（生态学专业论文）斑节对虾血细胞免疫功能的流式细胞术研究.pdf

i i i ii ir il li lr l i iu lr ll y 181812 3 f l o w c y t o m e t r i ca n a l y s i so nt h ed e f e n c e f u n c t i o no fh a e m o c y t e sf r o mp e m a e u s m o n o d o n z l 埘gt i e j u n s p e c i a l t y ：e c o l o g y c o l l e g e c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s u p e r v i s o r p r o f e s s o rw a n ga n 。l i s u b m i t t e dd a t e ： m a y1 2 ，2 0 0 8 摘要 摘要 斑节对虾血细胞免疫功能的流式细胞术研究 专业： 申请人： 导师： 生态学 张铁军 王安利 斑节对虾免疫防御属于非特异性免疫，是由血细胞以及从血细胞释放到血 浆中的多种活性因子产生的，血细胞在斑节对虾的非特异性免疫防御反应中起 着主导作用。 流式细胞术分析细胞形态与功能时具有高通量、高精度、高效性、多参数 等明显的优势。根据细胞物理参数和荧光参数，利用流式细胞术( f c m ) 分析 斑节对虾( p e n a e u sm o n o d o n ) 血细胞的形态结构和免疫功能。在对血细胞进行 总数测定及分群与分选的基础上，检测了血细胞活性、血细胞吞噬活性、呼 吸爆发活性以及线粒体膜电位，研究了酵母聚糖对离体斑节对虾血细胞的大 小、活性和酯酶活性的影响，研究了脂多糖对离体斑节对虾血细胞的大小、 活性和酚氧化酶活性的影响，研究了改进的阿氏液和人工海水两种基质对离 体斑节对虾血细胞的活性、吞噬活性、血细胞内酯酶活性以及血细胞内自由钙 离子含量的影响。具体研究内容与结果如下： 利用流式细胞术、光学显微镜和相差显微镜区分鉴定了斑节对虾血淋巴液 中的三种类型血细胞：透明细胞，半颗粒和颗粒细胞。将区分出的三种血细胞 进一步分选，并分析了分选纯度。结合s y b rg r e e ni 染色和流式细胞仪的流速测 量斑节对虾血细胞总数( t o t a lh a e m o c y t ec o u n t s ) 。经碘化丙啶( p i ) 对血细胞染 色后用流式细胞术检测血细胞活性，结果表明收集于生理抗凝剂中的大部分血 细胞是活细胞( 9 5 ) 。在血细胞悬液中加入黄绿色荧光微球分析血细胞的吞 摘要 噬作用，实验结果表明斑节对虾的不同个体都有不同水平的吞噬能力，且三种 细胞的吞噬活性存在差异，这种吞噬作用可以被叠氮钠和细胞松弛素b 所抑制。 结合2 ，7 二氯氢化荧光素二乙酯( d c h f d a ) 标记和流式细胞术检测血细胞的 呼吸爆发活性，结果表明豆蔻酰佛波醇乙酯( p m a ) 可以刺激虾类血细胞的呼 吸爆发活性；钙调素拮抗剂( w 二1 3 ) 和一氧化氮合成酶抑制剂( n m m a ) 对血 细胞作用的实验数据显示，斑节对虾血细胞呼吸爆发过程是由h 2 0 2 而非n o 介导 的。根据3 ，3 - 碘化二已基羰花箐( 3 ，3 - d i h e x y l o x a e a r b o c y a n i n ei o d i d e ，d i o c 6 ( 3 ) ) 在线粒体基质中的积聚，检测血细胞线粒体膜电位。结果显示荧光密度和血细 胞的颗粒度相关。颗粒度高且颗粒大的细胞比颗粒度低且颗粒小的细胞具有更 高的荧光强度。血细胞荧光染色后在激光扫描共聚焦显微镜( l s m ) 下进行观 察时可以明显地判断出荧光的分布情况以及不同细胞的不同荧光强度。 斑节对虾血细胞与脂多糖及酵母聚糖的体外孵育实验表明：血细胞可以同 酵母聚糖的可溶性组分和脂多糖发生反应，引起细胞直径减小、细胞活性、酯 酶活性下降以及酚氧化酶活性的升高。实验过程中二乙基二硫代氨基甲酸酯 ( d e t c ) 可以抑制血细胞的这种变化，说明酚氧化酶( p o ) 参与了血细胞和酵 母聚糖的相互作用。胰蛋白酶抑制剂( t i ) 也可以抑制血细胞的这种变化，说明 酚氧化酶原激活酶( p p a ) 也参与了这种激活作用。 通过流式细胞术对被f l u o 3 标记的斑节对虾血细胞内钙离子含量检测的结 果表明：改进的阿氏液( m a s ) 和人工海水( a s w ) 处理后的血细胞中钙离子 的含量呈显著性差异，f l u o 3 阳性细胞分别为2 1 8 6 = 卜1 6 0 ，1 5 5 6 o 7 6 。 b a p t a w 可显著降低改进的阿氏液( m a s ) 和人工海水( a s w ) 处理后的血细 胞中钙离子的含量，而利他诺定则能显著提高，说明了斑节对虾血细胞和哺乳 动物一样，存在利他诺定受体。对m a s 组和a s w 组血细胞的多个参数比较的结 果表明：血细胞的吞噬活性、血细胞活性在a s w 组中是明显降低的。而酯酶活 性在a s w 组中更高。为两种基质的应用范围提供了理论参考。 