（生态学专业论文）皿蛛科（linyphiidae）蜘蛛分子系统学初步研究.pdf

中文摘要 为了弄清皿蛛科的系统发商关系，我们选择了线粒体d n a 细胞色索氧化酶i 基疆髑棱1 8 sr r n a 基因 乍必系统发努研窥中的分子撂记。本璎谤究盛用瓣a 序 裂溅定技术对采爨广东、湖l l 、江舀、云鬻等省静9 耩2 3 种盛蛛及i 个溺蛛稀 和个球蛛科外群的c o lm t d n a 基因和核1 8 sr r n a 基因部分d n a 序列进行了测 定，并驮g e n b a n k 上下载了4 耱盛拣麴麓深序歹。缝巢表鼹： 对盟蟓科盏蛛属i 5 释辩蛛祠一个辨群焉c o lm t d n a 进行分帮彳发现，鹌嘴盏辣 没有被归入哈氏盏蛛组，可能魑由于鹤嘴箍蛛与同组其他三种蜘蛛属于不同的动 甥地理区系掰致。 对羹源科辩蠊构建韵系统稳都将它们分为了两个类群，其中一个类群与形态 分粪中的皿蛛亚科相对应，包括了传统形态分类中菔蛛属、盾蛛属和烈蛛属的糖 类；另一个炎群麓括了形态分类中徽蠊耍辩豹凡种察鼗洙亚幂串躐蕊蛛满和苔蛛 满。褥时本文静研究鳐暴迮支持将中牮盏嫌和熏璇盖蛛从盖蛛属中分如。 c o lm t d n a 基因和核1 8 sr r n a 基因谯研究皿蛛科系统进化方厦是较套用鲍 基因，然褥箕窿舞掰攮供豹逡传信慈尚不是敷得出完全正确的系统稀。我们认为 对于系统避化研究，增加分类单元，增强分类单元的代表性，避一步分析院较更 多的d n a 序列，是十分必要的。 关键词：皿蛛科，线粒体细胞色素氧化酶i ，1 8 s 核糖体基因，系统发育 1 前言 1 1 分子系统学概述 生物学经历了一个漫长的研究过程。最早人们从研究动物和植物的形态、解 剖和分类开始，以后，进一步研究细胞学、遗传学、微生物学、生理学、生物化 学，进入细胞水平的研究。自2 0 世纪中叶以来，生物学以生物大分子为研究目 标，分子生物学( m o l e c u l a rb i o l o g y ) 开始成为独立的学科，这是对生物界的 认识不断深入的过程( 阎隆飞、张玉麟，1 9 9 7 ) 。目前，分子生物学几乎己渗入 到所有生物科学的各个领域，甚至最古老的动物和植物的分类学也开始采用分子 生物学研究物种的亲缘关系。 1 1 1 分子系统学的产生与发展 几个世纪以来，分类学家不断地探索、描述和解释生物界的多样性，这个研 究过程称为系统学( s y s t e m a t i c s ) 。林奈( 1 7 5 8 ) 首先根据不同物种的形态特 征对亲缘关系进行了描述和分类研究。达尔文于1 8 5 9 年在物种起源中提出 了生物进化论，物种起源和进化的理论为生物系统学家组建分类系统提供了明确 标准，即物种之间的血缘关系、系谱关系，后来的学者们认为分类应基于系统进 化关系( p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s ) 。目前认为生物系统学是探索、描述并 解释生物多样性及其分类和演化关系的学科。分类学( t a x o n o m y ) 则是对生物体 命名和分门别类，而分类的主要标准就是系统进化关系，2 0 世纪，在系统进化 的研究方法上已得到了很大发展。有j s h u x l e y ( 1 9 4 0 ) 称为新系统学( n e w s y s t e m a t i c s ) 的出现，导致了物种概念的又一次革新，物种的生物学定义代替 了纯形态学的物种定义。在野外，生物系统学家不断填补关于动物生物学方面的 知识获取更多的用于分类的生物学性状，如生活史、行为、声音、生态需求等。 在实验室、胚胎发育、生理生化特性、细胞遗传特点都成为生物系统学家关注的 热点。这种转变不仅推动了生物系统学的发展而且也对其他生物学分支学科起到 推动作用。新系统学所推动的研究在3 0 4 0 年代达到鼎盛期，关于种级以上阶元 的生物系统学问题( 大分类学) 的探讨在理论和概念方面随着5 0 年代数值分类 学的产生而发生了巨大变化。 分子生物学技术的发展为建立新的、更完善的生物系统学建论提供了契机。 为检测种内或种间的各种关系的复杂性，大量的分子生物学技术手段己越来越广 泛地应用于生物系统学研究的各个层次，从种群内的个体变异至近缘种的鉴定， 从物种的进化到各种高级分类单元的相互关系。生物大分子在系统进化研究上的 作用越来越重要，如核酸和蛋白质都可作为分子标记，来解释种群的遗传结构和 各类群间的关系，而某些大分子的研究产生了许多可比较的数据，提供了洞察分 子本身进化的可能，由此而产生了分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 。分 子系统学是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的学科， 它以研究生命的普遍性为对象的分子生物学与研究生物多样性的系统学相结合， 基于在分子水平上的比较建立分子进化树，来探讨生物的系统进化关系。它有两 个重要的理论基础( f e l s e n s t e i n ，1 9 8 8 ) ，其一是中性进化理论，认为大多数分子 水平的变异是随机的，生物大分子的结构变异能够反映进化变异的积累。