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几种黄酮类化合物清除活性氧及抗氧化能力的评价 捅斐 由于外界环境及人体自身新陈代谢，生物体内不断产生活性氧，它们化学性质活 泼，参与部分生物功能，然而过多的活性氧会损伤细胞，引发一系列疾病。当体内防御 活性氧体系失去平衡时，适时从体外补充具有活性的抗氧化剂是十分必要的。因此开发 及评价一系列安全、价廉、高活性的抗氧化剂具有十分重要的意义。 黄酮类化合物广泛分布于各种植物，迄今为止已从天然产物中发现了大量的黄酮类 化合物，其中大多数化合物具有重要的生理和药理作用。大量研究表明，黄酮类化合物 的很多药理作用与其抗氧化活性存在密切的联系。因此关于黄酮类化合物的抗氧化活性 的研究对其进一步地开发利用及其药理活性的研究具有重要的意义。 本文综述部分以近几年有关抗氧化剂及其抗氧化能力评价的文献为基础，简要介绍 了活性氧( r o s ) 、黄酮类化合物以及几种不同的抗氧化能力的测定方法，并对这些方 法做了比较。 本文的实验研究部分以四种黄酮类化合物作为研究对象测定了它们抗氧化活性的 大小，并且探讨了结构与抗氧化活性之间的构效关系，包括以下几方面内容： ( 1 ) 过氧化氢是生物体代谢过程中产生最多的活性氧，过量的过氧化氢会进一步 反应生成毒性和活性更强的羟自由基，从而对生物体的细胞膜、蛋白质以及d n a 等造成 损害。黄酮类化合物可以有效地清除体内过量的过氧化氢，因此，研究黄酮类化合物对 于过氧化氢的清除作用是非常有必要的。本文使用h 2 0 2 鲁米诺化学发光体系系统地测 定了白杨素、芹菜素、木樨草素和山萘酚对于h 2 0 2 的清除能力，并根据半数清除浓度e c 5 0 值对清除能力进行了比较，探讨了清除能力与结构的关系。实验结果表明，除了芹菜素 对化学发光体系有增敏作用以外，另外三种被测的黄酮类化合物清除过氧化氢的能力的 强弱顺序为山萘酚 木樨草素 白杨素，它们的5 0 值分别为1 2 x 1 0 。6 、4 7 x 1 0 击和 2 3 x 1 0 一m o l l 。根据实验结果，结合一些量子化学的计算结果，可以证实，在黄酮类化 合物的分子结构中，c 环3 位的取代羟基活性最强，b 环3 、4 位的取代羟基活性次之。 ( 2 ) 羟自由基是人体内破坏力最强的活性氧，黄酮类化合物作为性能良好的羟自 由基清除剂，可以帮助清除体内过多的羟自由基，使羟自由基在体内的含量维持在正常 水平。本文采用f e n t o n 体系作为羟自由基的生成体系，利用对苯二甲酸作为荧光探针对 反应体系中产生的羟自由基进行定量。同时，测定了白杨素、芹菜素、木樨草素和山萘 酚清除羟自由基的能力，比较了这四种被测的黄酮类物质清除能力的大小，研究了其清 除能力的构效关系。测得的白杨素、芹菜素、木樨草素和山萘酚的e c 5 0 分别为8 4 、7 1 、 6 8 和5 0 x 1 0 一m o l l 。测试结果表明，黄酮化合物清除羟自由基能力的强弱是其分子中 一些关键的结构协同作用的结果，对清除能力起主要作用的结构为c 环3 位的羟基和b 环上的羟基结构。 ( 3 ) 总抗氧化活性( t o t a la n t i o x i d a n ta c t i v i t y , t a a ) 是物质清除不同的自由基的有 效和，物质在体内起作用的正是其总的抗氧化能力，测定抗氧化物质的w 蚺是十分必 要的。本文使用d p p h 法和a b t s 法对于白杨素、芹菜素、木樨草素和山萘酚的有机相 和水相中的总抗氧化活性( t a a ) 进行了测定，通过两种方法数据的相互比较，推测四 种黄酮类物质抗氧化的构效关系以及反应的机理。结果表明，黄酮类化合物分子中b 环 上的酚羟基表现出较强的反应活性，而c 环上3 位的羟基的存在也使黄酮类化合物具有 比较高的抗氧化活性。 ( 4 ) 使用荧光法研究了铽离子与2 羟基对苯二甲酸( 2 o ht p a ) 在碱性条件下的 配合作用，发现2 - o ht p a 能够与e d t a 和t b ”形成t b 3 + - e d t a 2 o ht p a 三元配合物， 该配合物( 沁x = 3 3 0n n l ，k e m = 5 5 7n m ) 的光谱较2 - o ht p a 本身的荧光发射红移了 1 2 2n l i l ，这样可以避免某些物质光谱的干扰。本实验根据此现象建立了测定羟自由基的 新方法，并且使用此方法测定了丫山竹黄酮( 丫m a g ) 对羟自由基的清除作用。当2 - o h t p a 的浓度在6 x 1 0 培4 x 1 0 击m o l l 的范围内时，其荧光强度f 与浓度呈现良好的线性 关系，线性相关系数为0 9 9 8 0 ，本方法的检出限为4 6 x 1 0 j om o l l 。使用本方法测定 7 - m a g 对羟自由基的清除率为8 9 2 。 