（微生物学专业论文）蓝藻synechocystis+sppcc6803转抗菌肽cm4基因质粒的构建.pdf

南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 摘要 集胞藻s y n e c h o c y s t 括s p p c c 6 8 0 3 是一种单细胞蓝藻，在自养和异养条件下均 可以生长。它具有自然转化外源d n a 的能力，是一种良好的转基因材料。蓝藻 作为转基因受体系统和生物反应器，兼具微生物和植物的优点，因此开发蓝藻基 因工程受体细胞表达外源蛋白质既具有一定的理论意义，也具有一定的应用价 值；抗菌肽c m 4 是从中国家蚕蛹中分离到的具有最强生物活性的组分，由3 5 个氨 基酸组成。它具有广谱的抗细菌、真菌、病毒、原生动物和某些肿瘤的活性，并 对水产致病菌也有较强的抑杀作用。 本研究尝试以s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 作为转基因受体系统，构建相应的表 达质粒载体，将抗菌肽c m 4 在其中进行表达，拟用作水产饵料，起到“食一药” 合一的目的。这为解决防治水产品疾病和减少抗生素使用的矛盾提供一条有效的 途径，可获得巨大的经济效益和环境生态效益。 实验首先通过两次p c r 的方法得到抗菌肽c m 4 基因的完整序列，分别将c m 4 基因和带有转录终止信号的抗性标记q 插入到中间质粒p b s p p e t e 中p e t e 启动子 下游的多克隆位点处( m c s ) ，构建成含表达单元p c f 2 “启动子抗菌肽c m 4 基因一 抗性标记”的重组载体p b s p c n 。将表达单元p c ( 2 分别亚克隆到可复制载体质粒 和整合载体质粒中。用蓝藻可复制质粒p r l l 2 7 2 构建成可复制表达载体 p r l l 2 7 2 一p c l 2 ；通过p c r 的方法从集胞藻p c c 6 8 0 3 中扩增出s l r l 6 5 6 基因一段大约 1 1 k b 的同源片段s l ，酶切后将其插入到中间质粒p b s - p c f 2 中p e t e 启动子的上游， 构建成染色体整合载体p b s s 1 p c q 。 重组可复制表达质粒p r l l 2 7 2 一p c f 2 和染色体整合载体质粒p b s s l p c q 分别 自然转化单细胞蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ，通过壮观霉素抗性筛选，获得了 具壮观霉素抗性的转化藻株。经p c r 鉴定初步证实目的基因已经转入集胞藻中， 而且采用同源重组的方式比可复制质粒转化效率高，得到的转基因藻的稳定性也 较好。 关键词：s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ，抗菌肽c m 4 ，蓝藻转基因。 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y m c h o c y s t i ss p 、p c c 6 9 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 a b s t r a c t s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3i sau n i c e l l u l a rc y a n o b a c t e r i u mt h a ti sa b l et og r o w e i t h e ra u t o t r o p h i c a l l yo rh e t e r o t r o p h i c a l l yo ng l u c o s e i t san a t i v ec o m p t i t e n tc e l l a n dn a t u r a l l yt r a n s f o r m a b l eb ye x o g e n o u sd n a c y a n o b a c t e r i a ，a st h er e c e p t o ro f g e n e t r a n s f o r m i n gs y s t e ma n da st h eb i o l o g yr e a c t o r , s h o wm e r i t so f m i c r o b ea n d p l a n tc o n c u r r e n t l y t h u st h es t u d i e so nc y a n o b a c t e r i aa st h er e c e p t o ro fg e n e e n g i n e e r i n ga n dt h e i re x p r e s s i o no f f o r e i g np r o t e i ne n j o y sg r e a ts i g n i f i c a n c ei nb o t h t h e o r e t i c a la n d a p p l i e df i e l d s a n t i m i c r o b i a lp e p t i d ec m 4 ，i s o l a t e df r o mt h es i l k w o r m b o m b y xm o r i p u p a e ，i st h ec o m p o n e n tw h i c hh a st h es t r o n g e s tb i o l o g i c a la c t i v i t ya n d i so f 3 5a m i n oa c i d s 珊1 a ti sm o s tr e m a r k a b l ec h a r a c t e r i s t i ci si t sw e l l 。