自然选 择在某些方面仍起着积极的作用，导致一些生物大分子的保守结构；其二是进化 速度均衡论，也即z u c k e r k a n d l h e 和p a u l i n g ( 1 9 6 5 ) 提出的“分子钟”的概念， 认为生物大分子的进化基本保持一种恒定的进化速度，分子变异程度能较好地反 映物种进化速度。 分子系统学的早期应用主要是在蛋白质水平上，蛋白质电泳和特殊染色体在 种内和种间的应用揭示了不同物种的蛋白质变异的幅度，根据这结论，人们作了 大量的进化研究，并且在人类起源的研究中取得了卓越的成就。随着对酶的特性 和对分类的深入研究以及同工酶电泳方法的出现，使这个方法产生了巨大的可比 较的数据基础，在分子系统学上得到了极其广泛的应用。染色体结构和数目上差 异也为种内和种间提供了作为遗传标记有用的来源。氨基酸序列的比较提供了分 子钟的第一个指标，且在系统进化上得到广泛应用。进入8 0 年代后，核酸的实 验操作技术和分析方法上的巨大进步导致了对d n a 和r n a 差异上的广泛研究，序 列分析主要来自核d n a 和线粒体d n a 等遗传物质目前在分子系统学中，广泛使 用的主要有两种途径，即蛋白质电泳和d n a 分析。蛋白质电泳的一个主要特点是 能分辨、估计出很高的不同等位基因差异，但d n a 比蛋白质电泳能提供更强的 解决能力，可达到定量化的分辨差异，特别是m t d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ) 的 应用，在分子系统学研究中开创了一个新时代( 李明、王小明，1 9 9 7 ) 。自从 b o s t e i n 和w h i t e 等( 1 9 8 0 ) 利用限制性片段长度多态性( r f l p ：r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 构建人类遗传连锁图奠定的分子标记技术及其 应用研究取得了令人瞩目的进展，目前，已经建立并在分子系统学研究中得到应 用的d n a 分子标记技术有r f p l ，随机扩增多态性d n a ( r a p d ：r a n d o m l ya m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ) 、单基因座和多基因座d n a f p 图谱 s i n g l ea n dm u l t i l o c u s ( m i n i s a t e l l i t e ) d n af i n g e rp r i n t i n g 、小卫星区域d n a 定向扩增( d i r e c t e d a m p l i f i c a t i o no fm i n i s a t e l l i t e r e g i o nd n a ，d a m d ) 、m t d n a 和r d n a 测序、 微卫星( m i c r o s a t e l l i t e s ) = 单序列重复( s i n g l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) 、 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、直接 扩增长度多态性( d i r e c ta m p li f i c a t i o no fl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，d a l p ) 、荧 光原位杂交( f l u o r e s c e n t 勘s i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 、反向转录酶 p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c r ) 、p c r 酶联免疫吸收法( p c re n z y m e l i n k e d i m m u n e a b s o r b e n ta s s a y ，p c r e l i s a ) 等。这些d n a 分子标记技术已成为分子生 物学的一个热点，并且对生物基因组、物种进化、目的基因定位、遗传图谱构建 和物种鉴定等的研究产生了深刻的影响。 1 1 2 分子遗传标记技术的基本原理和特点 遗传标记( g e n e ticm a r k e r ) 是指那些表现变异性，且遵循简单遗传方式的性 状或物质，是任何遗传分析所不可缺少的工具。随着生物技术的不断发展，遗传 标记技术也随之不断更新，这些遗传标记涉及生物体的表型变异、染色体的多态 性、蛋白质的多态性和遗传物质d n a 的多态性等各种不同水平。本世纪5 0 年代 中期以前，绝大多数遗传标记限于易鉴别的形态性状、生理性状和生化性状，这 些性状在数量上是有限的，且受环境因素的影响较大。随后，由于蛋白质电泳技 术的出现，使研究蛋白质的多态性成为可能，因而各种多态蛋白质被用作遗传标 记应用于遗传分析中。但是易于分析的蛋白质的主要变异体种类很少，从而限制 了蛋白质作为遗传标记的发展和利用。由生物遗传信息传递的中心法则可知，生 物各种性状的差异是由遗传物质d n a 的差异造成的。显然，直接研究d n a 的变异 更具有重要意义。因而，d n a 分子标记技术近年来得到了迅速发展。 