关键词黄酮类化合物，羟自由基，过氧化氢，d p p h ，a b t s ，稀土金属配合物 t h esc a v e n g i n ge f f e c tt o w a r d sr osa n dv i t r oa n t i o x i d a n t a c t i v i t yo fs e v e r a lf l a v o n o i d s a b s t r a c t r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a n df r e e r a d i c a l sa r e c o n t i n u o u s l y f o r m e dv i a e n v r i o n m e n t a li n f l u e n c ea n da e r o b i cm e t a b o l i s m i nh e a l t h ys u b je c t , t h e r ei sat i g h t l y c o n t r o l l e db a l a n c eb e t w e e nt h eg e n e r a t i o no fr o sa n dt h ec a p a c i t yo ft h ea n t i o x i d a n t p r o t e c t i v es y s t e m ，w h e r e a s ，e x c e s s i v er o sp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei na g i n ga n dp a t h o g e n e s i s f l a v o n o i d sa r eac l a s so fs e c o n d a r yp l a n tp h e n o l i c sw i t hs i g n i f i c a n ta n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s r e c e n t l y , f l a v o n o i d sw e r ea p p l i e dt om a n ym e d i c i n eo rf o o dp r o d u c t i o n sa san a t u r a l a n t i o x i d a n t si no r d e rt ok e e pt h eb a l a n c eb e t w e e nr o sa n dt h ea n t i o x i d a n tp r o t e c t i v es y s t e m o u rr e s e a r c hf o c u s e do nt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fs e v e r a lf l a v o n o i d s w h i c hh a v es i m i l a rs t r u c t u r e s ，a n da l s ot r yt of i n ds o m er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h es t r u c t u r e s o ff l a v o n o i d sa n dt h e i ra n t i o x i d a n ta c i v i t y t h em a i nc o n t e n t sa n de o n c l n s i o n sa r ea s f o l l o w i n g ： ( 1 ) t h es c a v e n g i n ge f f e c tt o w a r d sh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) o f4s l e e t e df l a v o n o i d s ( c h r y s i n ，a p i g e n i n , l u t e o l i na n dk e a m p f e r 0 1 ) w e r et e s t e db yc h e m i l u m i n e s c e n c e 嘶t h h 2 0 2 - l u m i n o ls y s t e m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ee f f i c i e n c yo ft h ep h y s i c a lq u e n c h i n gi s m a i n l yc o n t r o l e db yt h ep r e s e n c eo ft h eh y d r o x y lg r o u p so nr i n gba n dr i n gco ft h e m o l e c u l e s f l a v o n o i d sw h i c hh a v eh y d r o x y lg r o u p so np o s i t i o n3o fr i n gc ，p o s i t i o n4 a n d 3 o fr i n gbe x h i b i tt h es t r o n g e s ts c a v e n g i n ga c t i v i t y t h ee c s 0v a l u e so fc h r y s i n ，l u t e o l i na n d k e a m p f e r o lw e r e1 2 x 1 0 。