d e f i n e d a c t i v i t ya g a i n s taw i d ev a r i e t yo f b a c t e r i a , f u n g i ，v i r u s e s ，p r o t i s ta n ds o m et u m o rc e l l s i ti sr e p o r t e dt h a ta n t i m i c r o b i a lp e p t i d ec m 4c a ni n h i b i t e dt h ep a t h o g e n i cg e r m si n a q u l c u l m r eo f f i s h i n t h i ss t u d y ，w et r i e dt oc o n s t r u c tc o r r e s p o n d i n ge x p r e s s i o nv e c t o ra n d i n t e g r a t i v e v e c t o rt o e x p r e s s a n t i m i c r o b i a l p e p t i d ec m 4i ns y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 t h et r a n s g e n e t i cc o u l db eu s e da sa q u a t i cf e e d t h a tc o u l dp u tf o o da n d m e n d i c i n et o g e t h e r f u r t h e r m o r e ，t h es t u d ya l s oo f f e r e da l li d e a l l ya p p r o a c ht or e s o l v e t h ec o n t r a d i c t i o nb e t w e e n p r e v e n t i o na n dc u r ea q u a t i cp r o d u c t s d i s e a s e sa n dd e c r e a s e t h eu s eo fa n t i b i o t i c s ，w h i c hw ec o u l dg e th u g eb e n e f i t so fe c o n o m ya n de n t i r o n m e n t f r o mi t t h u si th a sp a v e dt h ew a yf o rf u r t h e re x p l o i t a t i o no f t r a n s g e n i cc y a n o b a c t e r i a t h e e x p e r i m e n tb e g i n sw i t ht h ef u l ls e q u e n c eo fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc m 4 g a i n e db yt w i c ep c rp r o c e s s t h e np c r - a m p l i f i e dc m 4g e n ea n da n t i b i o t i cf r a g m e n t qw h i c ha l s oc a r r i e dt r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t e ra r er e s p e c t i v e l yi n s e r t e di n t om c s ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) ，w h i c hi sl o c a t e da tt h ed o w n s t r e a mo f t h e p e t e p r o m o t e ri n t h es h u t t l ev e c t o rp b s p p e t ea n dt h er e c o m b i n e dv e c t o rp b s p c qt h a tc o n t a i n s e x p r e s s i o nf r a g m e n tp c f 2 p e t ep r o m o t e r - c m 4g e n e - a n t i b i o t i cf r a g m e n tq ”w a s