1 1 2 1 同工酶电泳( i s o z y m ee l e c t r o p h o r e s i s ) 同工酶电泳技术的问世( l e w o n t i n 等，t 9 6 6 ；h a r r i s ，1 9 6 6 ) ，将遗传标记技 术推向了一个新的发展阶段，并在随后的二十多年的时间内成为研究群体的遗传 变异和群体间遗传变化、系统发育的主要研究手段a 同工酶是指由不同基因位点或等位基因编码的多肽链的单体、同聚体或异聚 体，其分子的级结构及理化性质和生理功能不同，而催化功能相同的多种形式 的酶类。由于同工酶在分子结构上存在差异，分子的大a , g n 形状会有不同，在一 定的缓冲介质中所带的静电荷就不同，电泳时，它们在凝胶载体中具有不同的迁 移率或迁移方向，从而得以分离。电泳后，经特异性染色，即可在特定的位置出 现特异性的酶带。由于同工酶是不同基因位点或等位基因的表达产物，通过同工 酶的电泳表型可以推断出编码同工酶的基因的基因型，并且可以得到基因和基因 型在群体中的分布频率，以此对群体的遗传结构和遗传变异水平进行研究。由于 同工酶变异比较丰富，不同酶谱带差异一般表现为同一基因位点上等位基因的差 异，能稳定遗传，等位基因及基因频率可以直接计算，杂合体共显性，对生物性 状表现一般没有直接效应，因此继形态学、细胞学标记之后，同工酶标记被广泛 应用于物种遗传多样性、生物进化、种系发生、资源评价等许多方面。但同工酶 分析也有其内在局限性，首先，同工酶是基因表达的产物而非基因本身，因此， 其状况常受环境及发育状态的影响；其次，同工酶所能分析的位点是有限的，它 只能分析那些编码可溶性酶的基因，而且还要求其产物易于提取并能通过凝胶电 泳进行检测，而且检测的范围只限于那些导致产物分子静电荷改变的氨基酸的组 成性变异。根据有限位点所得出的遗传多样性不一定能代表整个基因的实际情 况。蛋白质比d n a 更难操作，因为它更容易降解，必须在一7 0 温度下保存，但 即使在这样的温度条件下，一些蛋白质也会在数月中降解掉。因此，同工酶的稳 定性是有一定限制的，为保持酶的活力，其储存和运输都可能遇到一定的困难。 该技术的主要困难是在某些系统中难以明确确定等位基因的同源性。 1 1 2 2r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m , 限制性片段长度 多态性) d n a 限制性片段长度多态性( r f l p ) 是指用限制性内切酶处理不同生物个体的 d n a 所产生的大分子片段的大小差异。这一标记系统是b o s t e i n 和w h i t e 等于 1 9 8 0 年首次提出的，也是最早的d n a 分子标记。其基本原理是，生物在长期进 化的过程中，会在种、属间同源d n a 序列上的限制性内切酶识别位点上出现差异， 在酶切作用下会产生许多大小不等的d n a 片段，用放射性同位素标记的d n a 作探 针，把与被标记d n a 相关的片段检测出来，从而可以构建出多态性图谱，与d n a 探针结合的特定限制片段即为分子标记。r f l p 远远超出了同工酶所提供的识别 位点，并且以孟德尔方式稳定遗传，以共显形方式表达。r f p l 的重要应用一个 是构建基因组连锁图谱，另一个是确定物种间亲缘关系，此外，还可用于研究种 群内和种群间变异、基因流水平、种群有效大小等。然而，由于细胞核d n a 分子 量极大，不同属种生物的差异较大，采用一种和几种限制性内切酶几乎很难切割 d n a ，因此，目前国内外普通进行的是生物体线粒体d n a 多态性的研究。而线粒体 d n a 分子较小( 1 5 7 - 1 9 5 k b ) ，处于限制性内切酶的分析范围，并且基因组结 构相对比较简单、稳定，便于进行结果分析。 r f l p 作为d n a 水平上的遗传标记，有其独特的优点和充分的可靠性，但r f l p 的获得要依赖限制性内切酶识别位点中碱基的改变或识别位点位置的移动，这很 大程度上限制了r f l p 技术的应用。另外进行r f l p 分析，d n a 需要量较大，需要 的仪器设备较多，技术较为复杂，并且要接触放射性污染，这给大量研究物种遗 传多态性带来了一定的困难。r f l p 分析中，内切酶的选用具有一定的盲目性， 有时因选用不当，使一些真正具有多态性的位点未能检测出。而且，根据m t d n a 多态分析结果只能进行母子关系的鉴别，而无法实现父子判断。 1 _ 1 2 3r a p d ( r a d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增多态性d n a ) r a p d 是1 9 9 0 年由美国杜邦公司的科学家w 订l i a m s 和加利福尼亚生物研究 所的科学家w e l s h 领导的两个小组几乎同时发展起来的利用随机引物寻找多态 性d n a 片段的d n a 分子标记技术。这一技术的原理是建立在聚合酶链式反应( p c r ： p o l y m e r s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩增基础上。