6 ，4 7 x 1 0 。6 ，a n d2 3 x 1 0 5 m o l lr e l a t i v e l y ( 2 ) af l o u r o m e t r i cm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fs c a v e n g i n ge f f e c tt o w a r dh y d r o x y l r a d i c a l ( o h ) w a sp r e s e n t e d t e r e p h t h a l i ca c i d ( t p a ) w e r eu s e da sap r o b eo fo h ，w h i c h y i e l d sah i g h l yf l u o r e s c e n t2 - h y d r o x y lt e r e p h t h a l i ca c i df 2 一o ht p a ) p r o d u c t t h es c a v e n g i n g e f f e c to fe a c hs e l e c t e df l a v o n o i dw a sm e a s u r e db yt h em e t h o d , t h ee c s 0v a l u e so fc h r y s i n ， a p i g e n i n , l u t e o l i na n dk e a m p f e r o lw e r e8 4 ，7 1 ，6 8a n d5 0 10 一m o l l t h er e s u l ta l s o s h o w e dt h a th y d r o x y lg r o u p so np o s i t i o n3 ，4 a n d3 o fr i n gba n dr i n gca r et h em o s t i m p o r t a n tf a c t o r so f t h es c a v e n g i n ga c t i v i t y ( 3 ) t h et o t a la n t i o x i d a n ta c t i v i t y ( t a a ) o f t h e4s l e e t e df l a v o n o i d sw e r em e a s u r e db y i i d p p ha n da b t sm e t h o d s t h em e c h a n i s mo fr a d i c a ls c a v e n g i n ga n dt h es 廿u c t l l r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p sw e r ed i s c u s s e d ( 4 ) an e wm e t h o d f o rd e t e m a i n i n gt h e a c t i v i t y o fo h s c a v e n g e b yu s i n g f l u o r e s c e n t s p e c t r o c o p yw e r ed e v e l o p e d t h em e t h o dw a sb a s e do nt h ef o r m a t i o no ft h e2 - o h t p a t b 3 + e d l ac o m p l e x t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n e d t a t b 3 + c o m p l e xa n d2 - o ht p a h a v e b e e ns t u d i e db yu s i n gf l u o r e s c e n c es p e c t r a e d t a - t b 3 + c o m p l e xh a sb e e nu s e da sa f l u o r e s c e n tp r o b et od e t e c to h i n d i r e c t l y , a n dt h e nt od e t e r m i n et h eo h s c a v e n g i n ga c t i v i t y o f ? - m a n g o s t i nw h i c hh a saf l u o r e s c e n c es p e c t r u mt h a t w o u l do v e r l a p p e dw i t ht h e f l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fp u r e2 - o ht p a o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ef