关键词：斑节对虾血细胞免疫流式细胞术脂多糖酵母聚糖钙离子含 量 i i a b s t r a c t f l o wc y t o b e t rica n a l y sis0 nt h ed e f e n c e f u n c t10 n0 fh a e m o c y t e sf r o mp e m a e u sm o n o d o n a b s t r a c t m a j o r ：e c o l o g y n a m e ：z h a n gt i e - j u n s u p e r v i s o r ：w a n g a n - l i i ti sw e l l k n o w nt h a tt h ei m m u n er e s p o n s e si n d u c e db yi m m u n i z i n gs h r i m p sa r e m a i n l yt h en o n - s p e c i f i ch n m u n er e s p o n s e s i ti sc o m p o s e do fh a e m o c y t e sa n da c t i v e f a c t o r si no rr e l e a s e dt 莹o i i ih a e m o c y t e s h a e m o c y t e sa r em a i nf a c t o r si np e n a e u s t ， m o n o d o ni m m u n i t y f l o w c y t o m e t r y ( f c m ) h a s i t s a d v a n t a g e s ：h i g h - f l u x ，h i g h - p r e c i s i o n , h i g h - e f f i c i e n c ya n dm u l t i - p a r a m e t e r t h em o r p h o l o g ya n df u n c t i o n so fh a e m o c y t e s f i o mh a e m o l y m p ho ft h ep e n a e i ds h r i m p ，p e n a e u sm o n o d o nw e r ea n a l y z e db yf l o w c y t o m e t r yo nt h eb a s i so fc e l l u l a rs t r u c t u r e sa n di n c o r p o r a t i o no ff l u o r e s c e n tm a r k e r s o nt h eb a s i so fd e t e c t i n gt o t a lh a e m o c y t ec o u n t s ( t h c ) ，c l a s s i f i c a t i o na n ds o r t i n g h a e r n o c y t e sf r o mp e n a e u sm o n o d o n ，f o l l o w i n gr e s e a r c h e sw e r ec a r r i e do u t ：o c e l l v i a b i l i t y , p h a g o c y t i ca c t i v i t y , r e s p i r a t o r yb u r s ta c t i v i t y , a n dm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l ( m m p ) t l l ee f f e c t i v e o fz y m o s a nat oh a e m o c y t e sf r o mp e n a e u s m o n o d o ni nv i t r oi na s p e c to fc e l ls i z e ，c e l lv i a b i l i t ya n de s t e r a s ea c t i v i t y t h e e f f e c t i v eo f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) t oh a e m o c y t e sf r o mp e n a e u sm o n o d o ni nv i t r o i na s p e c to fc e l ls i z e ，c e l lv i a b i l i t ya n dp h e n o l o x i d a s e ( p o ) a c t i v i t y ( d t h ee f f e c t i v e o ft w om e d i a ( m a sa n da s w ) t oh a e m o c y t e sf r o mp e n a e u sm o n o d o ni nv i t r oi n a s p e c to