它利用随机合成的1 0 个碱基的寡聚核 苷酸序列为引物，分别与d n a 的两条单链结合，在d n a 聚合酶的作用下，对基因 组的特定区域进行p c r 扩增，扩增产物经电泳分离后，并经溴化乙锭染色，可在 紫外灯下检测出扩增的多态性d n a 片段。r a p d 的生物学基础是在引物结合序列 上发生单个碱基点突变、缺失、重复、易位、插入，从而改变了扩增片段的大小 或无法扩增，形成多态性d n a 片段。由于不同引物可扩增出不同的d n a 片段，因 此存在大量的r a p d 标记。r a p d 以孟德尔方式稳定遗传，为显性表达。r a p d 不像 常规p c r 需专门设计已知序列的引物，在最初循环程序设置上，退火温度较p c r 反应低，即保证了短核菅酸引物与模板结合的稳固性，又允许引物与模板适当误 配，从而增大了引物在基因组d n a 中配对的随机性，提高了对d n a 的分析效率。 在建立r a p d 技术后，w i l l i a m s 和w e l s h 等对人类、谷类和蚕豆等多种真核 生物的d n a 进行了r a p d 分析，成功地得到了多态性d n a 分子标记，并构建了r a p d 连锁图。 r a p d 技术继承了p c r 效率高、样品用量少、灵敏度高、特异性强和检测较 为容易的优点。此外，r a p d 技术和其它d n a 多态性分析方法相比，还表现出其 独到的特点和优势：( 1 ) r a p d 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况 下，对其进行d n a 多态性分析，构建这种物种基因指纹图谱，并通过统计分析为 遗传分析和分类研究提供d n a 分子水平的证据，这是其它方法进行此类研究所不 能达到的；( 2 ) r a p d 技术可以直接对生物基因组d n a 进行多态性分析。由于引物 的设计是随机的，不需要预先知道特异位点序列的信息，这就避免了像s o u t h e r n 杂交中需要筛选出探针这样的复杂程序，省去其它d n a 多态性分析所需的一系列 预备性工作，如制备克隆、多态性筛选、同位素标记、s o u t h e r n 印迹、分子杂 交等项工作，因而实验简单易行，减少了对工作人员的危害和对环境的污染； ( 3 ) r a p d 技术能利用前人采集的标本进行d n a 分子多态分析，这样可以极大地扩 展昆虫分类和系统演化的分子生物学研究范围，有助于建立正确和完善的分类体 系，推测正确的系统演化树；( 4 ) 实验中所需d n a 量极少，便于对大量的小型昆 虫进行研究，对于r a p d 技术，几个细胞的d n a 量就绰绰有余；( 5 ) r a p d 引物没 有严格的种属局限，同一套r a p d 引物可以应用于多种物种的基因组多态性分析， 具有广泛性、通用性( 鲁亮、归鸿，1 9 9 5 ；王斌、李松涛，1 9 9 5 ) 。( 6 ) 使用大 量的r a p d 引物，将使r a p d 分子多态性分析非常灵敏。由于r a p d 技术可以对整 个基因组做地毯式的多态分析，所以其灵敏程度可以与d n a 序列分析和d n a f d 相媲美，可分析的领域扩展到种内不同种群、不同生物型、不同品系、不同家系 之间的关系，同时，r a p d 技术还可以和其它d n a 分子技术结合，进行其它方法 的检测。这样，就大大扩展了分子生物学技术的应用范围，将对形态分类和系统 推测产生很大的促进作用；( 7 ) 采用r a p d 技术对不同种群、不同生物型、不同品 系的个体进行广泛的多态分析以后，通过统计分析，从大量的引物中找出关键的 引物，从不同的电泳谱带中找出关键的谱带，可以建立一套检索系统。对于一个 不知道分类地位的标本，可以用关键的引物进行p c r 反应，根据得到的电泳图谱 再进行统计分析，就可以基本准确地计算出这个标本的分类地位( 主要在较小的 分类单位内) 。但是，r a p d 技术也有其较难以克服的缺点，如扩增产物的稳定 性差，实验重复性差，多数位点的标记带表现为显性，只能检测等位基因的有无， 无法鉴别纯合予和显性杂合子的差异，不能提供完整的遗传信息。 1 1 2 4d n a 序列测定( d n as e q u e n c i n g ) 快速而精确地测定和分析d n a 及r n a 的一级结构是核酸研究的一项关键技 术。目前的d n a 序列测定技术是在7 0 年代中期提出并逐渐完善起来的。最初， d n a 序列的测定均借鉴6 0 年代发展起来的r n a 测序技术，甚至曾用大肠杆菌r n a 聚合酶将d n a 转录成r n a ，然后测定r n a 序列；而今天大多数蛋白质序列都是通 过基因或c d n a 的核苷酸序列推导出来的。这已充分显示了d n a 序列测定技术的 成功( 金冬雁、侯云德，1 9 9 6 ) 。 d n a 序列测定的基本原理是用酶学或化学方法使欲测定的d n a 片段形成携带 核素或荧光标记、具有不同末端和长度相差仅一个碱基的寡聚核苷酸片段，在将 片段在凝胶电泳中分离。由于电泳中具有相同末端的片段在同一泳道中分离，因 而d n a 序列可直接从“阶梯”式寡聚核苷酸电泳中读出。 双脱氧末端终止法( 酶法) 是目前使用最广泛的测序方法，它是以单链或经 过变形的双链d n a 为模板，用与测定序列末端互补的寡聚核苷酸为引物，在四种 核苷酸存在的条件下，经聚合酶催化形成新链。