（微生物学专业论文）sulfobacillus+sptpy在铜离子和汞离子胁迫下基因差异表达研究.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 微生物是地球上最大的生物资源宝库，嗜酸浸矿微生物作为其一个重要的组 成部分，由于生长环境的特殊性，在长期的自然选择压力下，使得它们具有了独 特的代谢途径和防御机制来适应这种对大多数生物来说都难以生存的极端环境 ( 低p h 和高浓度重金属离子) 。因此浸矿微生物所特有的抵抗重金属离子的防 御机制，成为了人们可开发利用的重要生物资源，从中分离和提取新颖的基因、 蛋白质和其他的生物活性物质在基因工程、蛋白质工程、环境工程以及矿产资源 的开发利用上均有很大的应用价值。 本文从太平洋热液区样品中分离纯化到一株中等嗜热嗜酸菌。对该菌的形 态、生理生化特征以及1 6 sr d n a 序列进行研究，鉴定该菌为硫化芽胞杆菌 ( s u z f o b a c i l l u s ) ，命名为s u l f o b a c i l l u ss p t p y 。t p y 菌为短杆状，革兰氏阳性菌， 大小为o 3 o 5 x 2 o 2 5 u m ；最适生长温度为5 0 左右，最适生长p h 值1 8 ；该 菌既能利用亚铁、单质硫自养生长，也能够利用酵母粉、葡萄糖、蛋白胨和甘油 等有机物异养生长；以亚铁或单质硫为能源生长时，添加少量酵母提取物，细菌 更易生长。此外，t p y 也能氧化黄铜矿和黄铁矿。 菌株t p y 具有较强的c u 2 + 和h 孑+ 抗性，它能够在5 0 m mc u 2 + 或者是1 0 西m m h 孑+ 的环境中较好的生长。因此我们采用r n a 差异显示技术( d d r t - p c r ) ，以 0 m m 的c u 2 + 作为对照，研究t p y 在5 0 m m 的c u 2 + 条件下基因表达的差异：同 时以0 m m 的h 9 2 + 作为对照，研究t p y 在1 0 击m m 的h 孑+ 条件下基因表达的差 异。通过对随机引物p c r ( r a n d o ma r b i t r a r i l yp r i m e dp c r ，r a p p c r ) 优化，差 异基因筛选的阳性率得到了极大地提高。在不同浓度c u 2 + 条件下，我们筛选得 到5 7 个差异片段，选取了其中的3 2 个差异片段进一步用n o r t h e r n b l o t 进行验证， 其中有1 8 个差异基因证实在转录水平上存在着表达差异。在不同浓度h 矿+ 条件 下，我们筛选得到4 8 个差异片段，选取了其中的2 3 个差异片段进一步用n o r t h e r n b l o t 进行验证，其中有1 4 个差异基因证实在转录水平上存在着表达差异。这些 基因主要涉及细胞膜表面结构的改变、离子转运、抗氧化修复、转录调控以及生 理代谢的适应性调整。这些基因比较全面的反映嗜酸硫化芽胞杆菌对高浓度重金 属离子环境整体的适应性，将有助于阐明嗜酸浸矿微生物对高浓度重金属离子的 适应性机制。 关键词：重金属离子抗性机制，嗜酸硫化芽胞杆菌，差异表达基因，浸矿微 生物 硕士学位论文 摘要 a bs t r a c t m i c r o o r g a n i s mi st h em o s ta b u n d a n tb i o l o g i c a lr e s o u r c eo nt h ee a r t h ， a n d a c i d o p h i l i cb i o l e a c h i n gm i c r o o r g a n i s m i so n eo ft h e i m p o r t a n t m e m b e r s t h e s em i c r o o r g a n i s mh a v ed e v e l o p e da nu n i q u em e t a b o l i s m p a t h w a y sa n dr e c o v e r ym e c h a n i s mt oa d a p tt oe x t r e m ee n v i r o n m e n t ( 1 0 w p ha n dh i g hc o n c e n t r a t i o no fh e a v ym e t a li o n s ) ，w h i c hi si m p o s s i b l ef o r m o s tm i c r o o r g a n i s m t h u st h eh e a v ym e t a l sr e s i s t a n tm e c h a n i s mo f b i o l e a c h i n gm i c r o o r g a n i s mb e c o m i n ga ni m p o r t a n tb i o l o g yr e s o u r c e t h e n e wg e n e s ，p r o t e i n sa n dt h eb i o l o g i c a la c t i v em a t e r i a l s