f c e l lv i a b i l i t y , p h a g o c y t i ca c t i v i t y , e s t e r a s ea c t i v i t ya n di n t r a c e l l u l a r - f r e ec a 2 + e x t e n s i o n a lr e s e a r c h e sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s i i i a b s t r a c t i nt h es h r i m p s ，t h e r ea r et h r e et y p e so fc i r c u l a t i n gh a e m o c y t e s ( h y a l i n o c y t e s ， s e m i g r a n u l o c y t e s ，a n dg r a n u l o c y t e s ) i d e n t i f i e du s i n gt h em e t h o d so ff c m ，l i g h t m i c r o s c o p y , a n dp h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p y h a e m o e y t e sw e r ef u r t u r es o r t e da n dt h e p u r i t yw a sc h e c k e du s i n gl i g h tm i c r o s c o p y a n a l y s i so fh a e m o c y t e sa f t e rp r o p i d i u m i o d i d es t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tt h em a j o r i t yo fs h r i m ph a e m o c y t c sw e r ea l i v ea f t e r c o l l e c t e di n t h ep h y s i o l o g i c a la n t i c o a g u l a n t ( 9 5 ) t o t a lh a e m o c y t e sc o u n t s ( t h c ) o fp e n a e u sm o n o d o nc a nb ee v a l u a t e db ys y b rg r e e nia n df l o wr a t eo ff l o w c y t o m e t e r t h ep h a g o c y t i ca c t i v i t y l e v e lo fh a e m o c y t e sw a s a n a l y s e du s i n g f l u o r e s c e n tb e a d sa n dt h es h r i m ph a e m o c y t e ss h o w e dd i f f e r e n tp h a g o c y t i ca c t i v i t y w h i c hc o u l db ei n h i b i t e db ys o d i u ma z i d ea n dc y t o c h a l a s i nb d i f f e r e n tt y p e so fc e l l s h a v ed i f f e r e n tp h a g o c y t i ca c t i v i t y r e s p i r a t o r yb u r s ta c t i v i t y , w h i c hw a sm e a s u r e db y u s i n g2 ，7 - d i c h l o r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ( d c f h d a ) ，c a nh e s t i m u l a t e d b y p h o r b 0 1 - 12 m y r i s t a t e - 13a c e t a t e ( p m a ) ，a n dt h eo x i d a t i o np r o g r e s sw a sm e d i a t e db y h 2 0 2 ，n o tb yn i t r i co x i d e m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lw a sp r o b e da c c o r d i n gt o t h ea c c u m u l a t i o no fc y a n i n e d y e ，y , 3 - h i n e x y l o x a c a r b o c y a n i n ei o d i d e ，i n t h e m i t o c