由于在聚合反应中加入四种双脱 氧核苷酸，当双脱氧核苷酸渗入时，新链的合成随之终止。应用于双脱氧末端终 止法的聚合酶包括：d n a 聚合酶i 的大片段( k l e n o wf r a g m e n t ) 、a m y 逆转录酶、 t a qd n a 聚合酶和t 7 d n a 聚合酶。k l e n o w 大片段和a m v 逆转录酶是最阜应用于测 序的两种酶。在一般情况下，这两种酶测序效果相似，在含a 和t 丰富的序列中， 应用k l e n o w 大片段效果更佳，在c 和g 丰富的序列中则多选用a m v 逆转录酶。 而t a qd n a 聚合酶和t 7 d n a 聚合酶在测序中较前两种酶具有更大的优越性。由于 这两种酶具有很高的催化57 37 聚合反应活性，而37 57 外切活性较低，用 这两种酶测序能降低本底，获得强度一致的区带，将核苷酸序列阅读得更准确。 t a q d n a 聚合酶在高温下进行反应，能够减少模板自身形成的二级结构，因此在 测定某些含有高级结构的序列时是不可缺少的。 作为一种遗传标记技术，d n a 序列测定直接从遗传物质d n a 的核苷酸组成上 检测遗传变异，是最准确有效的遗传多样性检测手段，近年来，在研究物种的起 源和系统演化以及亲缘关系等方面取得了卓有成效的成果。 d n a 不仅是主要的遗传物质，同时也是生物进化史的重要记录者。通过d n a 序列分析研究生物的进化历程和确定物种间的进化关系具有许多的优越性：( 1 ) d n a 仅由4 种基本结构单位( g 、a 、t 、c ) 组成，其序列上的异同是明确无误的， 因而易于分析；( 2 ) d n a 序列含有无比丰富的进化信息。有些物种的基因组中具 有多于l o “个碱基对；( 3 ) d n a 序列相对易于获取。特别是随着近年来p c r 技术 的应用与推广以及人类基因组项目的实施，d n a 序列正以爆炸性的速度积累起 来。正是由于上述这些特点，d n a 序列分析已成为生物系统与演化研究中最重要 与最热门的工具之一。 1 2 蜘蛛核酸分子系统学研究概况 我国古代劳动人民在长期的生产斗争中，早就对蜘蛛有所观察和记载，甚至 连蜘蛛的名称也是根据其习性而来。明朝李时珍在本草纲目中写道：“此虫 设网一面，物触而诛之，知乎诛其不义者，取曰蜘蛛。”我们的祖先在古代 不仅只观察这类动物的生活习性，而对蜘蛛在农业生产上的作用以及医学上的利 用等，早就有所注意，如我国早在南北朝时期的西京杂记中就有“蜘蛛集而 百事喜”的民间谚语，把蜘蛛群集当作丰年的预兆；李时珍所著本草纲目中 不但记述了多种蜘蛛，并提出蜘蛛入药的不少验方。 蜘蛛是与害虫处于同一生境中的节肢动物，其种类数量仅次于昆虫，在陆地 生态系统中起着重要作用。蜘蛛的食性单一，全为肉食，不为害作物，农、林蜘 蛛治虫，无副作用；蜘蛛性凶猛，专捕活虫，一般不食死虫，其捕食量也很大， 同时亦能耐饥耐寒、蜘蛛寿命长，繁殖力强，本身的生态多样，能捕食多种害虫。 实践证明，将它们作为农林害虫的捕食性天敌加以保护和利用，对于农林业的持 续发展、生态环境保护具有很好的效果( 颜亨梅等，1 9 9 8 ；w a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 此外，蜘蛛作为一类在进化上奇特的类群，有一系列有别于其他节肢动物的 行为，如结网、求偶、争斗、育幼、学习等，与高等动物有许多相似之处( 宋大 祥，2 0 0 0 ) ，一直都是行为学研究的有趣课题。蛛丝和蛛毒的应用研究也向来为 人们所关注，已经取得了较大进展( 黄仁槐等，2 0 0 0 ) 。 蜘蛛在动物分类系统中属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) ，螯肢动物亚门 ( c h e l i c e r a t a ) 的蛛形纲( a r a c h n i d a ) ，蜘蛛目( a r a n e a e a r a n e i d a ) 蜘蛛是 个庞大的家族，种类繁多，适应性强，繁殖力高，分布极广。全球已知3 6 1 8 属、 3 9 1 1 2 种( p l a t n i c k ，l - ，2 0 0 6 ) ，另据李枢强( 2 0 0 5 ) 统计，中国蜘蛛有5 8 科 5 2 7 属2 8 5 8 种。 长期以来，科学工作者为阐明现存蜘蛛的生物学特性，不断深入进行蜘蛛基 础理论，其中包括蜘蛛系统学研究。目前，该方面的研究业已迈入分子系统学水 平。近年来，蜘蛛分子系统学研究渐趋活跃。 核酸( d n a 和r n a ) 是生物体内最重要的信息分子，也是分子系统学研究中 价值最大、信息含量最多的分子。本文结合国i 勾# 1 - 研究状况，对近1 0 年来蜘蛛 核酸分子系统学的研究从遗传多样性、近缘种鉴别以及分子进化和系统发育重建 3 个方面展开综述。 1 2 1 遗传多样性研究 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。广义地讲，遗传多样性就是生物 所携带遗传信息的总和，但一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，或称 遗传变异( 葛颂、洪德元，1 9 9 4 ) 。目前d n a 分析技术是针对部分d n a 进行的。 