f o r m e d t h e nt h es y n t h e t i c a le x p r e s s i o nf r a g m e n tp c qi ss u b c l o n e da n dr e c o m b i n e d w i t l lt h er e p l i c a t e dv e c t o rp r l l 2 7 2t oo b t a i nt h er e p t i c a t i v ee x p r e s s i o nv e c t o r 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t 曲s p p c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 p r l l 2 7 2 一p c f l ，w h i c hp o s s e s s e st h er e p l i c a t i o no r i g i n so f e c o l ip l a s m i da n d c y a n o b a c t e r i u mp l a s m i d g e n es l r l 6 5 6w a sc l o n e da sh o m o l o g o u sf r a g m e n ts la b o u t 1 i k bf r o mg e n o m ed n ao f s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3b yp c ra m p l i f i c a t i o n t h e p r o d u c to f p c rd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e sa n dw a si n s e r t e da tt h eu p s t r e a mo f p e t ep r o m o t e ri np l a s m i dp b s - p c f 2 t h ec h r o m o s o m ei n t e g r a t i v ev e c t o rn a m e da s p b s s l p c ( 2a n di ti si n t e g r a t e di n t og e n o m ed n ao f s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3b y s i n g l e e x c h a n g ea n da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc m 4e x p r e s s e da sl o w - c o p yg e n e t h er e c o m b i n a n tr e p l i c a t e de x p r e s s i o np l a s m i dp r l l 2 7 2 - p c f ! a n dc h r o m o s o m e i n t e g r a t i v ev e c t o rp l a s m i dp b s s l - p c qw e r en a t u r a l l yt r a n s f o r m e di n t os y n e c h o c y s t i s s p p c c6 8 0 3r e s p e c t i v e l y t h et r a n s f o r m a n t sa r eo b t m n e db ys p e c f i n o m y c i n s c r e e n i n g t a r g e tg e n ei st r a n s f e r r e di n t ot h ec y a n o b a c t e f i a lc e l l sa p p r o v e db y e x p e r i m e n t a t i o no f p c r i d e n t i f i c a t i o n i ti sc o n f i r m e db ye x p e r i m e n t a t i o nt h a tt h e t r a n s f o r m a b l ee f f i c i e n c yo f h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni sh i g h e rt h a nt h a to f r e p i i c a t e de x p r e s s i o np l a s m i d ，a n dt h es t a b i l i t yo ft r a n s g e n e t i cc y a n o b a c t e r i ag a i n e d b yt h ef o r m e rw a y i sa l s ob e t t e r k e yw o r d s ：s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 ，a n t i m i c r o b i a lp e p t i d ec m 4 ，c y a n o b a c t e r i a t r a n s g e n o s i s i i i 南京师范大学硕士学位论立蓝藻固v n e c h o c y s t l xs pp c c 6 8 0 3 转够肽旦m 4 莲固质煌堕! 