h o n d r i a lm a t r i xu n d e rt h ei n f l u e n c eo fi t t h ed a t as h o w e dt h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw a sd i r e c t l yc o r r e l a t e dt ot h ec e l lc o m p l e x i t y m o r eg r a n u l a rc e l l sd i s p l a y e d h i g h e rf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yt h a nl e s sg r a n u l a rh a e m o c y t e s d i f f e r e n tt y p e so fc e l l s s t a i n e dw i t hd i f f e r e n tf l u o r e s c e n t d y e sw e r ee x a m i n e db yu s i n gl a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p e ( l s m ) i ti so b v i o u st h a tt h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yi sd i f f e r e n t b e t w e e nd i f f e r e n tt y p e so fc e l l s d i s t r i b u t i o no ff l u o r e s c e n c eo fh a e m o c y t e sc a na l s o h eo b s e r v e d h a e m o c y t e sf r o mp e n a e u sm o n o d o ni n c u b a t e dw i t hl i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) a n dz y m o s a na ( z a ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tz aa n dl p sc a nt r i g g e rt h ee x o c y t o s i s a n da c t i v a t i o no fp r o p ot h a tc a nr e s u l ti nh e m o c y t el y s i s t h er e s u l t si nt h i ss t u d y s h o w e dt h a ts h r i m ph e m o c y t e sw e r er e a c t i v et ot h es o l u b l ef r a c t i o no fz aa n dl p s a ss e e nb yt h er e d u c t i o ni nc e l ls i z e ，c e l lv i a b i l i t ya n de s t e r a s ea c t i v i t y w h i l e ， p h e n o l o x i d a s ea c t i v i t yi n c r e a s e d t h er e d u c t i o ni n t h em a g n i t u d eo fc e l ls i z ea n d c o m p l e x i t yc h a n g ec a u s e db yd i e t h y d i t h i o c a r b a m a t e ( d e t c ) i n d i c a t e dt h a tp oi s i n v o l v e di nt h eh e m o c y t er e a c t i o nt oz a i nt h i ss t u d y , i n h i b i t o r ( t i ) i n d i c a t e st h a t p r o p h e n o l o x i d a s ea c t i v a t i n ge n z y m ei si n v o l v e di nt h ea c t i v a t i o nr e s p o n s e i v f l o wc y t o m e t r yh a sb e e nu s e df o rt h ef i r s tt i m et od e f i n et h ee f f e c to fc e l i i n c u b a t i o ni nm o d i f i e da l s e v e r ss o l u t i o n ( m a s ) a n da r t i f i c i a ls e a w a t e r ( a s w ) o n p e n a e i ds h r i m p ，p e n a e u sm o n o d o n ，h a e m o c y t e s t h ec o n c e n t r a t i o no fc a l c i u mi n h a e m o c y t e si ss i g n i f i c a n td i f f e r e n tb e t w e e nt w og r o u p s ( 2 1 8 6 4 - 1 6 0 a n d1 5 5 6 4 - o 7 6 ) t oe x p l o r ec a l c i u mh o m e o s t a s i s ，d i f f e r e n tc a l c i u mm o d u l a t o r sw e r et e s t e d t h ec a l c i u mc h e l a t o rb a p t a a m ( 1o m m ) r e d u c e ds i g n i f i c a n t l yt h ep e r c e n t a g eo f f l u o 一3p o s i t i v ec e l l si nb o t hm a sa n da s w i na d d i t i o n , r y a n o d i n e ( s m m ) i n d u c e da s i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to ft h ep e r c e n t a g eo ff l u o 3p o s i t i v ec e l l si nm a sa n di n a s w r e s u l t sm a ya l s oi n d i c a t et h ep r e s e n c eo far y a n o d i n er e c e p t o r ：t h i sc a l c i u m c h a n n e lh a sa l r e a d yb e e nr e p o r t e di nm a m m a l i a ni n f l a m m a t o r yc e l l s c e l lv i a b i l i t y , e s t e r a s e sa c t i v i t y , a n dp h a g o c y t i ca c t i v i t yw e r ef u r t h e ra n a l y s e d p h a g o c y t i ca c t i v i t y a n dc e l lv i a b i l i t yw e r es i g n i f i c a n tl o w e ri na s w , a n de s t e r a s e sa c t i v i t yi ss i g n i f i c a n t h i g h e ri na s w w h e ns e l e c t i n gb e t w e e nt h e s et w om e d i a , r e s e a r c h e r sc a n r e f e rt ot h e r e s u l to ft h i se x p e r i m e n t k e yw o r d s ：p e n a e u sm o n o d o nf l o wc y t o m e t r yd e f e n c ef u n c t i o no fh a e m o c y t e s l i p o p o l y s a c c h a r i d ez y m o s a nac o n c e n t r a t i o no fc a l c i u m i o v 目录 目录 第一章流式细胞术在无脊椎动物研究中的应用1 1 1 流式细胞术及其基本原理1 1 1 1 流式细胞仪的基本参数1 1 1 2 流式细胞仪的工作原理2 1 2 对细胞内免疫活性分子的分析4 1 3 对软体动物细胞毒素的研究5 1 4 白介素对软体动物血细胞的作用一6 1 5 细胞表面抗原的分析8 1 6 细胞的分群和分选一9 1 7 流式细胞术分析细胞器及细胞的功能1 2 1 7 1 线粒体膜电位( m i t c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，m m p ) 1 2 1 7 2 血细胞吞噬活性1 4 1 7 3 呼吸爆发活性( r e s p i r a t o r y b u r s ta c t i v i t y ，r b a ) 1 4 1 8 检测细胞凋亡一1 5 1 8 1 线粒体膜电位( m m p ) 的检测1 6 1 8 2 光散射特性检测凋亡1 7 1 8 3 d n a 含最的检测1 8 1 8 4t u n e l 法1 9 1 8 5a n n e x i nv ( a v ) 分析1 9 1 8 6 c a s p a s e s 标记法2 