均所不能反映的。 3 、可以反映异质微环境：大分子在非均质系统环境( 如界面和细胞环境) 中 活动时，单分子研究有可能把分子在异质微环境的行为明显地揭示出来。以细胞 为例，上面有脂质的“筏”和蛋白质的“篱笆”，膜上蛋白质分子或脂质分子的活 动是跳跃的，而不是通常溶液情况下的布朗运动。 通过单分子成像可以探测微观物理量的分布和时间轨迹信息，因此单分子成 像迅速成为分析化学，生物化学等领域中的研究热点。 1 1 2 单分子光学成像的条件 用光学方法探测小到纳米尺度且不断运动的目标物，要求信号一定要超过来 自高散射环境的噪音，则必须具备以下三个特征： 单分了水，fi ：核酸适体构象变化及量了点的成像研究 1 、增强信号：增强信号的主要方法有四种：( 1 ) 从信号分子而言，可以通过 增大荧光物质的摩尔吸光系数以及荧光量子产率来提高成像的信号。常用的荧光 物质有：有机荧光染料类，如罗丹明，青色素等。有机染料量子产率高，发光 强度大，标记方法成熟，但是容易光漂白；荧光纳米颗粒：如量子点等。量子 点光谱可调，稳定性好，抗光漂白能力强，适于单分子的示踪，但无法用于需通 过荧光共振能量转移来观测单分子相互作用和反应的研究；自荧光蛋白，如绿 色荧光蛋白等。自荧光蛋白是目前唯一的一类内源性标记物，但自荧光蛋白发射 团成熟时间长，其基团较大，可能影响所标记分子的构象和行为。( 2 ) 采用激光 作为激发源，提高激发光的单色性和激发光强度。( 3 ) 增大信号采集效率，减少 信号的损失，如采用高效的集光光学元件及高量子效率的探测器。( 4 ) 电子放大 技术：如单光子计数的雪崩光电二极管( a p d ) 、电子倍增电荷耦合器件( e m c c d ) 和增强型电荷耦合器件( i c c d ) 等，可以使探测效率达到5 ，收集单个分子的 微弱信号。 2 、降低背景噪声：最大限度地降低背景噪声是实现单分子成像的重要手段之 一。背景噪声主要来源于拉曼和瑞利散射；溶液，玻璃，光学元件的杂质荧光以 及检测器的暗电流。因此，降低背景的主要方法有。三种：( 1 ) 采用新的成像原理， 如全内反射和共聚焦等，减小激发体积以极大地降低来自溶液及活细胞内部高散 射环境和杂质荧光的干扰。( 2 ) 改进仪器性能，采用冷却型的低暗电流的探测器 和高效的光学元件( 如滤光片等) ，以滤掉杂散光，减少噪声的干扰。( 3 ) 对于成 像用的溶液，玻片等器材进行预漂白处理。 3 、提高分辨率：单分子成像的分辨率包括时间和空间分辨率。为取得单分子 信息，应具有更高的时间分辨率：可采用新型检测器，如用i c c d 快速照相时， 每秒可获得约2 0 0 帧的二维图像( 即约5m s 可拍摄一幅图像) 。获得能分辨和识 别纳米尺度分子的空间分辨率，主要方法有：( 1 ) 利用去卷积技术即点扩散原理 获得点光源的高分辨定位。( 2 ) 提高数值孔径n a 值，数值孔径与分辨率成正比。 采用油镜和高数值孔径的物镜( 可达1 6 5 ) 可提高空间分辨率。( 3 ) 采用体积限 域的成像方法，如消失波只激发距离界面约1 0 0n m 的深度，共聚焦技术则只对于 共焦面进行成像。 1 1 3 单分子判定方法 对于所观测到的光学信息，单分子的判据主要有以下几种瞵 9 】： ( 1 ) 检测到的荧光分子数与溶液浓度成线性关系：在忽略不同区域的溶液浓 度的差异性和基底表面性质的差异的前提下，溶液中样品浓度与分子吸附在基底 表面密度成比例关系。在样品浓度很稀时，单分子成像所检测到的基底表面荧光 点为单个分子。故所检测到的分子个数与样品溶液浓度存在线性关系。 ( 2 ) 一步光漂白：光漂白是荧光染料分子受激发发生化学反应而不再发射荧 2 硕i ：学位论文 光的现象。一个染料分子受光激发后发荧光或者不发荧光，过程是一步完成的。 故一步光漂白是染料单分子荧光的特征。 ( 3 ) 光潜扩散：单个分子发射光谱与分子结构有关，分子结构的波动会导致 发射光谱的变化。故光谱扩散是单分子性质的另一个特征。 ( 4 ) 偏振、单偶极发射：固定在基底表面的荧光分子，其激发和发射具有特 定的偶极取向。分子特定的偶极发射使其具有特定的偏振。因此特定的偏振方向 是单分子的又一特征。 除此之外，单分子的判据还有：同种荧光团的强度分布呈泊松或正态分布； 分子荧光斑点大小受衍射极限影响；分子光漂白时间的半衰期与照射强度成反比 等。 1 2 单分子光学成像技术 传统光学方法无法达到很高信噪比和高分辨率，因此发展了各种新的单分子 光学成像技术。