o r m a t i o no f2 - o h t p a t b a + - e d t ac o m p l e xw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h es c a v e n g i n ge f f i c i e n c yo fy m a n g o s t i n d e t e r m i n e db yt h em e t h o dw a s8 9 2 k e yw o r d s ：f l a v o n o i d s ，h y d r o x y lr a d i c a l ，h y d r o g e np e r o x i d e ，d p p h ，a b t s ，r a r ee a r t h m e t a lc o m p l e x e s 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：指导教师签名： 年月 日年 月 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 = 以 思。 学位论文作者签名： 年月日 西北大学硕上学位论文 第一章综述弟一早碌尬 黄酮类化合物广泛地存在于自然植物中，是植物次生代谢产物，不仅结构类型复杂 多样，而且数量种类繁多，表现出多种多样的药理活性1 捌，已成为当今天然产物研究 开发和利用的热点之一。已有研究表明，黄酮类化合物的许多药理活性与其抗氧化活性 之间存在非常重要的联系【4 】，因此作为潜在的抗氧化剂，对于黄酮类化合物的抗氧化活 性的研究也受到广泛的关注，对于黄酮类化合物体外抗氧化活性的研究是十分必要的， 可以为其作为药物或者保健品的选择以及进一步的开发利用提供一定的帮助。 1 1 自由基和活性氧及其检测方法的研究进展 1 1 1 简介 自由基( f r e er a d i c a l s ，f 黜) 是机体正常代谢的产物，它们是指那些游离存在的，含 有1 个或1 个以上不配对电子的分子、离子、原子或原子团。自由基的形成主要有电子俘 获法和共价键均裂法两种方式【5 】。前者是指带有成对电子的有机化合物或无机化合物俘 获了一个电子，就可因带有不成对电子而成为自由基，如0 2 + e _ 0 2 。后者是指共价 化合物均裂时共用的电子对被双方平均获得，所形成的产物即为自由基，如a ：b a + b 。体内活性物质代谢异常时可能产生自由基，如细胞硫醇和对苯二酚等发生自氧化或 蛋白酶等的催化反应都可引起自由基水平升耐6 1 。生物体的蛋白质、脂质和核酸极易被 自由基伤害，由于自由基在生物体内有很强的氧化反应能力，所以，过量的自由基会导 致机体的损伤 6 3 。同时，自由基也是机体内不可缺少的活性物质，它可作为第二信使参 与细胞信号转导 7 1 。正常情况下，机体的氧化与抗氧化机制处于一种动态平衡，但如果 体内自由基含量过高，则会导致由于自由基水平升高而导致的病理现象【8 】，即患病或衰 老等。 1 9 0 0 年，c o m b e r g 提出了“有机自由基( o r g a n i c f r e er a d i c a l ) ”这一概念【9 1 。此后， 大量关于自由基的医学和生命科学研究迅速广泛地开展起来。2 0 世纪5 0 年代，h a r m a n 提 出了“自由基学说( f r e er a d i c a lt h e o r y ) ，并于1 9 5 6 年发现放射线诱导突变和诱发肿瘤 的发病机理与自由基有关【1 0 l 。m c c o r d 和f r i d o v i c h 于1 9 6 8 年报道了超氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 在抗氧化方面的生物学作用，开创了自由基生物学的新篇 章【1 1 1 。 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是指由氧形成并在分子组成上有氧元素的一 类化学性质非常活泼的物质的总称12 1 ，包括超氧阴离子( 0 2 - ) ，羟自由基( o h ) ，过 第一章综述 氧化氢( h 2 0 2 ) ，单线态氧( 1 0 2 ) ，三线态氧( 3 0 2 ) 等。活性氧自由基的来源主要有两 个方面1 3 】：一是电离辐射、某些药物、酒精的摄入，还有吸烟或高压氧中毒等，这些称 外源性自由基；二是机体在代谢过程中产生自由基，即内源性自由基，生物细胞中的线 粒体就是产生活性氧的重要场所1 4 1 。过量的活性氧对细胞膜、脂肪组织和蛋白质都会产 生影响，从而引起疾病1 15 1 ，表1 1 y 1 出了常见的活性氧。 