0 1 8 7 流式细胞术检测细胞凋亡的比较2 l 1 9 细胞周期、染色体倍性以及d n a 含帚的分析2 2 1 1 0 细胞活性测定2 3 1 1 1 细胞内钙离子浓度测定一2 3 1 1 2 分析细胞对环境应激的反应一2 4 1 1 3 流式细胞术在水生无脊椎动物研究中的应用前景2 5 v i 目录 第二章利用流式细胞术对斑节对虾血细胞免疫功能的研究2 7 2 1 引言2 7 2 2 材料与方法一2 9 2 2 1 化学试剂2 9 2 2 2 斑节对虾及血淋巴的收集2 9 2 2 3 血细胞类型分析3 0 2 2 4 血细胞总数( t o t a lh a e m o c y t ec o u n t s ，t h c ) 的测定3 0 2 2 5 血细胞活性的测定3 l 2 2 6 细胞吞噬功能的测定3l 2 2 7 呼吸爆发。3 2 2 2 8 线粒体膜电位( m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，m m p ) 的测定3 3 2 2 9 统计分析一3 3 2 3 结果3 4 2 3 1 血细胞类型分析3 4 2 3 2 血细胞总数( t o t a lh a e m o c y t ec o u n t s ，t h c ) 3 6 2 3 3 血细胞活性3 8 2 3 4 吞噬活性3 8 2 3 5 呼吸爆发活性4 6 2 3 6 线粒体膜电位( m m p ) 的测量5 0 2 4 讨论5 0 第三章流式细胞术研究酵母聚糖对斑节对虾血细胞的影响5 5 3 1 引言5 5 3 2 材料与方法5 6 3 2 1 化学试剂5 6 3 2 2 酵母聚糖悬液的制备5 6 3 2 3 斑节对虾及血淋巴的收集5 7 3 2 4 反应混合液的制备5 7 3 2 5 细胞大小的测定5 8 3 2 6 血细胞活性的测定5 8 3 2 7 非特异性酯酶活性的测定5 8 v l i 目录 3 2 8 流式细胞仪分析j 5 8 3 2 9 统计分析5 9 3 3 结果5 9 3 3 1 血细胞大小的变化5 9 3 3 2 血细胞活性6 2 3 3 3 血细胞的f d a 阳性率( 酯酶活性) 6 3 3 4 讨论一6 6 第四章脂多糖对斑节对虾血细胞影响的流式细胞术研究6 9 4 1 引言一6 9 4 2 材料与方法7 0 4 2 1 化学试剂一7 0 4 2 2 斑节对虾及血淋巴的收集7 0 4 2 3 反应混合液的制备7 l 4 2 4 细胞大小的测定7 l 4 2 5 血细胞活性的测定7 2 4 2 6 流式细胞仪测定血细胞的物理和荧光参数7 2 4 2 7 酚氧化酶活性测定7 2 4 2 8 统计分析7 3 4 3 结果7 3 4 3 1 血细胞人小的变化7 3 4 3 2 血细胞活性一7 8 4 3 3 酚氧化酶活性测定7 8 4 4讨论7 9 第五章流式细胞术研究斑节对虾血细胞内自由钙离子8 l 5 1 引言8 1 5 2 材料和方法一8 2 5 2 1 化学试剂一8 2 5 2 2 斑节对虾及血淋巴的收集8 2 5 2 3 斑节对虾血细胞吞噬活性8 3 5 2 4 血细胞活性测定8 3 v i i l 目录 5 2 5 酯酶活性的测定8 4 5 2 6 血细胞内自由钙离子的检测8 4 5 2 7 流式细胞术分析血细胞物理、荧光参数8 4 5 2 8 统计分析8 4 5 3 结果8 5 5 3 1 血细胞吞噬活性8 5 5 3 2 血细胞活性8 6 5 3 3 酯酶活性8 6 5 3 4 钙离子含量的测量9 0 5 4 讨论9 0 总结与展望9 3 缩略词表9 6 参考文献9 8 致谢11 0 第一章流式细胞术在无脊椎动物研究中的应用 第一章流式细胞术在无脊椎动物研究中的应用 1 1流式细胞术及其基本原理 流式细胞术( f l o wc y t om e t r y ，f c m ) 是一项新型的、发展迅 速的分析技术，是集激光技术、光电测量技术、计算机技术、 流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体 的新型高科技细胞分析技术。 流式细胞术为细胞群体提供了特殊和详细的分析。进行流 式细胞术分析时，激光束照射在流经鞘液孔的单个细胞或颗粒 上。在激光的照射下，细胞或颗粒产生散射光信号或( 和) 荧 光信号，信号被电子系统检测后转换为数据。这些数据反映了 不同的细胞特征以及细胞不同组分的含量。因此，通过流式细 胞术将很容易获得单个细胞的多个参数。它能快速、灵敏地对 细胞或亚细胞进行定性和定量分析，并且由于应用了荧光技术， 流式细胞术在水生生物营养免疫学领域中的应用也越来越广 泛。随着新的高效特异荧光染料和探针的出现，流式细胞术在 水生无脊椎动物研究中的应用也将越来越广泛。 1 1 1流式细胞仪的基本参数 1 散射光信号：分为前向角散射光( f o r w a r ds c a t t e r ，fsc ) 和侧向角散射光( si d es c a t t e r ，ssc ) 。前向角散射与细胞的直径 密切相关，检测细胞的大小。侧向角散射又称9 0 0 散射光，侧向 散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，检测细胞内 精细结构和颗粒的复杂程度。 