这些单分子光学成像技术主要包括全内反射荧光显微术( t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , t i r f m ) 【l0 1 、激光扫描共聚焦显微术 ( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y , l s c m ) f 】、近场扫描光学显微术( n e a r f i e l d s c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p y , n s o m ) 【12 1 、荧光校正光谱( f c s ) 1 3 , 1 4 】、表面增强 拉曼光谱( s e r s ) 【”1 、表面等离子共振( s p r ) 【1 6 】等。前三种技术在单分子检测 领域应用得最为普遍。下面主要介绍这三种单分子成像技术的原理及其发展历史 等。 1 2 1 全内反射荧光显微术 全内反射荧光显微术是基于消失波激发的光学成像原理，通过减小激发体积 从而减少来自于液体分子的拉曼散射和非焦平面的荧光发射的背景干扰，使其具 有较高的信噪比，是单分子光学检测中应用最广泛的技术。 1 全内反射荧光显微术的历史 全内反射荧光显微术的提出应该追溯到2 0 世纪8 0 年代早期，a x e l r o d 等生物 物理学家描述了t i r f m 的基本原理并探索了其生物应用 1 7 , 18 】，但是要寻找能够在 活细胞中充当荧光标记物的分子非常凼难并且t i r f m 的实现并不容易。直到2 0 世纪9 0 年代，随着绿色荧光蛋白分子及其衍生物等荧光标记物的发现和新型物镜 透镜、聚光镜和超灵敏探测器的出现，t i r f m 才得以充分发展。19 9 5 年，f u n a t s u 等人首次使用t i r f m 直接观察到溶液中单个荧光染料分子和单个a t p 的转换【侈】。 目前，t i r f m 已广泛用于生命科学研究，特别在单分子检测中更显示其强大的生 命力。 2 全内反射荧光显微术的原理 ( 1 ) 全内反射原理 单分子水甲上核酸适体构象变化及量子点的成像研究 如图1 1 ( a ) 所示，当一束平面光波从光密介质1 入射到光疏介质2 时，入射光 在界面处发生光的反射和折射，入射角和折射角满足斯涅尔定律( 折射定律) ： n l s i n 0 1 = n 2 s i n 0 2 ( 1 1 ) 其中0 l 为入射角，0 2 为折射角，n i 是介质l 的折射率，n 2 是介质2 的折射率。 定义当折射角0 2 为9 0 0 时的入射角为临界角0 c ，此时发生全内反射。 0 c = s i n _ ( n 2 n 1 ) ，0 2 = 9 0 0 ( 1 2 ) 当入射角继续增大，光波不再折射入光疏介质2 ，但仍有少部分光的能量以电 磁辐射形式穿过界面渗透到光疏介质2 中，并平行于界面传播，这部分电磁场称 为“消失波” 2 0 1 。 ( 2 ) 消失波 消失波的频率与入射光频率相同，在光疏介质2 中其强度随离丌界面的垂直 距离呈指数衰减，如图1 1 ( b ) 所示。假设一束单色光，其波长是九，横截面光束强 度是i i ，以0 i ( e i 0 c ) 从介质1 入射到介质2 ，其透射层横截面光束强度i ( z ，o i ) 为 i ( z ，o i ) = i ie x p ( 一z d p ( o i ) ) ( 1 3 ) z 是离开界面的距离；d p ( o i ) 是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减到分 界面处数值l e 的处的距离。渗透深度d p ( o i ) 是入射角及相对折射率的函数，公式 如下 d p ( 0 i ) = v ( 4 7 c n l ( s i n 2 0 i 一( n 2 n 1 ) 2 ) 17 2 ) ( 1 4 ) 对于发生在玻璃与水溶液中的全内反射，玻璃的折射率大于水溶液，取玻璃 的折射率n l 为1 5 2 ，取溶液的折射率n 2 为1 3 3 ( 生物细胞的折射率范围是1 3 3 1 3 8 ) ，得到玻璃水溶液界面处的临界角0 c 为6 1 7 4 0 。对于可见光波长的激光光 束而言，其渗透深度1 0 0n m 。如图1 1 ( c ) 为波长分别为4 8 8n m 、5 3 2n m 、6 3 31 1 m 激光的渗透深度随入射角的变化。 