堡 缩略语表 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ) 氨苄青霉素钠盐( a m p i c i l l i ns o d i u ms a l t ) 碱基对c o a s ep a i r ) 牛小肠碱性磷酸酶( c a l f i n t e s t i n e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ) 氯霉素( c h l o r a m p h e n i e 0 1 ) 红霉素( e r y * k r o m y c i n l 千碱基( k i l o b a s e s ) 千道尔顿( k i l o d a l t o n ) 兆碱基( m i l o b a s e s ) 多克隆位点f m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) 光密度( o p t i c a id e n s i t y ) 开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e l 法国巴斯德研究所蓝藻保藏库( p a s t e u rc l u t u r ec o l i e c * i o n ) 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 转侮分( r o u n dp e rm i n u t e l 十二_ 烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ) 壮观霉素( s p e c t i n o m y c i n ) 脚却吣一m蓦助m l耋|圣嗽腿 掣哪印 学位论文独创性声明 本人郑重声明 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究t 作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 ，其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：照红 日期： “：! ! ! 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定影【构送交论文的电 了版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：箍盛。 日期：q ! ! 1 2 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t i ss pp c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 第一章前言与综述 一蓝藻的基因表达及应用 蓝藻( c y a n o p h y t e ) 又名蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ，是一类含有叶绿素a 、具有植 物型光合作用的原核生物，在分类地位上与真细菌、古细菌并列，约1 5 0 属，2 0 0 0 余种。因其光合作用形成的颜色得名，适应性强，广泛分布在地球上的各个角落。 在形态上可分为单细胞蓝藻和丝状体蓝藻，而丝状体蓝藻又可分为无分化丝状 体、具有异形胞的丝状体和具有分支的丝状体u 。 由于蓝藻结构简单、生长迅速，有些种类还具有能固氮、产氢的异型胞，及 其在遗传和进化等方面表现出的独特性质，多年来被广泛地用于研究光合作用 2 、固氮作用 3 】、叶绿体起源以及植物进化等重大生物学问题。另外，蓝藻在细 胞分化、发育、信号传导等方面的研究，也备受人们的关注。蓝藻具有独立的遗 传结构质粒，以及天然转化和重组系统，在分子克隆上易于操作，使得蓝藻 的分子生物学在近年来得到了较快的发展，已经成为继大肠杆菌原核表达系统和 酵母真核表达系统后的另类广泛使用的基因工程受体。蓝藻分子遗传学在近十 几年取得了长足的发展，在基因运载体的构建、基因克隆、定序基因转移、表达、 功能分析等方面取得了显著的进展，这为在分子水平了解蓝藻的放氧光合作用、 生物固氮、细胞代谢、细胞分化等重要过程提供了新的可能性。同时也为外源功 能基因的表达利用提供了一个十分有效的手段。 