m a yp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei ng e n ee n g i n e e r i n g ，p r o t e i ne n g i n e e r i n g ，e n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r i n ga n de x p l o i t i n go fm i n e r a lr e s o u r c e s am o d e r a t et h e r m o p h i l i ca c i d o p h i cb a c t e r i u mw a si s o l a t e df r o m h y d r o t h e r m a lv e n to ft h ep a c i f i co c e a n b a s e do nt h em o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f16 sr d n as e q u e n c e ，t h es t r a i ni si d e n t i f i e da s s u l f o b a c i l l u s ，n a m e ds u l f o b a c i l l u ss p t p yt h es t r a i nt p yi sg r a m p o s i t i v e ，r o d s h a p e di n ( o 3 - 0 5x 2 o 2 5 u m ) t h eo p t i m a lg r o w t h t e m p e r a t u r ei sa b o u t5 0 ，t h eo p t i m a lp hi s1 8 t h et p ys t r a i nn o to n l y c a nu t i l i z ei r o na n de l e m e n ts u l 几ra se l e c t r o nd o n o r ，b u ta l s ou t i l i z ey e a s t e x t r a c t s ，g l u c o s e ，p e p t o n ea n dg l y c e r 0 1 w h e nu s i n gf e r r o u si o n so r e l e m e n ts u l f u ra se n e r g ys o u r c e ，m i x e dw i t hf ll i t t l ey e a s te x t r a c t s ，t p y g r o w nb e t t e r t p yc a na d a p tt oh i 幽c o n c e n t r a t i o no fc u 2 + o rh 9 2 + ，w h i c hc a n g r o wi n 50 m mc u 2 十o r10 6 m ih g 砷t h u sr a n d o ma r b i t r a r i l yp r i m e d p c r ( p a p - p c r ) w a su s e dt oi s o l a t ea n di d e n t i f yd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d g e n e so fb a c t e r i ag r o w ni n50 r a mc u 2 + c o m p a r e dt ot h o s eo f0m mc u 2 + ， a n dg r o w ni n10 。6 m m h 9 2 + c o m p a r e dt ot h o s eo f0m mh 9 2 + ，r e s p e c t i v e l y t h el 乙廿一p c rw a so p t i m i z e da n dt h e p e r c e n t a g eo fp o s i t i v ec d n a f r a g m e n tw a sr e m a r k a b l yi n c r e a s e d 5 7d i f f e r e n t i a lc d n af r a g m e n t si n t o t a lw e r ei s o l a t e d ，a n d3 2d i f f e r e n tc d n a sw e r ea n a l y z e db yn o r t h e m b l o t ，a m o n gw h i c h18w e r ec o n f i r m e dt ob ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da tt h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l su n d e rd if