卜 a i r e f l e c t i o n 图1 1 全内反射( t i r ) 示意图( a ) 不同激发波长下，消失波强度指数衰减曲线( b ) ，渗透深度 随入射角的变化曲线( c ) f i g u r e1 1 s c h e m a t i cd i a g r a mo ft o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o n ( t i r ) ( a ) e x p o n e n t i a la t t e n u a t i o nc u r v e o fe v a n e s c e n tw a v ei n t e n s i t yw i t hp e n e t r a t i o nd e p t h ( b ) a n dp e n e t r a t i o nd e p t hc u r v ew i t h i n c i d e n c ea n g l e ( c ) a td i f f e r e n te x c i t a t i o nw a v e l e n g t h s 4 硕上学位论文 消失波沿平行界面方向传播，在垂直界面方向则是一个指数衰减场。全内反 射显微成像是采用消失波激发，使其成像的视野丌阔，探测样品的厚度却很薄， 可以将背景噪声减小到较低的水平。 3 全内反射荧光显微术的仪器结构 全内反射荧光显微镜基本结构如图1 2 所示，主要包括激光光源、检测器、计 算机系统和传统显微镜四个组成部分。检测器一般采用高灵敏、快速检测成像 c c d ，如e m c c d 、i c c d 等。 全内反射荧光显微镜最为普遍的两种类型是：棱镜型和物镜型。 棱镜型全内反射显微镜如图1 2 ( a ) 所示，包括一个用来发生全内反射的棱镜。 激光以一定的入射角入射到棱镜上，在载玻片的表面发生全内反射，产生的消失 波激发接近棱镜表面的样品，发射出荧光。荧光信号由一个高数值孔径的物镜收 集，经过相应的成像放大系统，最后被探测器接收。棱镜型系统在仪器上相对容 易搭建；在探测上，受入射光的干扰比较小，但是样品的放置空间受棱镜限制。 a 棱镜型 镜 样品 消失波 盖玻片 镜油 荧光 激光光束 ： 油浸物镜 c c d + 图1 2 棱镜型( a ) 和物镜型( b ) 全内反射荧光显微镜结构示意图 f i g u r e1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fp r i s m t y p e ( a ) a n do b j e c t i v e t y p e ( b ) o ft i r f m 后来又发展了物镜型全内反射荧光显微成像方法，如图1 2 ( b ) 所示。在物镜型 全内反射显微镜中，显微镜的物镜有两种功能：收集样品荧光信号的接收器；作 为发生全内反射的光学器件。物镜型系统中样品的放置则非常方便，并且在对样 品的控制上可与多种其它技术相结合，例如光镊技术等，展现出更加诱人的生物 应用前景。 单分了水甲1 ：核酸适体构象变化及量了点的成像研究 但是对于物镜型全内反射荧光显微成像，由于细胞的典型折射率为1 3 3 1 3 8 ，因此要想实现全内反射，物镜的n a 必须大于1 3 8 ，表达式为 n a = n s i n 0 n s i n o c ( 1 5 ) n a 为物镜的数值孔径，n 、0 分别为物镜的折射率和孔径角。o c 为发生全内 反射的临界角。当使用n a 为1 4 的物镜时，只有很小的一部分物镜孔径范围( 1 4 1 3 8 = o 0 2 ) 可以被利用，这显然增加了光束校准的难度。如果使用n a 为1 6 5 的物镜，则有一个大得多的孔径范围( 1 6 5 1 3 8 = 0 2 7 ) 可被用来发生全内反射。 因此物镜型全内反射荧光显微成像都采用高数值孔径的油镜【2 1 1 。 4 全内反射荧光显微术的特点 全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之 一，是国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术之一，已在分子生物学、生 物化学及纳米材料等领域受到广泛关注。它具有以下优点： a 高信噪比：消失波只能激发很小体积的样品，使背景吸收很小。 b 较高的分辨率：消失波的渗透深度约l0 0n m ( 共焦显微术的照射深度约5 0 0 8 0 0n m ) ，使消失波只激发近表面溶液中的荧光物质，而达到较高的空间分辨率。 