1 蓝藻作为基因表达系统的独特意义 1 1 蓝藻营光合自养生长，培养液主要成分为无机盐，成本较低，而且随着大 规模藻类养殖的开展，培养技术日趋成熟，己经可能使有些藻类细胞的倍增时间 接近大肠杆菌，使转基因蓝藻的产业化条件己比较成熟； 1 2 蓝藻是原核生物，其分子遗传背景与大肠杆菌十分相似，甚至有些转化系 统及蛋白表达系统在二者中能同时起作用，使以大肠杆菌为基础的基因工程的迅 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o e y s t i ss pp c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 速发展同时也推动了蓝藻基因工程向前发展，便于基因分析和外源d n a 检测； 1 3 革兰氏阴性菌，细胞壁主要由肽聚糖组成，结构简单，便于外源d n a 转化； 1 4 多种蓝藻含内源质粒，为利用和改造这些质粒构建适用于蓝藻的穿梭质粒 载体提供了很好的条件； 1 , 5 多数蓝藻含有丰富的人体和动物必需氨基酸和生物活性物质或前体，如螺 旋藻中蛋白含量占约6 0 ，是良好的食品和饲料蛋白来源，为基因工程产物直接 食用提供了可能； 1 6 蓝藻细胞表达的外源基因产物不形成包含体、藻细胞不含内毒素等特点， 使得通过转基因得到的蓝藻产物的下游加工过程大大简化，具有潜在的经济价值 和社会效益。 另外，转基因蓝藻在解决当前人类面临的环境、能源等问题中也显露出独特 的优势。 表1 1 蓝藻基因表达系统与几种外源基因表达系统的比较 t a b 1 一it h ec o m p a r a t i o nb e t w e e ns e v e r a le x p r e s s i o ns y s t e m so f h e t e r o g e n o u s g e n e sa n dc y a n o b a c t e r i a ig e n e - e x p r e s s i o ns y s t e m 表达系统 表达外源基因的特点蓝藻的优势和劣势 细菌( 大肠杆菌成本较低，培养容易，表达量高不形成包含体，不含内毒素 和枯草芽孢杆菌)形成包含体，含内毒素表达效率低 产率高，培养简单，可对蛋白进行产物一般不分泌，便于获得高浓 酵母 修饰和加工；多拷贝质拉不稳定性，度产物 低分泌率，随机的过糖基化不能表达需修饰的蛋白 丝状真菌( 曲霉、 载体整合到染色体，重组产物稳定， 遗传背景与革兰氏阴性细菌类 木霉、青霉、毛霉产物分泌似，转化效率高，蛋白酶较少 和根霉)载体有限，转化率低，遗传背景不产物不能修饰 清楚，胞外蛋白酶限制产物积累 昆虫细胞产物表达水平高，时间短，用生物可以用光反应器规模培养 反应器培养感染细胞有问题产物表达水平低 哺乳动物细胞( 中完全用于生产药用蛋白，适于表达培养成本低，生产周期短 国仓鼠卵巢细胞)人的基因，基因拷贝数高，表达水几乎不能对产物进行修饰 平高，培养成本高，表达不稳定 转基因动物适用于大量需要的药用和营养蛋如制成口服剂，可简化下游工 白，下游工程复杂 艺，几乎不能对产物进行修饰 转基因植物遗传上稳定，可食用生长周期较长，生长周期短，培养简单 易受环境影响，产率不稳定 2 蓝藻基因表达系统的构建 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t 打s pp c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 2 1 质粒载体和整合平台的构建 2 1 1 蓝藻质粒及质粒运载体 自1 9 7 3 年，a s a t o 平f g i n o z a 首次从单细胞聚球藻的个种中发现了染色体外 共价闭环d n a ( c c c d n a ) 4 】以来，尽管在分离蓝藻质粒d n a 的技术上存在一些困 难，己经证明在至少5 0 种单细胞和丝状体蓝藻中有质粒存在，大约是被检藻株的 一半。质粒拷贝数目从l 1 0 不等。大小在1 ，3 k b 1 3 0 k b 之间，但也有巨大质粒 可达4 0 0 k b1 0 0 0 k b 5 j 。通过大量的研究，许多质粒被改造用作分子生物学研究 工具( 表1 2 ) 。 表1 2 可用于基因转移的蓝藻质粒( 举例1 t a b 1 2t h ep l a s m i d su s e df o rg e n et r a n s f e r n a m e e c o l io r i t c y a n o b a c a n t i b i o t i cc o m m e n tr e f e r e n c e o r i v r e p l i c o n m o b i l i z a b l ec l o n i n gv e c t o r st h a tc o n t a i nac y a n o b a c t e r i ar e p l i c o n p r l 2 5 cp m b lp m b lp d u i k mc o s m i dw o l ke t a l1 9 8 8 p r l 4 8 8 p m b l 0 m b lp d u l k i n工“4 br e p o r t e re l h a ia n dw o l k 1 9 9 0 p r l 2 4 3p m b lp m b lp r d s l c m e m r e p l i c a t e si n a n a b a e n a m u r r ya n d 2 9 4 1 3a n d m l 3 1 ：c o s m i dw o l k1 9 9 l d r l 2 7 p m b ip m b l c a l o t h r i x k m r e p l i c a t e si nc a l o t h r i xc h i a n ge ta i 7 6 0 