f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + a n d4 8 d i f f e r e n t i a lc d n af r a g m e n t si nt o t a lw e r ei s o l a t e d a n d2 3d i f f e r e n t i i c d n a sw e r ea n a l y z e db yn o r t h e r nb l o t ，a m o n gw h i c h14w e r ec o n f i r m e d t ob ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e da tt h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l su n d e rd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fr i 9 2 + t h e s eg e n e sr e f l e c t e dap r o f i l eo fo r g a n i s m a la d a p t a t i o n ，a n dw e r e i n v o l v e di nm a n yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s s u c ha sc e l lm e m b r a n e a l t e r a t i o n s ，i o n st r a n s p o r t i o n ，a n t i o x i d a t i o nr e c o v e r y , r e g u l a t o r ya d a p t i v e r e s p o n s ea n dm e t a b o l i s m t h i ss t u d yp r o v i d e sab e t t e ru n d e r s t a n d i n go f t h ea d a p t a t i o no fb i o l e a c h i n gb a c t e r i at oh i g hc o n c e n t r a t i o no fh e a v y m e t a li o n s k e yw o r d s ：r e s i s t a n tm e c h a n i s mo fh e a v ym e t a li o n s ，s u l f o b a c i l l u s s p t p y ，d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e ，b i o l e a c h i n gb a c t e r i a i i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：划日期：珥年丝日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 储签名：础阻吲币签名融蜂吼珥年月堕 硕士学位论文第一章前言 1 1 浸矿细菌研究进展 第一章前言 生物冶金技术是一种利用微生物的催化氧化作用，将矿物中的金属以离子形 式溶解到浸出液中并回收的方法。目前国内外已成功的利用该技术从多种低品 位、难处理矿石中提取出铜、金、镍、银、锌、铀等金属【l 】。这种技术具有易操 作、投资少、成本低、能耗少的特点，更重要的是其资源利用率高且对环境危害 小，在资源短缺和环境污染日益严重的今天更加引起了人们的重视【2 1 。随着对资 源可持续发展和环境保护的日益重视，以及冶金技术、微生物学、生物化学和分 子生物学的发展，生物冶金技术即将成为2 1 世纪重要冶金技术之一。 中国是世界上最早利用生物冶金技术的国家，早在公元前2 世纪，就有记载 用铁从硫酸铜溶液中置换铜的化学作用，堆浸在当时就是生产铜的普遍做法。不 过是在采铜和铁过程中不自觉地利用了自发生长的某些自养细菌浸矿。西汉淮 南万毕术里有“白青( 硫酸铜) 得铁则化为铜”的描述。在公元1 1 世纪大量应用 了这种工艺，北宋时代又记载有“胆水浸铜”，产铜占当时总产量的1 5 - - 2 5 ， 仅江西铅山铜采矿场就年产1 9 x 1 0 4 k g ，安徽铜官山采场还超过铅山。但是，人类 对微生物浸矿技术的认识和深入研究是从c o l m e ra r 发现细菌的氧化作用开始 的。1 9 4 7 年，c o l m e r a r 首次发现煤矿的酸性矿坑水中含有一种能将f e 2 + 氧化成 f e ”的细菌【3 j 。此后，坦波尔和辛凯尔从酸性矿坑水中成功分离到了一种能氧化 金属硫化矿的细菌，并将其命名为氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ) 。 3 年后，美国的布力诺等又从犹他州宾厄姆峡谷矿坑水中分离得到氧化硫硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 和氧化亚铁硫杆菌，用这两种细菌浸泡硫化铜矿石， 结果金属铜能够从矿石中溶解出来。