2 荧光信号：利用荧光标记物对待检的目标成分进行标 记，受激发光照射产生荧光，通过对这类荧光信号的检测和定 量分析，就能对细胞的结构和功能进行研究分析。 华南师范大学硕士学位论文 1 1 2流式细胞仪的工作原理 经荧光染料标记过的细胞样品制成单细胞悬液，与鞘液混 合后以一定的流速经过喷嘴，液流经过光源发出的激光形成的 聚焦区，标记的荧光染料在激发光的激发下发射出特定的荧光 信号和散射光信号，信号的强弱与细胞内待测组分的含量呈正 比。荧光信号和散射光信号经过光电倍增管和光电探测器接收 后转换成电脉冲，送入计算机处理，应用不同的分析软件可分 析样品的各种参数，最后以直方图或散点图等形式显示出来。 此外，还可以对所分析的细胞进行双重或多重标记，以获得多 参数的数据。 近年来，越来越多的研究者利用流式细胞术在不同的领域 内做了大量的分析。流式细胞术对基础细胞生物学以及临床医 学的研究产生了巨大的影响。流式细胞术可研究单个细胞或颗 粒( 包括细胞核、微生物、染色体) 的物理特性和荧光特性。 利用流式细胞术可检测细胞或颗粒的物理参数，如细胞大小( 利 用f sc ) 以及颗粒度( 利用ssc ) 。荧光染料可以同细胞内不同 的组分进行结合，如细胞内的d n a 或r n a 。此外，连有荧光染 料的抗体可以同细胞表面受体或细胞内抗原进行特异性结合。 荧光标记的细胞通过流式细胞仪内的激光束时，荧光分子被照 射，电子跃迁，处于激发态。当荧光分子由激发态还原为基态 时，便发射出波长比激光更长的荧光，此荧光即可被流式细胞 仪的电子系统检测，从而获得颗粒的荧光参数。对细胞或颗粒 进行多荧光染料的染色，可方便我们同时研究细胞或颗粒的多 个参数。通常采用的荧光染料有碘化丙啶( p r o p i d i u mi od i d e p i ) 、藻红蛋白( p h y c oe r y t h r i n ，pe ) 、荧光素( f l u o r e s c e i n ) 。 荧光染料的激发波长以及用途决定了我们对荧光染料的选择。 表1 1 中列举出了流式细胞术中常用的荧光染料。流式细胞术可 分析单个细胞或颗粒的物理和荧光参数，因此，可以利用流式 细胞术将细胞或颗粒分群。同时，流式细胞术可检测直径小至 数微米的颗粒的物理或荧光特性。流式细胞术具有高效性，可 在短时间内检测到大量细胞或颗粒的参数。 2 第一章流式细堕查垄垂塑堡垫塑翌窒! 竺壅旦 _ 一 t h f l ：h r o m e s t a b l e l - i t h em a j o rl l u o r o c n r o m a p p l , ：, “, , “, + ；n n f n r f r m h o e c h s t3 3 3 4 2 3 5 5 4 6 5 紫外激光器 。”“”一 p r o p i d i u m 5 3 0 6 1 5 氩者莩嚣1 光器 dna标记io d i d e 岫一 瓮r i d i 竺 4 9 0 6 4 0 氩耆辈装l 光器 d n a 标记 u r a n g e c y 5 伽 ! ! 二 氢星遗登 兰竺竖一 3 华南师范大学硕士学位论文 对于一般的流式细胞仪而言，其检测颗粒或细胞的速度大约是 l0 0 0 个s ，且可同时检测5 个参数；对于级别较高的仪器而言， 其检测颗粒或细胞的速度大约是l0 0 0o 个s ，可同时检测10 到2 0 个参数。最后，我们可以利用流式细胞术通过细胞的物理参数 或荧光参数，从多细胞混合液中分选出高纯度的单一细胞。分 选出的细胞可用来进行细胞培养，或进一步进行分子生物学操 作，更全面、彻底地了解细胞的功能。 1 2对细胞内免疫活性分子的分析 水生无脊椎动物中免疫活性分子的研究比较广泛，如 a s t e r i a s 加r b e s i ( b e c ke ta 1 ，19 91 ) 、b i o m p h a l a r i ag l a b r a t a ( o u w e m i s s i o u k e m b o y e r e t a 1 ，19 9 4 ) 、p e n a e u sv a n n a m e i ( z h a n ge ta 1 ，20 0 6 ) 、m y t i l u se d u l i ( h u g h e se ta 1 ，199 0 ；l9 9l ； p a e m a ne t a 1 ， 19 9 2 ；s t e f a n oe t a 1 ， 19 91 ) 、 m y t i l u s g n l l o p r o v i n c i a l i 3 ( 、o t t a v i a n ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 确c r a s s o s t r e ag i g a s ( l e l o n ge ta 1 ，20 0 7 ) 。常用的方法主要有免疫细胞化学、放射 性免疫测定等。 o t t a v i a n i 等( 19 90 ) 首次利用流式细胞术分析水生无脊椎 动物p l a n o r b a r i u sc o