l 1 9 9 2 p d u c a 7 r k 2 r k 2 p d u l k r ac o s m i d ，l o wc o p yb u i k e m aa n d h a s e i k o m1 9 9 1 p p b h 2 0 i p m b lp m b lp g l 3 c m r e p l i c a t e si np l e c t o n e m a c l o n i n gv e c t o r st h a tm a yr e p l i c a t ei nc y a n o b a c t e r i a p k t 2 1 0r s fr s fc m s m i n c qp l a s r n i db a g d c s a m a n 1 0 1 01 0 1 0e ta l1 9 8 1 d r l 4 1 2r s fr s fk m i n c o ，p o s i t i v es e l e c t i o n e l h a ia n dw o l k 1 0 1 01 0 1 01 9 8 8 p k a c 5 1 p m b l r k 2a 廿c m k m r e p l i c a t e si np l e c t o n e m a v a c h h a m e ta 1 1 9 9 3 c l o n i n gv e c t o r st h a td on o tc o n t a i nac y a n o b a e t e r i ar e p l i c o n p b r 3 2 2p m b lp m b la p t c b o l i v a re t a l 1 9 9 7 p r l 4 9 9 p m b l p m b l k mp o s i t i v es e l e c t i o ne h l a ia n dw o 】k 1 9 8 8 p r l 2 7 8p m b ip m b i k ms a c bs e l e c t i o nb l a c ke l a i ，】9 9 3 v e c t o r sc o n t a i n i n gai t a n s p o s o nf o r m o t a g a n e s i s 南京师范大学硕士学位论文蓝藻跏曲唧时s pp c c 6 8 0 3 转抗苗肚c m 4 基n n n n n n p i l l l 0 5 8 p l 5 a r k 2k m b ms mm o d i f i e dt n 5 ；p 1 5 aw o l ke ta l1 9 9 l r e p l i c o nw i t h 口a a s p o s o n o r l l 0 s p m b l r k 2c m e mm a d i f i e d t n 5 ：n m b le l h a ie ta 11 9 9 2 r e p l i c c 、n w i t h t r a l l s p o s o n h e l p e r p l a s m i d s t h a ta l o w m o b i l i z a t i o no f p l a s m i d sb a s e do np h l b lb y t h ec o n j u g a lp l a s m i d p - k 2 ( r f 4 ) p d 5 4 1 0 1 c 0 】k a pf i n n e g a na n d s h e r r a n1 9 8 2 m e t h y l a t e s a v a i ，a v a i i e l b a i 卸dw o l k p r l 6 2 3c o i kc ma n d a v a i i is l t e s s c l 0 妇n s m 2 5 s i b k e o n j u g a t l v e n a s m i d p r o v i d e st r a n s f e r r k 2 f o n v t i o n sf o rc o n j u g a t i o n1 h o m a $ a r i d ( r p 4 ) r i ：2r k 2a d k m t co f a l lc i t e dt j l a s m l d sw i ms m i t h1 9 8 7 j np r e v i d e sn i c k i n g f u n c t i o n f o ro r i t f r o m r k 2o rr s f l 0 】0 p r l 4 4 3 r k 2r k 2 a pt ck m 。