至此，细菌冶金技术开始迅速发展。 难浸金矿的细菌氧化预处理，最先是1 9 6 4 年在法国提出。法国人首先尝试利 用细菌浸取红土矿物中的金，取得了令人鼓舞的效果。1 9 7 7 年苏联最先发表了实 验结果。北美最先用搅拌反应槽对难浸金矿石及精矿进行细菌氧化，对于搅拌反 应槽式细菌氧化厂的投产和推广，具有奠基作用。1 9 8 4 - 1 9 8 5 年，加拿大g i a n tb a y 微生物技术公司对北美及澳大利亚的3 0 多种金精矿进行了细菌氧化实验研究。 1 9 8 6 年南非金科公司的f a i r v i e w 金矿建立世界上第一个细菌氧化提金厂，实现了 难浸金矿细菌氧化预处理法在世界上的首次商用。 近年来，在国外该技术的研究与应用已成为矿冶领域热点。堆浸在铜、金等 金属的提取上获得工业应用。自1 9 8 0 年以来，智利、美国、澳大利亚等国相继建 硕士学位论文 第一章前言 成大规模铜矿物堆浸厂。对于锌、镍、钴、铀等金属的生物提取技术亦得到研究。 加拿大用细菌浸铀的规模最大、历史最久，安大略州伊利埃特湖区三铀矿公司 1 9 8 6 年产铀3 6 0 吨。美国在浸取铜矿石时用细菌法回收其中的铀，1 9 8 3 年产值已 达9 ，0 0 0 万美元。法国的埃卡尔耶尔铀矿采用细菌浸出，1 9 7 5 年产铀量达到3 5 吨。 葡萄牙在1 9 5 9 年就有1 个铀矿采用细菌浸出进行生产，铀浸出率达6 0 、8 0 。智 利北部的q u e b r a d a b l a n c a 矿山是目前生物浸出实践中非常好的范例，并展示了生 物湿法冶金在矿业中的成功发展。 我国对微生物浸矿技术方面的研究是从2 0 世纪6 0 代开始的，并已先后在铀、 铜等金属的生产应用中取得成功。7 0 年代初，在湖南7 1 1 铀矿和水1 2 山矿务局板 坊铜矿进行了细菌浸铜试验研究，前者进行了处理量为7 0 0 n 屯的贫铀矿石的细菌 堆浸提取铀扩大试验，后者完成了扩大试验后于1 9 7 2 年投入生产，连续8 年多将 板坊铜矿堆积在地表的含铀0 0 2 - - 0 0 3 的2 万多吨尾砂全部处理完，共回收铀 浓缩物2 吨多【4 j 。8 0 9 0 年代，中南大学、北京有色金属研究总院、中科院微生物 研究所、中科院化工冶金研究所、北京矿冶研究总院等单位分别对铜、镍等低品 位矿石的生物提取及高砷金矿预氧化的理论及工艺进行了广泛的研究。1 9 9 7 年德 兴铜矿大型堆浸厂的投产标志着我国微生物浸铜技术有了重大进展。2 0 0 0 年紫金 矿业建成微生物堆浸厂，所处理矿石含铜0 6 8 。目前，紫金又开始着手建设年 产1 。o o o n 屯生物提铜工业试验厂，并力争在“十一五”期间建成年产1 万吨电解铜的 生物冶金工厂。项目建成后，紫金山铜矿将成为国内第一个具有工业规模的生物 提铜基地。此外，紫金山铜矿还将利用这一新工艺着手进行生产有色金属纳米材 料和其它新型粉体材料及复合粉体材料的研究，逐步实现传统矿业经济向新型经 济产业迈进，力争在五年内把紫金矿业建设成为国内著名的高科技效益型矿业企 业集团，并实现紫金山铜矿的全面开发。 浸矿细菌一般是极端嗜酸菌( 生长p h 值一般低于2 0 ) ，这些细菌可以通过 氧化f e 2 + 或者无机硫化物得到能量，其中一些细菌可以同时利用f e 2 + 和无机硫化 物作为能源物质。尽管生长环境恶劣，但是目前已经发现的浸矿细菌有1 1 类之多。 根据生长的最适温度，浸矿细菌可以分为三组，嗜中温菌( m e s o p h i l e s ) ；中等 嗜热菌( m o d e r a t et h e r m o p h i l e s ) ；极端嗜热菌( e x t r e m et h e r m o p h l i l e s ) p j 。 中温菌的最适生长温度一般在3 0 4 0 ，如嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ( a c i d o t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 、氧化硫硫杆菌口c i d o t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 、 氧化亚铁钩端螺旋菌( l e p t o s p i r i r i l l u mf e r r o o x i d a n s ) 等。嗜酸氧化亚铁硫杆菌 是研究的最多，最清楚的浸矿细菌，为革兰氏阴性菌，棒状形态。它栖居于含硫 温泉、硫和硫化矿矿床、煤和含金矿床，也存在硫化物矿床氧化带中，能在上述 的矿坑水中生存【6 】。最佳生长p h 范围是2 0 左右。它属于严格自养性微生物，其 2 硕士学位论文 第一章前言 能源为f e 2 + 和还原态无机硫化物，能利用简单无机物质如c 0 2 和无机盐合成本身 所需要的糖、蛋白质、核酸、维生素等复杂的细胞物质。 中等嗜热细菌最佳生长温度在4 5 5 5 。