从原理上可大致分为两类：一类是直接测序，主要是分析些特定基因或d n a 片 段的核苷酸序列，度量这些片段d n a 的变异性：另一类是检测基因组的一批识别 位点，从而估测基因组的变异性( s c h a a l 等，1 9 9 1 ；a v i s e 。1 9 9 4 ) 。 h e d i n 等( 1 9 9 7 ) 用来自2 5 6 个体的m t d n a 序列数据研究了美国阿巴拉契亚 地区洞穴蜘蛛( 类球蛛科n e s t i c i d a e 类球蛛属n e s t i c u s ) 种群遗传结构和物种 形成机制之间的关系。p i e l 等( 2 0 0 0 ) 发现已有的等位基因酶( a l l o z y m e ) 研 究显示园蛛科( a r a n e i d a e ) m e t e p e e r a 属的四个墨西哥种群是同种，这与形态 学和行为学研究相悖，因此p i e l 等( 2 0 0 0 ) 对其1 2 sm t d n a 核糖体亚基部分序 列测序并分析，认为由等位基因酶数据得出的种群结构可能不可靠。 1 2 2 近缘种鉴别 有关蜘蛛的分类鉴定工作，从总体上看主要还是以成蛛触肢器和外生殖器的 形态特征为主要依据进行的。但是面对一些形态特征极为相似的近缘种，传统的 方法分类起来很困难。在分类学理论和方法的探索和研究空前活跃的同时，具体 的分类方法也发生了很大的变化。通过采用新技术新方法，使分类学性状的来源 更加广泛、更加可靠。 女g b o n d 等( 2 0 0 1 ) 基于线粒体d n a l 6 sr r n a 序列数据发现采自四个地方的 劫t o s t i c h u ss i m u s ( c y r t a u c h e n i i d a e ) 的遗传差异达到了6 1 2 ，若以进化 时间作为标准应分为两个种，这意味着对某些扩散能力有限的蜘蛛类群而言，基 于形态特征的物种概念可能低估了进化上的多样性。后来b o n d ( 2 0 0 4 ) 又综合利用 地理的，形态的和分子数据来区分咖o m a s t u s 属( c y r t a u c h e n i i d a e ) 两种仅凭形 态无法鉴别的种类，同时还评价了分子数据在分类学中的作用，和很多其它学者 一样，他也认为分子数据作为一种分类形状，还是一定要建立在形态学分类体系 的基础上。p a q u i n 等( 2 0 0 4 ) 首次尝试用线粒体c o l 序列来鉴定濒危的c f c u r i n a ( d i c t y n i d a e ) 未成熟个体，尽管这显示了“分子分类学”的强大优势，但作者 同时也指出“分子分类学”必须以已有的综合分类系统( 包括形态、行为性状等) 为基础，建立“多维的”分类体系。此外，通过研究近缘种( 特别是那些在形态 上已分化成不同的种但还能杂交) 之间的遗传关系才能使人们更好地理解物种形 成过程。女n c r o u c h e r 等( 2 0 0 4 ) 就通过用线粒体c 0 1 ，1 6 sr r n a ，t r n a “和n d l 基因序列研究t e g e n a r e aa t t i c a 组( a g e l e n i d a e ) 3 种蜘蛛的遗传关系，可能存 在从工g j g a n t e a 至0 z 阳e 飓的不对称的基因渗入。 1 2 3 分子进化和系统发育重建 严格地讲，“分子进化”有两层含义：一是指生命起源时期的化学进化，即 有机分子由简单向复杂的演变；二是指生物进化过程中，构成生物体的大分子， 如蛋白质、核酸分子的演变。当前，所谓的分子进化，一般都是指后一层含意， 即生物大分子的进化( 周希橙等，1 9 9 2 ) 。本文的系统发育重建，是指根据生物 分子信息对传统的系统发育关系进行重新构建的过程。 分子数据的获得和分析，使人们开始考虑用它来修订基于形态特征的系统关 系。早在1 9 9 3 年，h u b e r 等就在用线粒体d n a l 6 sr d n a 序列对栉足科( c t e n i d a e ) 几种蜘蛛进行研究后提出应该根据分子序列数据对该科系统关系进行修订。分子 序列数据还可用于确定不同蜘蛛类群间的亲缘关系，如吴琛等( 2 0 0 2 ) 将1 2 s r r n a 基因序列分析用于研究若干重要蜘蛛类群的系统关系，得到结论：1 隙蛛与暗蛛 较漏斗蛛有更近的亲缘关系i2 壁钱( u r o c t e i d a e ) 与拟壁钱( o e c o b i i d a e ) 并不近 缘；作者还认为，1 2 s r d n a 适合推断近缘科属间系统关系。f a n g 等( 2 0 0 0 ) 分析 有筛器的褛网蛛( p s e c h r i d a e ) 线粒体1 2 s 及1 6 s 核糖体r n a ( r d n a ) 序列，与狼蛛 总科l y c o s o i d a e 间比较其亲缘关系。结果显示结漏斗网的褛网蛛与无筛器类狼 蛛，盗蛛，猫蛛等有较亲近的亲缘关系，反而与同属有筛器类但结圆形网的螺蛛 科( u l o b o r i d a e ) 亲缘关系较远。z e h e t h o f e r ( 1 9 9 8 ) 等对中欧的分属6 属、4 亚科的2 7 种狼蛛的1 2 s 核糖体基因序列测序，结果证明用于狼蛛科分类的大部分 表型特征都是合适的，而且还揭示t 3 类不同捕食方式的狼蛛的进化关系。