表1 1 常见的活性氧 中文名称英文名称符号 过氧化氢h y d r o g e np e r o x i d e h 2 0 2 羟自由基h y d r o x y l r a d i c a lo h 单线态氧 s i n g l e to x y g e n1 0 2 超氧阴离子 s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l 0 2 氧有机自由基 o x y g e no r g a n i cf r e er a d i c a l r o 有机过氧基 o r g a n i cp e r o x i d er a d i c a l r o o 脂自由基l i p i d f r e er a d i c a ll 脂过氧基l i p i dp e r o x i d er a d i c a l l o o 1 1 。2 过氧化氢的生物活性及检测方法 过氧化氢( h 2 0 2 ) 作为一种强氧化剂，具有消毒杀菌等功能，在食品生产中被广泛 使用1 1 6 1 。过氧化氢在使用过程中会产生大量活泼的羟自由基，具有极强的氧化性。毒理 学的研究表明，吸入过量的过氧化氢会使人中毒，较少量的过氧化氢就会对人体黏膜产 生强烈的刺激作用【1 7 】。同时，过氧化氢还是生物体内主要的活性氧之一，适当浓度的过 氧化氢可以作为第二信使分子参与信号传导途径，调节细胞代谢【1 8 9 1 ，过氧化氢虽不是 自由基，但分子中含有较易断裂的过氧键，常被诱发均裂，产生羟自由基【2 0 l ，另外，过 氧化氢还会引发生物体多种细胞的生化反应，引起生物细胞的坏死和凋亡【2 1 l ，冯星等【2 2 l 研究发现，过氧化氢能够损伤h 9 c 2 大鼠心肌细胞d n a ，并诱导细胞凋亡，l e n n o n 等【2 3 1 用过氧化氢( 1 0 1 0 0g m o l l ) 诱导h l 6 0 细胞发生凋亡，而当浓度继续升高时，便会导 致大量细胞坏死。 因为过氧化氢具有非常重要的生理作用，所以对于过氧化氢含量的检测对于某些疾 病的预防、诊断以及病理的研究都具有十分重要的指导意义。目前，对于生物细胞内的 2 西北大学硕士学位论文 过氧化氢检测，主要使用的是荧光探针【2 4 , 2 5 】，如徐克花等闭利用荧光素二磺酸酯( f s 1 ) 和二氯荧光素二磺酸酯( f s 2 ) 两种螺环内酯型化合物，对活细胞内过氧化氢的含量进 行检测。实际上，人们已经可以应用某些荧光探针来测量健康的或是受到疾病侵害的各 种组织的线粒体所产生的过氧化氢1 2 7 1 。而对于过氧化氢的体外检测不仅对食品药品等的 生产安全具有重要意义，同时还可以用于测定抗氧化剂清除过氧化氢的能力，因此对于 抗氧化剂的评价和筛选也具有指导作用。 1 1 3 羟自由基的生物活性及检测方法 羟自由基( o h ) ，又被称为侵袭性自由基，是最活泼的活性氧，它在一些生物学功 能上和许多病理生理学过程中具有重要作用1 2 引。羟自由基可以引发不饱和脂肪酸发生脂 质过氧化反应，能够损伤多种生物分子膜结构及功能【2 9 1 ，由此过量的羟自由基常常引起 一些严重的疾病，如肿瘤、心血管疾病、肺气肿、衰老等。许多学者【3 0 。2 1 提出引起生物 系统损伤的自由基主要是羟自由基，并且一旦形成，羟自由基便参加最初的链反应从而 造成氧化损伤。羟自由基可以和d n a 碱基发生反应继而造成碱基的损伤，主要表现为氢 抽提、电子转移和加成。抽氢的反应主要发生在胸腺嘧啶的甲基基团和脱氧核糖的c 原 子上，5 + c 原子抽氢反应发生的概率一致 8 1 。此外，羟自由基和碱基还能发生电子转移， 即o h 转变为o h 。，而碱基则变为相应的碱基自由基，从而造成碱基损伤。羟自由基与 d n a 碱基杂环的双键加成反应发生在嘧啶碱基的c 5 和c 6 位，分别生成c 5 o h 和c 6 o h j j i 合物自由型8 ，3 2 1 ，d i z d a r o g l um 等例研究表明，当o h 攻击嘌呤碱基时，加成反应发生在 c 4 、c 5 及c 8 位上。在o h 攻击下，脱氧核糖遭破坏，磷酸二酯键发生断裂或碱基遭破坏 或脱落。 由于羟自由基极短的存在时间和极高的活性，要对其进行直接测定几乎是不可能 的。通常测定o h 的方法包括电子自旋共振( e s r ) 1 3 4 1 ，高效液相色谱法( h p l c ) 3 5 , 3 6 ， 化学发光法( c l ) 1 3 7 , 3 8 ，电化学方法 3 9 - 4 1 】，分光光度法【4 2 1 以及荧光测定澍4 3 1 ，然而e s r 技术具有很好的灵敏度，但是需要昂贵的仪器设备，电化学方法的操作简单快速，但是 重现性也不能令人满意，h p l c 方法的重现性很高，但是操作较为复杂，而分光光度法 的操作简便，但是灵敏度较低，化学发光法灵敏度高，但是选择性较差。相较以上方法， 荧光测定法简单易操作，具有高的选择性和灵敏度，因此具有广泛的应用前景。 1 1 4 其他活性氧的生物活性和检测方法 除了过氧化氢和羟自由基以外，被研究较多的活性氧还有超氧阴离子( 0 2 - ) 和单 线态氧( 1 0 2 ) 等。在生物体中，超氧阴离子主要是由呼吸链电子传递过程中漏出的单 第一章综述 电子直接传递给氧气生成的【4 4 1 ，同时，超氧阴离子还可以引发产生单线态氧、羟自由基 等更加活泼的活性氧。单线态氧不同于氧气，它是一种极不稳定的激发态氧分子【4 5 】，它 广泛存在于自然界中，如有机体的代谢，生命过程中的生物氧化，空气污染物的光转化， 人工聚合物的降解等过程中都会不断生成单线态氧。