已经鉴定出的主要菌种为 a c i d i m i r o b i u mf e r r o o x i d a n s 、s u l f o b a c i l l u s t h e r m o s u l f i d o o x i d a n s 、s u l f o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s t 引。这三种细菌均为革兰氏阳性菌，嗜酸，棒状，能够利用f e 2 + 或者 无机硫化物自养生长，也能够利用有机物异养生长。以无机底物为能源自养生长 时，a c i d i m i r o b i u mf e r r o o x i d a n s 固定c 0 2 的能力比舰帕b a c i l l u s 强，自养生长时不 需要额外补加c 0 2 就能良好生长。有氧条件下，三种细菌混合氧化f e 2 + 能力优于 单一菌，这可能是s u l f o b a c i l l u s 利用了a c i d i m i r o b i u m f e r r o o x i d a n s 代谢产生的有机 物兼性生长，更具活力。 中等嗜热细菌的代表细菌是硫化芽胞杆菌属( s u 折o b a c i l l u s ) 。此类细菌中等嗜 热、嗜酸，广泛存在于硫化矿的采矿废石堆、火山地区、富含铁、硫或硫化矿的 酸热环境中，是酸热环境中起重要地球化学作用的微生物类群。s u l f o b a c i l l u s 属无 机化能兼性自养菌，能够以f e 2 + 、硫化矿为能源自养生长，以酵母提取物为能源 异养生长。以无机底物为能源自养生长时，细胞的正常生长需要足够的c 0 2 ，在 有机物如酵母提取物存在的兼性自养条件下s u l f o b a c i l l u s 生长更快。s u l f o b a c i l l u s 菌的主要特征是：细胞呈杆状，在细胞生长过程中有球形孢子生成，在加有酵母 提取物的培养基中生长时，可观察到细胞的运动。 s u l f o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 能以f e 2 + 、单质硫和硫化矿为能源自养生长，能够 在酵母提取物存在条件下异养生长，同时还能在酵母提取物以及f e 2 + 或者单质硫 或者硫化矿同时存在条件下混合型生长。氧化金属硫化矿最适宜温度为4 5 5 0 。 异养以及混合型营养条件下s u l f o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 菌生长较自养条件下快。显 微镜下可以观察到其具有明显的活动性，但电镜观察没有发现该菌有鞭毛【7 1 。 研究表明，肌蜘6 口c f ，“s 能在较高温度下氧化f e 2 + 和硫化矿，有坚固的细胞壁， 能耐受较高的矿浆浓度和较高浓度的金属离子【8 1 ，因此该菌属在从硫化矿提取金 属特别是从难选冶金矿回收金属方面展现了潜在的应用前景【9 j 。目前，国外应用 s u l f o b a c i l l u s 对含金硫化物矿物的浸出已获得成功，国内对黄铜矿和镍硫矿精矿 的浸出已有实验室及半工业试验的报导【1 0 】。 极端嗜热细菌( e x t r e m et h e r m o p h i l e s ) 最适生长温度在6 0 8 5 。由于浸矿 微生物对复杂的浸矿环境( 重金属含量高、存在有毒砷离子、高温等) 的适应性 有限，因而对浸矿速率造成影响。特别是矿物氧化放热常导致浸出槽和浸堆中产 生较高的温度，采用中温菌浸出速度慢、浸出率低，而且对某些难溶矿如黄铜矿 等不能持续浸出，使得生物浸矿的应用并不普遍。2 0 世纪9 0 年代，人们开始重视 高温菌浸矿的研究和应用。研究表明：高温( 5 0 8 0 c ) 条件下高温菌不仅可以显著 硕士学位论文第一章前言 地提高浸出反应速度、缩短浸出周期而且可以防止黄铜矿等部分原生硫化矿过 度钝化阻碍浸出反应的进行j 。 目前已鉴定的嗜热菌株包括s u l f o l o b u sa c i d o c a l d a r i u s ，s u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s ，s u l f o l o b u sb c ，s u l f o l o b u sm e t a l l i c u s ，a c i d i a n u sb r i e r l e y ，s u l f o l o b u s r i v o t i n c t i ，m e t a l l o s p h a e r as e d u l a 。其中sa c i d o c a l d a r i u s 和a b r i e r l e y i 在低矿 浆浓度下，氧化黄铁矿及其他硫化矿的速度高于常用的中温菌种，但由于这些 嗜热古细菌所具有的无肽聚糖的独特细胞壁结构，使其对高浓度矿浆产生的剪 切力极为敏感【1 2 , i 3 1 。研究者试图通过选择或者驯化手段提供更强大的微生物以克 服高矿浆浓度对微生物的抑制作用，已取得了一定得进展，但离工业化应用还有 一定得距离。 1 2 微生物重金属抗性研究进展 重金属是指具有d 轨道电子的过渡族金属元素。生物对这些元素的吸收和 生理需求不多，因此，它们的过量存在往往导致环境问题。