v i n k 等( 2 0 0 2 ) 基于线粒体1 2 s 核糖体基因序列研究了1 1 种澳大拉珏亚狼蛛和古北区 和全北区种之间的关系，结果显示新西兰种类似乎与某些澳大利亚种有关系，而 不应被划入属于北半球的属，为建立更加科学、客观的分类系统提供了依据。 a r n e d o 等( 2 0 0 3 ) 对球蛛科( t h e r i d i i d a e ) 7 9 属中3 3 属的4 0 种和其它9 个科的代表 种，使用了约2 5 k b 基因片段( 3 个核基因：h i s t o n e3 ，1 8 sr d n a ，a n d2 8 s r d n a ； 2 段线粒体基因1 6 s r d n aa n dc 0 1 ) 深入研究了其系统发育关系。v i n k 等( 2 0 0 3 ) 测定了新西兰狼蛛科a n o t e r o p s i 娟2 0 种蜘蛛的线粒体基| 天 n d i 和c o l 序列。 综上所述，蜘蛛分子系统学的产生和发展为蜘蛛生物多样性研究带来了一次 突破，解决了一些有争议的问题。虽然利用一小片段的分子特征构建的分子系统 树可能与作为一个整体的种或种群的系统树不相同，但是通过对有代表性的样本 不同大小的多基因的评估，就能推出种群和近缘种间的系统进化关系，并且随着 基因序列研究的不断深入，人们获得的分子信息量大大增加，因此在蜘蛛系统进 化研究中建立使用遗传信息的最佳方法就变得愈显重要，这些将无疑使蜘蛛分子 系统学为蜘蛛生物多样性及系统进化研究提供一条重要途径。 1 3 皿蛛科蜘蛛系统学研究现状 皿蛛科( l i n y p h i i d a eb l a c k w a l l ，1 8 5 9 ) 是蜘蛛目中一个大科，分为皿蛛 亚科( l i n y p h i i n a e ) 和微蛛亚科( e r i g o n i n a e ) 。其种类数量仅次于跳蛛科 ( s a l t i e i d a e ) ，约占全球蜘蛛总数的l l ，广泛分布于世界各地，分布于各 种农林生态系统中，是农林害虫的一大类重要天敌。对皿蛛科蜘蛛进行全面的分 类学研究，将为更好的发挥这一动物类群在害虫综合防治等方面的作用提供理论 依据和实践指导。迄今为止，全世界已报道5 6 9 属、4 3 1 4 种，我国记载有2 7 4 种，分属于1 1 2 属( p l a t n i c k ，2 0 0 6 ；李枢强，2 0 0 5 ) 。皿蛛科的种类体小型至中 型，8 眼2 列，异型。额部较中眼区宽，无中窝。螫肢基部外侧有发生器。齿堤 有齿。下唇前缘增厚，隆起，可活动。颚叶平行，有毛丛。雌性触肢有爪。雄性 触肢无突起。副跗舟发达，步足细长，多刺。第步足胫节有2 根背刺；如仅 有1 根背刺，则在第1 或第1 i 步足的后跗节上有l 短刺，其外部形态结构见图l 。 自b l a c k w a l l ( 1 8 5 9 ) 创立了皿蛛科后，s i m o n 、0 p 一c a m b r i d g e 、b s s e n b e r g 、 c r o s h y b i s h o p 、s c h e n k e l 、d e n i s 等做了许多开创性的工作，描述了许多物 种。在过去的半个世纪中，l e h t i n e n ( 1 9 6 7 ) 、w i e h l e ( 1 9 5 6 ，1 9 6 0 ) 、m e r r e t t ( 1 9 6 3 ) 、s a a r i s t o ( 1 9 7 3 ) 、m i i l i d g e ( 1 9 7 7 ，1 9 8 4 ，1 9 9 3 ) 、b l e s t ( 1 9 7 9 ) 、 w u n d e r l i c h ( 1 9 8 6 ) 在各自的研究工作基础上，对皿蛛科的亚科分类系统各抒己 见。近几十年来，皿蛛科蜘蛛的分类学研究除了新种的记述和地区性的分类学研 究之外，更注重皿蛛科分类系统的修订，其中h e l s d i n g e n ( 1 9 6 9 ) 基于外生殖 器结构与功能对皿蛛亚科皿蛛属l i n y p h i a 的修订至今仍堪称经典。皿蛛科的分 类和系统学研究长期来主要依据的是外部形态结构，尤其是外生殖器的形态结 构。s a a r i s t o ( 1 9 7 3 ) 根据外生殖器结构给出褶蛛亚科定义，此后在其一系列论 文中开始对褶蛛亚科的种属逐一修订，目前共界定了褶蛛亚科7 9 属1 1 1 4 种。 b l e s t ( 1 9 7 9 ) 和m i l l i g e ( 1 9 8 4 ，1 9 8 6 ，1 9 8 8 ) 曾根据皿蛛的外雌器、额腺及 气管系统研究皿蛛科种上阶元分类和系统发育。同时h o r m i g a ( 1 9 9 4 ，2 0 0 0 ， 2 0 0 2 ) ，m i l l e r ( 1 9 9 9 ) 和m i i l e r h o r m i g a ( 2 0 0 4 ) 将支序分析( c l a d i s t i c a n a l y s i s ) 应用到皿蛛科的系统学研究中。他们利用形态和行为特征对皿蛛科及 其近缘类群、特别是微蛛亚科高级阶元系统发育分析进行了探索性的研究。