单线态氧能够氧化半胱氨酸、组氨 酸、色氨酸、蛋氨酸和酪氨酸残基，使蛋白质丧失功能，并可使油醛3 磷酸脱氢和酶醇 胱氢酶解旋表观自由能a g 增加( 易变形解旋) ，可使酶蛋白分子发生分子内或分子间 交联，构型改变而失活或暴露出某些隐蔽的肽键而易遭蛋白酶的水解【4 6 1 ，这些作用将造 成有机体的损坏，包括对细胞膜的损伤致变作用、再生的改变等，过多的单线态氧可能 会在动物体和人体中引起许多蛋白质光氧化疾病。 除了常规的分析方法如分光光度法或荧光法外，测定超氧阴离子的方法还有光氧化 增强法【4 7 1 、免疫分析法【4 8 】等。 1 2 黄酮类化合物的研究概况 活性氧自由基是机体正常代谢的产物，过量的活性氧会引起细胞的氧化及病变，从 而造成机体的疾病、衰老等。因此保证体内活性氧的含量处于正常水平是保证健康的重 要前提。除了机体自身的调整，还可以通过摄入一些具有抗氧化性的物质来清除体内过 多的活性氧，维持体内氧化和抗氧化的平衡。黄酮类化合物就是这样一类具有抗氧化活 性的物质。 1 2 1 黄酮类化合物简介 黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，通常以游离态或与 糖结合成甙的形式存在。自上世纪2 0 年代以来，国外开始把槲皮素和芦丁用于临床， 自此，黄酮类化合物开始引起人们的广泛关注。1 9 9 9 年，c h r i s t i n e 在英国伦敦发起了 “w a k eu pt ot h ef l a v o n o i d s 学术讨论会【4 9 1 ，探讨黄酮类化合物的生物学价值以及对于 其药用价值的开发。 黄酮类化合物不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，因此，表现出多种多样 的药理活性。黄酮类化合物有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗菌等药用特性，可以对毛细血 管的脆性与渗透性进行调节，从而保护心脑血管系统【5 0 】。同时黄酮类化合物还具有抗氧 化、降低血糖、延缓衰老、增强免疫和抗肿瘤等多种保健功能，其中的大豆异黄酮是天 然的植物性雌性激素5 1 1 。此外，黄酮类化合物作为重要的功能性食品添加剂、天然色素、 天然甜味剂等，具有护肤美容和保鲜等作用。目前，黄酮类化合物己成为当今天然产物 4 两北大学硕u 1 ：学位论文 研究开发以及应用的热点之一，在医药、食品等领域具有非常广阔的应用前景。 黄酮类化合物一般以糖甙的形式存在于植物中，芹菜素、木樨草素、儿茶素和花青 素等都属于黄酮类化合物，除了蔬菜和水果之外，一些种子、坚果、谷物、香料和药用 植物中也有类黄酮化合物的存在。一些饮料如葡萄酒、茶和啤酒中也含有丰富的黄酮类 物质【5 2 1 ，因此这样的饮料也具有很好的保健功效。芹菜素和木樨草素通常存在于如欧芹 迷迭香、百里香这样的谷类和香草中【5 3 】。而它们的氢化衍生物橙皮素和柑桔甙却几乎只 存在于柑橘中。槲皮素在洋葱中的含量最高。大多数异黄酮则存在于豆类中，包括大豆、 黑豆、绿豆以及豌豆【5 4 】。儿茶素、表儿茶素等物质在茶叶中的含量相对较高【5 5 】。花青素 和它的糖甙物是天然的染料，在浆果和红葡萄酒中含量非常丰富【5 6 1 。人们对类黄酮的摄 入量要远远高于对维生素c ( 7 0m d a y ) ，维生素e ( 7 1 0m g d a y ) 、类胡萝卜素( 2 3 m g d a y ) 的摄入量【5 7 】。 黄酮类化合物主要是指以2 苯基色原酮为母核的化合物，现在泛指两个具有酚羟基 的苯环( a 和b 环) 通过中央三碳原子相互连结而成的一系列c 6 c 3 c 6 化合物。其基本 结构【5 8 1 如图1 1 ，天然黄酮类化合物多是此基本结构的衍生物，a 、b 环上的取代基一般 为羟基、甲氧基和异戊烯基以及萜类侧链等，大部分与糖结合成甙类，以配基的形式存 在，只有少部分以游离形式存在。目前已经鉴定结构的黄酮类化合物已达6 0 0 0 余种， 包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、黄烷酮、花青素、查尔酮和色原 酮等【5 9 】。 r 7 图1 1 黄酮类化合物的基本结构 f i g1 1 t h eb a s i cs t r u c t u r eo f f l a v o n o i d s 很多研究表明，黄酮类化合物的抗氧化活性与其所具有的美容、抗癌、抗衰老等保 健作用有密切的联系【鲫，因此对于黄酮类化合物抗氧化活性的测定对于黄酮类化合物的 选择及应用都具有一定的指导作用。黄酮类化合物由于结构的不同，其所表现出的抗氧 化活性差异非常大。一些研究表明，a 环7 位羟基糖甙化和c 环2 3 位双键氢化可能引 5 第一章综述 起黄酮类化合物的活性降低。a 、b 、c 三环的特定的取代基决定了其抗氧化活性的强 弱，同时也决定了其独一无二的药理活性。 1 2 2 白杨素的研究概况 白杨素( c h r y s i n ) 是一种从紫葳科植物木蝴蝶中提取的具有广泛生物活性的黄酮类 化合物，结构如图1 2 所示，在蜂胶剐和杨属植物的树皮、花、叶中【6 2 】，白杨素也大量 存在。白杨素具有抑制多种肿瘤细胞的生长的功能，国内外关于其在食道癌、宫颈癌、 淋巴瘤等肿瘤的治疗作用的研究较多6 3 彤】，康颖等研究了白杨素对于胃癌细胞的抑制机 珲【鲫。 