重金属在浓度很高的 情况下会在细胞内累积形成非特异性的复合物引起细胞中毒。某些重金属在微生 物的不同生长期是必需元素，当处于痕量水平时可促进微生物的生长，并且菌体 会通过各种生理代谢机制维持所需重金属在体内的动态平衡；但是当重金属含量 超过一定浓度时，对微生物具有毒性，甚至会杀死菌体，如硒是第二十一氨基酸 的组成部分，存在于多种类型的酶中，是所有活细胞的基本元素，但是细胞内浓 度过高时却是剧毒，当培养基含硒浓度超过2 0 u g m l 是会使e s c h e r i c h i ac o l i 致 死【1 4 】。此外一些金属离子例如h 9 2 + ，c d 2 + ，a g + 有很高的毒性，它们对许多生物学 功能的发挥都是非常不利的，主要是因为它们能够替代细胞内有功能的金属离 子，结合于重要的呼吸蛋白上，从而导致蛋白质和d n a 变性。另外重金属也是 土壤及有关环境中最常见的污染物，它们通过多种途径进入土壤并在其中累积， 不断退化土壤肥力，降低作物产量与品质，同时恶化水体环境，并通过食物链危 及人类的生命和健康。因此，重金属污染土壤的改良和修复，己成为当今农业可 持续发展和环境质量改善中多学科研究的难点和热点。 由于工农业废弃物和城市生活垃圾的剧增以及农药和化肥的大量使用，人类 赖以生存的土壤、水体等环境遭受到了严重的重金属污染，并呈加剧趋势。然而 传统的物理化学治理方法费用高、能耗大，易造成二次污染，特别是对于大面积 河流、湖泊、地下水以及土壤污染的修复有很大的难度。近年来，环境重金属污 染的微生物修复与检测技术受到了国内外专家学者的广泛关注，微生物具有种类 繁多、分布广、表面积巨大、带电荷、繁殖快和代谢旺盛等特点，在生长代谢过 程中不断向外分泌小分子有机酸、无机酸和大分子物质，并伴随有死亡解体现象， 4 硕士学位论文第一章前言 细菌本身及其产生的各种物质广泛参与水体、土壤、矿渣和沉积物等环境中的物 理、化学和生物化学反应，改变环境粘土矿物表面的物理化学特性、分解矿物或 形成新矿物等等，进而影响诸多元素的迁移转化，在重金属污染的环境中，细菌 又可通过对重金属的吸附富集、氧化还原、成矿沉淀、淋滤、协同植物吸收等作 用修复环境中的重金属污染【l5 | 微生物还可以通过直接或间接作用影响环境中重金属的活性，如细菌可以通 过电性吸附和专一性吸附直接将重金属离子富集于细胞表面，降低重金属在环境 中的生物有效性；细菌的氧化还原作用可以改变变价重金属离子的价态，从而降 低重金属在环境中的毒性；成矿沉淀作用可以固定重金属离子等等。合理利用细 菌的这些作用，可以有效地进行环境重金属污染的生物修复。 ( 1 ) 微生物吸附沉积 细菌表面载负电荷，并存在多种极性官能团，可通过静电吸附和各种官能团 的络合作用固定重金属离子。微生物吸附重金属的机理十分复杂，研究表明它们 对金属的作用可分为微生物吸附( m i c r o o r g a n i s m sb i o s o r p t i o n ) 和微生物累积 ( m i c r o o r g a n i s m sb i o a c c u m u l a t i o n ) 两个不同的生物化学阶段。第一阶段是重金 属在细胞表面吸附和吸收即微生物吸着阶段，主要是指重金属离子与生物体细胞 壁表面的一些基团如c o o h 、o h 、- n h 2 、s h 、p 0 4 弘等通过络合、整合、 离子交换、静电吸附、共价吸附等作用中的一种或几种相结合的过程s h u m a t e 和s t r a n d b e r g ( 1 9 8 1 ) 曾将微生物吸附( m i c r o o r g a n i s m sb i o s o r p t i o n ) 定义为：“金 属与生物细胞成分的间接的物理化学作用。 可见，这一过程是细胞成分对金属 的被动吸收， 其特点是快速、可逆、不依赖于生物细胞的能量代谢，典型的生 物吸着过程在几分钟内就可以完成。研究表明细胞壁上的糖链和细胞外的粘多糖 具有金属吸附的活性，不同的金属离子被不同的多糖吸附，可以提高细胞抗重金 属的能力。第二阶段是指微生物累积这一主动过程，它仅发生在活细胞内。当活 细胞生存在环境中时，它可以通过多种机理，包括运输以及细胞内外的吸附来“提 高本身的金属含量。已提出的金属运送的机制有：脂类过度氧化、复合物渗透、 载体协助、离子泵等。微生物累积过程是通过微生物的新陈代谢伴随着能量的消 耗进行的，它比微生物吸着慢得多【1 6 j 。有些由于微生物吸附与传统的处理方法 相比，具有以下优点，即在低浓度下，金属可以被选择性的去除；节能、处理效 率高；操作时的p h 值和温度条件范围宽；易于分离回收重金属；吸附剂易再生利 用等【l7 1 。因此在生产中得到了广泛的应用，微生物例如蓝细菌、硫酸盐还原细 菌等能够产生胞外聚合物，它们具有大量的阴离子基团，可以与金属离子结合。 能吸着重金属的微生物种类繁多，但归纳起来主要有藻类、真菌和细菌三大 类。( 1 ) 藻类生物吸附剂：全球己知的藻类约4 万种，在自然界中分布甚广，绝 硕士学位论文第一章前言 大多数为水生或生长在阴暗的岩石、墙角、树干和土壤等表面，是最容易观察到 的一种微生物，常常用来指示水体、生态系统及营养条件的变化。研究发现，藻 类细胞具有吸附重金属的能力。