s p o n t a n e o u sm u t a n t e t h ma n dw o t k o f r k 21 9 8 7 p l a s m i d s t h a t p r o v i d e 日s 0 1 1 1 c eo f u s e f i j lg e n e s f o rp l a s m i dc o n s t r u c t l o n s o u r c eo f n p ig e n eo f p r l 6 4 8p 劬 k m t n 5 ，w i t h 珊mp r o m o t e r ，e j h z ia n dw o i k a p i na p o l y l i a k e r f o r s u b c o n i a l g a pp hp r o m o t e r i na e m a ia n dw o l k p r i a 3 9p o l y l i n k e rf o rs u b c f o n i n g p r l 4 9 2 k ms o u r c eo f l a c p r o m o t e r e l b a ip e r s o n a l 虽然有些质粒己完全测序并用于杂种质粒的构建，但是蓝藻质粒遗传研究的 进展是缓慢的，蓝藻的许多功能，诸如对抗生素的抗性，对高盐或重金属的抗性， 毒素的产生，限制性内切酶合成等，据推测均与质粒有关，但无明确的证据证实 上述观点，所以监藻的质粒是隐密性的。质粒的去除对细胞表型没有明显影响。 有证据表明，蓝藻质粒可能在不同种间转移或含有可能运动的元件，如转座子、 插入因子等。 迄今构建成功的蓝藻质粒载体郭是嵌入细菌遗传标记的重组质粒，称为穿梭 载体( s h u t t l ev e c t o r ) 。这种杂合质粒含有两个复制起始位点，分别来自蓝藻质粒 和大肠杆菌质粒，能在这两种生物中复制便于利用二者的优势进行遗传操作； 除此之外，大肠杆菌质粒还为穿梭载体提供了选择标记和便于外源基因插入的单 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t i ss pp c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 一限制性内切酶酶切位点。 v a n d e nh o n d e l 等【6 最早使用蓝藻质粒来构建克隆载体，他们将大肠杆菌质粒 p r l 4 6 上带有氨苄青霉素抗性基因的t n 9 0 1 转座子与聚球藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 的质粒p u h 2 4 ( 7 9 k b ) 重组，首次获得了可在转化的蓝藻中表达氨苄抗性 的重组质粒p c h i , 及衍生质粒p u c j 以后，大量载体在体外构建成功。j 9 8 1 年， k u h l e m e i e r 等将p u c i 与p a c y l 8 4 融合，首次获得了双向质粒p u c l 0 4 和p u c l 0 5 ， 在大肠杆菌和s y n e c h o c o c c u sp c c 7 9 4 2 中都有很高的转化率，并能在e c o l i 和蓝藻 中复制1 7 j 。此后用多种单细胞蓝藻质粒与e c o i l 质粒，如p b r 3 3 2 及其衍生物等分 别连接，导入多克隆位点，补充新的选择标记，改善载体的克隆能力，又相继构 建了许多双向质粒，女h p u c 2 9 ，p u c l 9 的衍生质粒p b l u e s c r i p tk s ，p u c 3 0 3 ， p l s l 0 3 ，p s g l l l ，p p l a n b 2 和p c b 4 ，p x b 7 ，p k b x ，p a q e ，p u f 3 11 。1 9 8 4 年w o l k t s 等报道了一类穿梭载体p 对。家族的建立，其上含有p b r 3 2 2 的复制位点 和非受损的b o m b ( 转移必需区) ，抗性选择标记，选择去除了限制酶a v ai i 和a v a i 的标记位点，并包含有蓝藻质粒p d u i 的复制起点( o r o ，这类双向质粒能通过接 合转移从大肠杆菌转移到几种a n a b a e n a 藻株和其它丝状蓝藻株系中，并稳定地维 持在转化藻株中，这些基因运载体的构建，为蓝藻分子生物学奠定了基础。 使外源基因在一个独立存在、自主复制的质粒上进行表达，这种方法的缺点 在于：由于受到蓝藻质粒拷贝数低的限制，外源基因的表达量很低；同时在没有 选择压力的条件下，带有外源基因的质粒容易丢失。 2 1 2 蓝藻整合载体和转座子 穿梭载体携带外源基因进入宿主细胞后，独立存在并进行自主复制，整合载 休( i n t e g r a t i v ev e c t o r s ) 贝l j 将外源基因通过重组进入染色体d n a 上_ 复制。这类整合 载体上不含在蓝藻中自主复制的o r i ，不能在蓝藻细胞中独立复制，但含有一段 与宿主染色体同源的序列，以及b o r n 区f 转移必需区) 。在转移的过程中，同源序 列之间发生单交换或双交换，将外源基因整合到宿主染色体上作为低拷贝数基因 存在和表达 9 1 。 采用的同源重组方法将外源基因整合到蓝藻的染色体d n a 上，不易丢失。 而且，整合到染色体上的外源基因表达经过体内的修饰，会增加其表达产物蛋白 的稳定性，并提高其表达量，因而更有发展前景。宋凌云等【lo 利用p u c l 9 的衍生 南京师范大学硕士学位论文蓝藻s y n e c h o c y s t 括s pp c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 质粒p b l u e s c r i p tk s ，以s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 a 2 p s b b 的- - 段序列作为整合平台 构建了一个新的整合质粒p k s b ，采用单交换同源重组的方法将人肝金属硫蛋白 突变体p p 基因整合到蓝藻染色体上，获得了稳定的表达。 