另外，可获得二维连续图像，时间分辨率也较高：最小曝光时问可达到几个毫秒， 可获得直观动态的监测图像。 c 光漂白性小：消失波强度随与玻片距离的增加而呈指数级别降低。 d 非侵入性，对分子和细胞等的损伤小，光破坏性小。 1 2 2 激光扫描共聚焦显微术 传统的光学显微镜成像时，标本上每一点的图像会受到邻近点的衍射或散射 光的干扰，这与传统的光学显微镜使用的场光源有关，激光扫描共聚焦显微镜针 对这一缺点设计了两个针孔。激光扫描共聚焦显微镜的原理是：利用激光束经照 明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点在探测针孔 处成像，并由探测针孔后的光电倍增管( p m t ) 或电荷耦合器件( c c d ) 逐点逐 线接收，得到高分辨荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的， 焦平面上的点分别聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔 处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了传统光学显微镜图 像模糊的缺点。 1 9 5 7 年，m a r v i nm i n s k y 第一次阐述了激光扫描共聚焦显微技术的基本工作原 壁j 2 2 , 2 3 】。后来，经过尼普科夫盘( n i p k o nd i s k s ) 针孔的设计【2 4 1 ，高数值孔径的透 镜的发展1 25 1 。到1 9 8 5 年，第一次成功地用激光扫描共聚焦显微镜演示了荧光标记 的生物材料的光学横断面【2 们。如今，激光扫描共聚焦显微技术已发展到了一个较 为成熟的阶段，z e i s s 、m e r i d i a n 、l e i c a 、o l y m p u s 、n i k o n 等多家公司研发出各种 型号的共聚焦显微镜产品，并广泛应用于生命科学研究中【27 1 。 6 硕士学位论文 激光扫描共聚焦显微镜基本结构比传统光学显微镜复杂，它除了包括传统光 学显微镜部分外，主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统( 包括数据 采集、处理、转换、应用软件) 和共聚焦系统( 如光学滤片、分光器、共聚焦针 孔及相应的控制系统) 等部分组成，如图1 3 所示。l s c m 有两个针孔：一个在照 明光源之前，另一个在检测器前方，光点通过一系列的透镜最终可聚焦于光源针 孔和检测针孔，即“共聚焦”。并且采用单色激光作为光源，经过针孔使光源成为 点光源。其点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时问相干 性及平面偏振激发等独特的优点。以点光源对样品进行逐点扫描，可得到清晰的 整幅焦平面的图像，还可通过对样品进行左右、上下扫描以获得厚标本( 可达4 0 0 “m ) 不同层面的图像，即类似c t 断层扫描的无损伤性连续光学切片。l s c m 以 逐点扫描的方式获得成像图片，影响了时问分辨率；并且扫描的每一层厚度为5 0 0 8 0 0n m ，相对t i r f m ( 1 0 0n m ) 而言，其空间分辨率较低。 激光 l 巍蕊。誊。 扫描仪一 榆测器 针窀 物镜 样品 图1 3 激光扫描共聚焦显微镜示意图 f i g u r e1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo fl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e 1 2 3 近场扫描光学显微术 传统光学显微镜由于成像用的镜头尺寸及镜头与样品间距远大于光波波长， 处于远场条件，受衍射极限的限制，在可见光范围内，其分辨率极限只能达到约 2 0 0n m 。近场光学是指光探测器及探测器与样品间距均小于辐射波长条件下的光 学现象，有效避免了光波动性质的干扰，其空问分辨率达到2 0 5 0n m ，接近于电 子显微镜的高分辨率，但也兼具传统光学显微镜的优点。 1 9 8 4 年，b e t z i g 等制成用微管作探针的近场光学显微镜，标志着人类第一次 突破了光学显微镜的衍射极限【28 1 ，此后随着科学技术向小尺度与低维空问的推进 以及扫描探针显微技术的发展，光学领域中出现了“近场光学”这一新学科，并 7 单分了水i fi ：核酸适体构象变化及量了点的成像研究 广泛应用于各个领域【29 1 。