因此，可选择吸附性能良好的藻类作为吸附剂的 生产原料，如海藻，其数量大，容易收集，有一些地方还可人工培养，尤其在沿 海地区，来源十分丰富。 当微生物体暴露在金属溶液中时，金属离子直接接触的是细胞壁，微生物细 胞壁的化学组成和结构决定着金属与它的相互作用特性。藻类的细胞壁在多数情 况下是由纤维素的微纤丝形成的网状结构构成，含有丰富的多糖，如果胶( 含 有少量己糖、鼠李糖的多聚半乳糖醛酸的高聚物) 、木糖、甘露糖、藻酸或地衣 酸。多糖带负电，可以通过静电引力与许多金属离子相结合。其中的海藻酸盐与 硫酸多糖是吸附的主要载体【l 引。就藻类而言，它对大多数重金属有很强的吸附 能力。如斜生栅藻对u 0 2 2 + 的吸附是一个快速而不需要能量的过程，最大吸附容 量达7 5m g g 干物质，能够使铀浓度从5 0m g l 降至o 0 5m g l ，而且c d 2 + ， n i 2 + ，z n 2 + ，c u 2 + 的存在对于u 0 2 2 + 的吸附没有太大的影响【1 9 1 。在吸附z n 2 + 时， 它的吸附容量、z n 2 + 毒性的耐受能力比另外一种栅藻( s c e n d e s m u sq u a d r i c a u d a ) 高。绿微藻( t e t r a s e l m i sc h u i i ) 在悬浮状态下，活细胞对c p 的最大吸附量1 2 6 7 m g g 干物质，干细胞的最大吸附量为1 3 1 2m g g 干物质【2o i 。海草能积累c d 2 + 和 c u 2 + 2 1 】：马尾藻类海草废生物体能够去除1 0 0 的c d 2 + 和9 9 4 的z n 2 + 【2 2 】。一些 大型海藻，它们的吸附容量比其它种类生物体高得多，甚至比活性炭、天然沸石 的吸附容量还高，与离子交换树脂相当1 2 3 】。 ( 2 ) 细菌生物吸附剂：细菌是地球上最丰富的微生物，地球上的总生物量约 为1 0 1 8 9 ，细菌占了其中的大部分。它像真菌一样，也广泛的应用于工业生产中， 如我们现在所使用的抗生素，除少部分来自于真菌外，大多来自于细菌：还有一 些酶类的生产，如洗衣粉中的酶，大多是嗜碱细菌，主要是芽胞杆菌属的菌株产 生；在维生素、氨基酸、醋的生产中，也要不可避免地使用细菌。而用来吸附去 除重金属的细菌菌株，大多是从矿坑水、矿区土壤或富含重金属的污水中分离出 来的对重金属有耐受性的细菌菌株和工业生产中的废菌体。 细菌细胞壁中有一坚硬的层，主要用于支撑细胞壁，其化学组成为肽聚糖。 肽聚糖的基本结构是由两种糖的衍生物( n 一乙酰葡萄糖胺和n 一乙酰胞壁酸) 以 及一组氨基酸( l 一丙氨酸、d 一丙氨酸、d 一谷氨酸及l 一赖氨酸或二氨基庚二酸) 等组成。在革兰氏阳性菌中，细胞壁9 0 由肽聚糖组成，另一组分为磷壁酸。磷 壁酸是一种酸性多糖，它包含所有的含有磷酸甘油或核糖醇磷酸盐残基的多聚 体，使整个细胞表面带负电荷，而且影响着离子穿过细胞壁的途径。在革兰氏阴 性菌中，肤聚糖占细胞壁的1 0 ，在肽聚糖外则由脂多糖组成。脂多糖是脂类和 6 硕士学位论文第章前言 多糖紧密相连在外层而形成的特异的脂双层结构，一般由核心多糖和o 一侧链多 糖两部分组成。细菌与重金属的吸附作用位点是细胞壁上的羧基和氨基或结构蛋 白上的n ，p ，o 等原子i 2 4 i 。 芽胞杆菌属的菌株都有强大的吸附金属的能力1 25 | 。用地衣芽胞杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) r 0 8 吸附p b 2 十时，4 5 m i n 吸附量可达2 2 4 8m g g 2 6 l ，多粘芽胞杆菌 ( b a c i l l u sp o l y m x a ) 对铜有潜在的吸附能力，吸附量可达6 2 7 2 m g g 。苏云金杆菌 ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 不仅可用作生物农药，而且对多种金属具有抗性，并且表 现出生物吸附的能力。其它芽胞杆菌如b p u m i l u s ，b c e r e u s 等也对c e 2 + ，c 0 2 + ， + ，u 6 + 等一系列重金属离子显示出了高亲合性。假单胞杆菌属菌株对重金属 也显示出了较好的吸附能力。恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 能抵抗c u 2 + 的 毒性，并对c u 2 + 有较好的吸附能力：嗜硝酸盐假单胞菌( p s e u d o m o n a s h a l o d e n i t r i f c a n ) 能吸附c 0 2 + ，并且能抵抗一价离子的干扰。蓝细菌是一群种类 繁多、分布广泛的光能营养菌，过去由藻类学家对它们进行研究、分类，通常称 为蓝( 绿) 藻。但由于它们的原核特征，在1 9 9 6 年出版的细菌名称中，己将 “蓝藻”改为“蓝细菌”。螺旋蓝细菌属( s p i r u l i n a ) 、念珠蓝细菌属( n o s t o c ) 和鱼 腥蓝细菌属( a n a b a e n a ) 中的一些菌株对重金属有良好的吸附能力。