h o 【) h【) 图1 2 白杨素的结构 f i g1 2 t h es t r u c t u r eo fc h r y s i n 1 2 3 芹菜素的研究概况 芹菜素( a p i g e n i n ) 又称芹黄素( 结构如图1 3 所示) ，是一种广泛存在于水果、蔬 菜、豆类、茶叶中的黄酮类化合物，在芹菜中的含量最高。研究发现它具有降压、抗炎、 镇静等作用【6 7 1 ，其中以其抗肿瘤作用最为突出，并且与槲皮素等其它黄酮类物质相比， 芹菜素具有低毒、无诱变性等特点【6 引。芹菜素的抗肿瘤作用主要表现在抗肿瘤细胞增殖、 诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、干扰肿瘤细胞的信号传导途径等方面【6 9 1 。 h o o h o ho 图1 3 芹菜素的结构 f i g1 3 t h es t r u c t u r eo fa p i g e n i n 1 2 4 木樨草素的研究概况 木樨草素( 1 u t e o l i n ) 也称为木犀草素，是一种重要的黄酮类化合物，木樨草素在自 然界分布广泛，目前发现主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、 6 两北大学硕 ：学位论文 黄芩属等天然药物和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中，其它如橄榄油和红酒等 食品中以及野风仙花、百里香草和唇形科植物筋骨草等也含有较多的木樨草素【7 0 】。近年 研究表明木樨草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等作用【7 l ，7 2 1 ，张毅等研究发 现木樨草素在体外能抑制环氧合酶2 ( c o x 2 ) m r n a 及蛋白表达，同时降低n f r b 的 d n a 结合活性和蛋白表达，其抗炎机制可能与此有关。 o h h o o ho 图1 4 木樨草素的结构 f 逛1 4 t h es t r u c t u r eo fl u t e o l i n 1 2 5 山萘酚的研究概况 山萘酚( k a e m p f e r 0 1 ) 属于黄酮醇类物质，主要来源于姜科植物山萘( k a e m p f e r i a g a l a n g a l ) 根、茎以及檀香科植物百蕊草的提取物 7 4 1 。山萘酚具有抗菌、止咳的功效， 能够治疗支气管炎，还可以治疗心脑血管系统的疾病【7 5 】。主要被应用于抗癌、抗癫痫、 抗炎抗免疫【7 6 j 等方面。山萘酚也是活性较好的抗氧化剂，同时还具有解痉、抗溃疡、利 胆利尿剂、止咳、降低血脂及胆固醇作用【77 。 h o o ho o h 图1 5 山萘酚的结构 f i g1 5 t h es t r u c t u r eo fk a e m p f e r o i 上述四种黄酮类化合物具有相同的母环结构，是具有不同羟基取代位置的系列衍生 物，本文期望通过对这四种黄酮类化合物的抗氧化活性的研究找到这类物质的结构与抗 氧化活性的关系，通过对实验数据的分析得到一定的规律，从而为黄酮类化合物作为潜 7 第一章综述 在的抗氧化剂的筛选提供一些基础的实验数据以及理论依据。 1 3 抗氧化剂抗氧化活性的评价体系 在解释纯化合物和植物提取物抗氧化活性时要注意明确测定方法、条件和体系，而 且所选择检测方法最好能够针对抗氧化剂的潜在活性。虽然体内实验法更加接近生物体 实际体系，而且比较灵敏度较高，但实验周期长、成本大，且实验方法较为繁琐，所以 大量样品的抗氧化活性的筛选和比较仍然有赖于体外的实验方法。 1 3 1 对于过氧化氢清除能力的评价体系 测定抗氧化剂清除过氧化氢的清除能力的方法，主要是通过对过氧化氢的体外检测 的方法改进而得到的，通常对于过氧化氢的体外检测主要有滴定法、分光光度法【1 7 1 、色 谱法【7 8 1 和荧光方法 7 9 , 9 0 】等，滴定法和分光光度法操作简便，但灵敏度较低，而色谱法的 灵敏度高，稳定性好，但操作相对较为复杂，因此，对于过氧化氢的体外检测使用较多 的还是化学发光法【8 1 硼，在碱性条件下，过氧化氢能够和多种化学发光试剂组成灵敏度 高选择性好的化学发光体系，林金明等就针对过氧化氢的测定开发了一系列高灵敏度的 化学发光分析法【8 7 。8 9 1 。化学发光法也会被用于评价抗氧化剂体外清除h 2 0 2 的能力。 1 3 2 对于羟自由基清除能力的评价体系 清除o h 能力的评价体系主要使用的是分光光度法和荧光法。臧运波等 9 0 l 利用羟自 由基氧化荧光素钠造成其荧光猝灭的原理测定了常见的几种水果的抗氧化性。方光荣等 【9 l 】研究了o h 与c e 3 + 在酸性条件下的反应，具有强荧光的c e 3 + 被氧化生成无荧光的c e 4 + ， 采用荧光流动注射法测定反应前后荧光强度的下降，从而间接测定了羟基自由基的含 量，此方法可作为在线筛选抗氧化剂以及在线测定羟基自由基的方法。