1 9 9 3 年，b e t z i g 等使用近场光学显微镜获得了单个染料 分子图像【1 2 】。1 9 9 8 年，h u l s t 等使用基于切向力方法控制探针样品纳米间距的近 场光学显微镜获得了d n a 分子的清晰形貌图像和荧光图像【30 1 。此后在纳米和介观 尺度上，近场光学显微术被广泛应用于分析化学和生命科学等领域，为单分子研 究提供了极为灵敏的工具。 近场光学扫描显微镜的基本结构如图1 4 所示，包括四部分：( 1 ) 光纤探针： 用于发射或接受光子，探针的尖端在1 1 0 0r i m 之间。探针是近场光学扫描显微 镜的核心部分。( 2 ) 探针一样品间距的反馈控制系统：其主要功能是根据反馈信号 的变化来控制光纤探针的位置，使其保持在设定的高度上，并提供扫描时z 方向 的微调信息。( 3 ) 三维扫描控制系统：由压电陶瓷管和x 、y 、z 三维驱动器电路 组成，光纤探针固定在压电陶瓷管上以实现光纤探针的三维扫描。其中反馈、扫 描控制及信号处理系统与扫描隧道显微镜或原子力显微镜的控制方法相同。( 4 ) 信号采集及处理系统：利用光电倍增管等采集信号，并由计算机进行处理。 图1 4 近场光学显微镜的成像原理图【3 1 】 f i g u r e1 4p r i n c i p l ed i a g r a mo fn e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p e 3 q 但是近场光学显微镜也有一定的局限性，扫描范围小、扫描速度低；由于样 品中杂散光和溶液中纳米颗粒的干扰，较难获得重复可靠的图像；仪器的分辨率 及灵敏度主要取决于探针的质量以及反馈系统的定位准确性，由于所得图像是样 品和针尖的混合物，如探针尖锐程度不够，可能产生虚假、变形的图像，但过于 尖锐，则探针对光的耦合能力就会变弱，降低图像的分辨率。 1 3 单分子光学成像的研究进展 按作用层面来分类，单分子研究可分为四类：( 1 ) 单个分子及颗粒本身特性 的研究；( 2 ) 分子间相互作用行为的研究；( 3 ) 分子在固液或液液界面的行为；( 4 ) 分子与细胞的相互作用行为。 8 硕十学位论文 1 3 1 单分子及颗粒特性研究 探测并识别单个分子，进而实时监测分子的运动行为，研究分子动力学一直 都是科研工作者追求的目标【3 2 1 。随着纳米颗粒广泛应用于各个领域【3 3 , 3 4 】，单个纳 米颗粒的性质研究也成为最近几年研究的热点【3 5 , 3 6 】。单分子光学成像的高分辨率 为单分子和单颗粒研究提供了重要的手段。 1 单分子性质研究。f u n a t s u 等人用单个肌球蛋白亚片段( s 1 ) 探测了单个 a t p 的转换【”】。将单个s 1 分子用c y 5 标记后固定在石英表面，通过观察c y 3 标 记的单个a t p 分子在s 1 分子上的结合( 水解) 解离，探测到了a t p 的转换过程。 m o e r n e r 等利用t i r f m 和l s c m 研究了四种不同的绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 酚盐离子变异体的荧光闪烁和波动性质，并对比了两种 成像方法的特点【3 7 1 。l i 等基于电化学吸附实现单分子高灵敏检测【3 8 1 。作者以r 6 g 染料、标记a l e x af l u o r4 8 8 的羊抗大鼠免疫球蛋白以及r 6 g 标记的d n a 作为模 式分子，采用电化学吸附的方法把荧光分子富集在玻片表面的一定区域，再基于 t i r f m 检测玻片表面的荧光分子。其检测范围为：r 6 g 为5f m 到5p m ，羊抗大 鼠免疫球蛋白和d n a 均为3f m 到2p m 。 2 单颗粒性质研究。荧光纳米颗粒广泛用于生物标记。采用成像方法考察单 个荧光颗粒的光学性质如闪烁现象和抗光漂白性以及颗粒的表面修饰等将进一步 了解颗粒的性质【39 1 。t i a n 等利用丙烯酰胺与苯乙烯的聚合反应，合成了一种复合 物包裹茈衍生物的纳米颗粒，并考察了单颗粒性质，研究结果表明，此纳米颗粒 没有闪烁现象并具有荧光强度高和光稳定性强等优点【4 0 1 。s h u 等合成了一种具有 靶向潜能、高磁共振成像效率的磁性聚集颗粒g d c 8 2 0 6 ( o h ) 1 6 一( n h c h 2 c h 2 c o o h ) 8 ，并考察了颗粒的表面修