外源基因也可以通过转座子介导染色体整合。天然的转座子以及人工的转座 子均已经成功用于对蓝藻基因组进行随机突变1 4 1 ”，通过对转座子上所携带的抗 生素抗性基因标记进行筛选，可望获得一系列用转座子为标识的突变位点不的突 变株，这大大方便了基因的克隆工作。 2 1 3 蓝藻噬菌体载体( c y a n o p h a g e ) w a t e r b u r g 等) k 【1 2 用稀释法分离出5 0 多株侵染$ n p 如d c d c c 郴的噬菌体；s o d e 分离到一种新的蓝藻噬菌体“n s 一1 ) ，并对其宿主范围进行了感染实验，发现 s y n e c h o c o c c u s n k b g0 4 2 9 0 2 对它十分敏感；陈峰【1 4 】等目前已分离到广谱宿主噬 菌体，正在从浸染s y n e c h o c o c c u s 的海洋噬菌体a 组中发展载体。研究蓝藻的噬菌 体转导机制，发展噬菌体载体系统，以期在特异性宿主蓝藻中获得外源基因的表 达，为构建蓝藻基因工程载体提供了新的思路。 2 2 转基因体系 在近2 0 年蓝藻基因工程的探索中，各国学者主要遇到两大方面的问题：一 是只有极少数种类蓝藻可被用于转化，二是外源基因在这些可转化蓝藻中的表达 效率较低。这可能与蓝藻的基因转移系统有关。基因转移系统的选择和建立已成 为对蓝藻进行遗传操作的先决条件之一，阻碍着蓝藻基因工程的进一步发展。 已报导的蓝藻基因转移体系有两种：一种是遗传转化( g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ) ，另一种是接合转移( c o n j u g a t i o n ) 。 2 2 1 遗传转化 目前认为能被遗传转化的蓝藻多是无异形胞分化的单细胞藻株，又可分为自 然转化、诱导转化和电转化。 一些单细胞蓝藻可以在指数生长期有效的吸纳外源d n a 而无需人工诱导感 受态，称为自然转化。早在7 0 年代初，s h e s t a k o v 等首次报道了自由d n a 可转化 进入s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 3 【”1 。目前报道的可用于自然转化的蓝藻绝大多数 属于聚球藻 伽出口c f 蜘和集胞藻 榭c 砌0 馏哟两个属 1 6 1 的单细胞蓝藻，如聚 6 南京师范大学硕士学位论文 蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 转抗菌肽c m 4 基因质粒的构建 球藻( s y n e c h o c o c c u s ) p c c 6 3 0 1 、7 0 0 2 、7 3 6 0 9 、7 9 4 2 、7 9 4 3 币1 3 集胞藻( s y n e c h o c y s t i s l p c c 6 7 1 4 、6 8 0 3 、6 9 0 6 等【1 7 】。除了单链d n a c b ，同源、异源、环状、线状的双 链d n a 均可转化u s 。蓝藻自然转化的机理尚还不是很清楚，仅y o s h i h a r a - - 等发现 s y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3 的o r fs l r 0 1 9 7 是外源d n a 进入藻细胞所必须【1 9 。但是已 证明，自然转化效率与d n a ；浓度、蓝藻的感受时期有关，转化时供体d n a 互相 竞争，无专一性。不同藻株用于转化所需d n a 浓度不同，从不足1 o n m 垤0 5 0 9 9 m l 。而且d n a 构型、供体d n a 及与蓝藻的保温时间条件等因素也不尽相同 【2 0 】。自然转化的转化效率一般介于1 0 3 1 0 5 个转化孑：p g d n a 之间。丝状蓝藻的 转化作用何家苑虽有报道 2 1 ，但可重复的稳定转化系统尚未建立。 诱导转化是指需人工诱导感受态，才能有效的转化外源d n a 。如1 9 9 5 年闵 红涛等瞄1 利用溶菌酶处理s y n e c h o c o c c u sp c c 6 3 0 1 细胞诱导人工感受态，并将外 源质粒p b r 3 2 5 转化受体细胞并表达氯霉素抗性，转化频率接近5 x 1 0 4 转化子 细胞。s y n e c h o c y s t i sp c c 6 3 0 8 则需c a 2 + 诱导细胞感受态才能引入外源基因让引， 或利用溶菌酶e d t a 处理产生原生质球用于蓝藻转化。 电击转化是利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使游离的外 源i ) n a 穿过细胞膜转移到细胞内的一种方法。自从1 9 8 9 年t h i e i 等【2 4 】首次通过 电击转化成功地把穿梭表达载体p r l 6 转入鱼腥藻n a b a e n as t r a i nm 1 3 1 ) 以来， 已有一批穿梭表达质粒通过电击在多种蓝藻中转化成功【2 “。 除上述方法，基因枪也被应用于蓝藻的遗传转化研究，其d n a 承载体采用