辛淑敏等【9 2 j 根据 无荧光的对苯二甲酸与o h 反应形成强荧光的羟基对苯二甲酸加成物，使用激发波长 3 1 5n i r l ，发射波长4 2 5n i n 检测经物理因素( u v 照射) 及f e n t o n 反应处理后水溶液中产 生的羟基自由基，并探讨了血卟啉衍生物( h p d ) 的光敏作用机理。唐波等1 9 3 】用对苯二 甲酸钠为荧光探针，利用c 0 2 + h 2 0 2 体系产生羟自由基，测定羟基化产物2 羟基对苯二酸 钠在4 3 1n i n 处的荧光峰值，从而间接测定体系产生羟自由基的相对量。c h a o 等畔】用 d m s o 捕获羟自由基，反应生成甲醛，然后与氨和1 ，3 环己二酮反应，最终的反应产物 具有特征性荧光( 激发发射波长= 4 0 0 4 4 5 2 3 n m ) 。本文通过研究稀土金属离子t b 3 + 与2 o ht p a 的配合作用，建立了测定羟自由基的新方法。 1 3 3 其他活性氧清除能力的评价体系 8 西北大学硕士学位论文 对于其他活性氧的体外清除作用同样主要是通过分光光度法、化学发光法以及荧光 法等分析方法完成的。李永利和张英 9 5 , 9 6 1 采用邻苯三酚自氧化法分别测定t s o d 和竹叶 提取物清除超氧自由基的活性。a r u o m a 纠9 7 l 利用次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系产生的超 氧阴离子自由基与硝基蓝四唑发生反应，所得产物在5 6 0n 1 1 1 处有吸收峰，根据吸光值的 减少判定样品清除超氧阴离子的能力。c o s t a 等1 9 8 j 报道了以物质d h r 作为检测单线态氧 的荧光探针，并将其应用于抗氧化剂与单线态氧的反应体系中，测定了维生素c ，青霉 胺、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸和叠氮化钠等物质清除单线态氧的能力。 1 3 4 总抗氧化活性的评价体系的概况 随着各种抗氧化剂的逐步开发和利用，人们逐渐将目光投向如何筛选有良好活性和 特异性的抗氧化剂上，建立了一系列测量抗氧化活性的方法、体系和指标。已有的一些 针对抗氧化剂清除某种活性氧能力的测定体系，如使用f e n t o n 体系测定羟自由基的清除 能力 9 9 1 ，黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系测定超氧阴离子的清除能力【1 0 0 1 等，由于测定方法和 条件不同，同一种抗氧化剂能力的测定往往有很大差别。因此目i j 用于体外测定物质抗 氧化能力的方法有比色法、化学发光法、荧光法、电子自旋共振( e s r ) 法等，但大多 数是针对物质清除某一种自由基而言，并不能反映出其总的抗氧化能力，因为物质总的 抗氧化能力是物质清除不同的自由基的有效和，鉴于物质在肌体内起作用的正是其总的 抗氧化能力，因此用总的抗氧化能力( t o t a la n t i o x i d a n ta c t i v i t y ，t a ao rt o t a la n t i o x i d a n t c a p a c i t y ，t a c ) 来评价物质的抗氧化能力是很有必要的【l 0 1 】。 测量总抗氧化能力的方法体系可以分为基于电子转移( e t ) 和氢原子转移( h 盯) 的两类【10 2 】。基于电子转移的方法体系包括抑制低密度脂质自氧化法、氧自由基清除能 力( o r a c ) 法，以及总自由基清除能力( t r a p ) 法，这些方法使用不同的有色的具有 不同标准电位的氧化还原试剂，在这类方法中，抗氧化剂被有色的氧化还原试剂氧化， 电子从抗氧化物传递至氧化物。基于氢原子转移的方法体系包括a b t s 法、d p p h 法和 f r a p 法等，这类方法通常是利用一种自由基引发剂产生一种氧化性的自由基，自由基 继而从抗氧化剂分子中得到一个氢原子。因此，氧化性自由基与目标分子探针之间的反 应就会受到阻碍或抑制。通过光度法测量氧化物吸收值的变化，对抗氧化剂的抗氧化能 力进行评价。基于氢原子转移的方法通常在水或水乙醇体系中进行，而被测的抗氧化 物在这些体系中的溶解度不尽相同，故这类方法受溶剂的影响较大，因此应该使用两种 或以上的测定方法来对抗氧化剂进行评价。本章将着重介绍a b t s 法和d p p h 法这两种 总抗氧化活性的测定方法。 9 第一章综述 1 3 5d p p h 法的方法原理及应用 1 3 5 1d p p h 法的方法和原理 二苯代苦味酰自由基( 1 ，1 - d i p h e n y l 一2 一p i c i y l h y d r a z y lf r e er a d i c a l ，d p p h ) 紫外一可见分 光光度法是近些年来发展起来的一种筛选抗氧化剂的简便方法，其原理是利用d p p h 溶 液在5 1 7r 吼左右的特征吸收峰，当具有自由基清除能力的抗氧化剂存在时，由于抗氧 化剂与d p p h 的单电子配对，继而使其吸收逐渐消失，且其褪色程度与其接受的电子数 成定量关系，因此可用紫外一可见分光光度法进行定量分析，样品的抗氧化活性可以通 过清除d p p h 的量来评价。该方法具有简便、灵敏、直接等特剧1 0 3 】。d p p h 与抗氧化 剂( a h ) 的反应如下式【1 叫所示： d p p h 斗a h