盘状螺旋蓝 细菌( s p i r u i n a p l a t e n s i s ) 能很快的从金一硫脉溶液中去除金，并不受p h 值的影 响：最大螺旋蓝细菌( s p i r u l i n am a x i m a ) 吸附c d 2 + 时，最大吸附量可达 4 3 6 3 m g g 活细胞和3 7 0 0 m g g 干细胞。利用念珠蓝细菌已经制成一种供商业 用途的生物吸附剂a l g a s o r b s ，可吸附多种金属( p r a s a dbb ，2 0 0 0 ) 。其它的细 菌，如藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl e t e u s i a m1 0 5 6 ) 、紫红小单抱菌 ( m i c r o m o n o s p o r ap u t p u r e a ) 、伊纽小单抱菌( m i c r o m o n o s p o r ai n y o e n s i s ) 也能够快 速地吸附水中的金属。 重金属进入细胞后，通过“区域化作用 分布在细胞内的不同部位，被封闭 为低毒的形式。近年来这方面研究最多的是金属硫蛋白，金属硫蛋白中的巯基可 以和重金属离子形成稳定的复合物沉积下来1 2 7 j 金属硫蛋白( m t ) 是1 9 5 7 年m a r g o s h e 和v a l l e e 在研究镉的生化功能时发现 的，它是一种低分子量、富含半胱氨酸但不含芳香族氨基酸和组氨酸的金属结合 蛋白【2 引，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中，并且能够在胁迫条件下诱导 产生。金属离子通过和m t 中c y s 的疏基结合形成生物学上稳定的形式沉积下来 2 9 , 3 0 l 。目前的研究认为锡可以直接作用于m t 基因的启动子，诱导m tm r n a 的 大量表达，诱导合成的金属硫蛋白一方面可以螯合一定量的镉形成c d m t 复合 物以降低细胞内的镉浓度：另一方面通过自身巯基氧化态还原态的转换来清除 由镉诱发产生的自由基，从而减轻福对生物体的损伤。根据c y s 的含量和结构， 硕士学位论文第一章前言 mt 可分为三类，即i 、i i 、i i i 类，前两类是直接的基因产物，第1 i i 类是非翻 译的富含c y s 的分子，命名为重金属螯合肽，其中i 类mt 的c y s 排列在n 一 端和c 一端均为c y s - x a a - c y s ( x 为任何其他氨基酸残基) ；i i 类mt 在n 一端为 c y s c y s ，c y s x a a x a a c y s 或c y s x a a c y s 的排列，在c 端为c y s x a a c y s 的 排列( m am ，2 0 0 3 ) 。同时研究还发现m t 有d 、1 3 两个结构域， 这两个结构 域既相互联系又有分工，其中结构域优先结合c d 2 + 、h 9 2 + ，而1 3 结构域优先结 合c d 2 + 【3 。 随着分子生物学研究手段的发展，采用人工合成物对重金属进行吸附已经 成为一种快速、有效的方法。它是基于细菌表面展示系统原理，用基因重组的方 法将外源性多肽或蛋白与细菌表面的蛋白( 如外膜蛋白、鞭毛蛋白) 融合，以正 确的构象和方向插入并停留在细菌外膜，功能性地表达在细菌表面【3 2 1 。借助于 细胞表面展示技术，可以将具有络合重金属功能的外源蛋白与l a m b 、o m p a 、 p h o e 等结构相似、均以一系列b 折叠跨膜的外膜蛋白结合，这类外膜蛋白中裸 露于细胞外的肽段形成的环以夹心方式插入外源性序列，这样形成的结构不影响 蛋白质的总体构型，但能功能性地表达外源蛋白。已发现人工合成的h e x a h i s 能插入信号序列n 一末端和a _ 凝集素序列c 一末端之间，使合成产物表达于细胞表 面【3 3 j ，从而提高吸附重金属的能力。 ( 2 ) 重金属的转化作用 微生物能通过氧化还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属，将有毒物质转 化成无毒或低毒物质。其中微生物对汞的转化作用最常见且研究得最清楚，它主 要有两种作用方式：汞的甲基化和h 9 2 + 还原h 。 甲基汞的脂溶性高，易和蛋白质中的疏基结合，其毒性是无机汞的1 0 0 倍， 但甲基汞易于挥发，因此推侧微生物合成甲基汞是一种解毒机制。甲基钻胺素是 能转移负碳离子的甲基基团，被公认为在汞甲基化时提供甲基供体，但目前还不 清楚甲基化是酶促过程还是非酶促过程。 微生物通过有机汞裂解酶催化有机汞的碳汞键断裂，再由依赖n a d p h 和 f a d 为辅酶的二聚体酶一汞还原酶把无机h 9 2 + 还原为h 矿， 使之挥发离开菌体 细胞，这一过程是可诱导的，有机汞裂解酶和汞还原酶的底物都是其酶的诱导剂。 研究表明与运输汞有关的基因有：m e r a 、m e rb 、m e rc 、m e rd 、m e rp 、m e rr 和m e r t ，它们位于同一个操纵子上。其中m e r a 编码汞还原酶，该酶常以二 聚体形式在细胞质内与内膜呈疏松的结合，m c rb 编码有机汞裂解酶，但它的 定位尚未确定【3 4 1 ，m e tt 和m e r