由于 多数皿蛛种类个体很小，大多数种类只有卜3 硼，而且生殖器官结构复杂，采 集和鉴定都非常困难，加上极其丰富的多样性，使得其分类学及系统学研究存在 许多困难，已形成的分类系统尚不令人满意，存在很多问题。目前，皿蛛科分类 系统比较突出的问题是，已建立的属中，大量的属是单型属和少型属( 占7 9 ) ， 一半以上的属仅包含卜2 个种类，属内种间及属间关系也很不明晰，属上类群尚 无公允的体系。这给种类的描述、分类及系统学研究带来极大的不便。 图1 皿蛛的外部形态结构外形背面观( 仿r o b e r t s i9 8 7 ) 头胸部( c e p h a i o t o r a x ) ，眼( e y e s ) ，腹部( a b d o m e n ) ，螯肢( o h e lc e r a ) ，触肢( p a i p ) ，基节( c 。x a ) 转节( t r o c h s n t e r ) t 腿节( f e m u r ) ，膝节( p a t e li s ) ，径节( t i b i s ) ，后跗节( m e t a t a r s u s ) ，跗节 ( t a r s u s ) ，爪( t a r s a ic ia w s ) ，纺器( 8 p i n n e r e t s ) ，肛突( a n a it u b e r o i e ) 1 4 本项研究的目的和意义 本项研究以湖北、江西、广东等地区的蜘蛛为主要研究对象，在依据外部形 态分类鉴定的基础上，应用d n a 序列测定技术于皿蛛科蜘蛛的系统学研究，在国 1 4 内外同仁们研究工作的基础上，对我国皿蛛科蜘蛛各类群的分类地位和系统发育 关系进行深入的研究，试图构建说所涉及的皿蛛科蜘蛛分子系统树。其成果可为 进一步修订和完善皿蛛科分类系统，揭示其系统发育和演化提供分子水平的证 据，为蜘蛛分子系统学的发展提供新的资料和观点。 2 皿蛛科( l i n y p h i i d a e ) 蜘蛛分子系统学初步研究 2 1 引言 以o n a 序列研究物种的进化关系，大致分两大步骤：( 1 ) 根据研究的对象与目 的，选择适当的基因或其他d n a 区域，并测定目标d n a 片段的序列。对于近缘物 种的研究，应选用进化速度比较快的区域：对于远缘物种，则应选用相对保守的 区域：( 2 ) 通过d n a 同源序列的比较，采用一定的系统重建途径与方法，确定基因 系统树和物种系统树。 本研究选取的是一段线粒体序列( c o l 部分序列) 和一段核基因序列( 1 8 s r r n a 序列) ，这两段序列曾被用于蜘蛛种间和属间系统发育关系的研究( a r n e d o 等，2 0 0 4 ) 。 其中c o l 基因是m t d n a l 3 个蛋白质编码基因之一，该基因的产物是细胞色素 氧化酶亚基i ，后者是细胞色素氧化酶的重要组成部分。细胞色素氧化酶在呼吸 链电子传递和质子的跨膜反应中发挥着巨大作用，在真核生物中由多个亚基组成 其中亚基i ，i i 和i i i 由线粒体d n a 编码，其余为核基因编码。在遗传进化研究中， 细胞色素氧化酶亚基i ( c y t o c h r o m eo x i d a s ei ，c o i ) 是常用的分子标记( s i m o n 等，1 9 9 4 ) 。在鸟类、爬行动物、昆虫、甲壳动物系统重建过程中具有重要的意 义。许多学者已经将c 0i 序列应用于蜘蛛分子系统学的研究，例如，a r n e d o 等 ( 2 0 0 4 ) 将其用于研究球蛛科蜘蛛的系统发育关系：v i n k 等( 2 0 0 3 ) 将分子数据 与形态学数据结合起来研究新西兰狼蛛科( l y c o s id a e ) a n o t e r o p s i s 属2 0 种蜘 蛛的系统发育关系，结果支持a n o t e r o p s i s 属分成5 个组。 而核糖体由r r n a 和蛋白质组成，负责将m r n a 转译成蛋白质，是合成蛋白质的 “工厂”。r r n a 基因以及与之相邻的间隔区合称为核糖体d n a ，e 口r d n a 。它是一 种目前研究比较透彻的基因，常被用来推断物种间的进化关系，在节肢动物中得 到了广泛的应用( t u r b e v i l l e 等，1 9 9 1 ；w h e e l e r 等，1 9 9 3 ) 。1 8 sr r n a 是真核生 物染色体上编码核糖体小亚基r n a 的基因，由于1 8 sr r n a 基因序列及二级结构高 度保守，在蛋白质合成中具有重要的功能，一般认为它比较适合于研究高级阶元 的系统发育( 王瑛等，1 9 9 9 ) 。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 本研究所用的皿蛛采自广东、湖北、江西、云南等地的9 属2 3 种皿蛛，选取 了园蛛科( a r a n e i d a e ) 的角类肥蛛( l a r i n i o i d e sc o r n u t 8 ) 和球蛛科 ( t h e r i d i i d a e ) 的温室希蛛( a c 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