（生态学专业论文）青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性rapd分析.pdf

i i i l l l l l l l l r l i r r i i l l l l l l l l l l l l rj j i i l l l l l f l l l l l l l l y 17 6 013 5 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性的r a p d 分析 、 中文摘要 暗紫贝母( f r i t i l l a r i a u n i b r a c t e a t ah s i a oe t k c h s i a ) 系百合科( l i l i a c e a e ) 贝母属( f r i t i l l a r i a ) 植物，是一种重要的药用植物。采用r a p d 技术对青海省四 个产地的2 3 个暗紫贝母材料进行遗传多样性分析，为揭示我省暗紫贝母资源的 遗传背景提供依据，为我省暗紫贝母优良品种的选育及其种质资源的保护、评 价和利用提供基础资料。主要研究结果如下： 1 本试验对r a p d 反应体系中的5 个重要因子进行了正交试验，筛选出最优 的反应体系，并在此最优体系的基础上，分别对退火温度、扩增循环数进行了单 因素试验，确定了一套最佳的暗紫贝母r a p d 反应体系和p c r 扩增程序，即模板 d n a2 5n g ，随机引物0 8 “m o l l ，d n t p so 2 0m m o l l ，m 矿+ 1 5m m o l l ，t a q 酶 0 8 u 。p c r 扩增程序为：9 5 预变性5m i n ，9 4 变性4 5s ，3 7 退火1m i n ， 7 2 延伸2 m i n 4 0 个循环，7 2 延伸5m i n ，4 终止反应； 2 从6 0 条随机s 系列引物中筛选出1 0 条有效引物，占总数的1 6 7 ，这些引 物能在2 3 个暗紫贝母总d n a 上扩增出清晰度高、稳定性强、重复性高的条带。 1 0 条引物共扩增出9 5 条带，其中多态性带6 7 条，占总扩增条带的7 0 5 ，每个引 物可扩增出5 1 2 个多态性条带，平均6 7 条； 3 根据引物$ 2 3 对2 3 个暗紫贝母样品的扩增结果构建o l 矩阵，在n t s y s 2 1 0 软件上计算出各品种间的相似系数，品种间的相似系数决定了品种间的亲缘关 系，相似系数越大，亲缘关系越近。2 3 个暗紫贝母样品间的相似系数介于0 3 3 3 3 0 9 1 6 7 之间，平均相似系数为0 6 2 5 ，其中久治县的4 号和6 号植株相似系数最大为 0 9 1 7 6 ，表明两者亲缘关系最近。聚类分析结果表明：四个样地的2 3 个样品，每 个样地的样品均聚在一类，表明相似系数与样品的地理位置密切相关。 ， 关键词：暗紫贝母，r a p d ，遗传多样性，相似系数 i nf o u rr e g i o n so fq i n g h a if r i t i l l a r i a u n i b r a c t e a t a h s i a oe tk c h s i ar a p d a n a l y s i so fg e n e t i c d i v e r s i t y a b s t r a c t f r i t i l l a r i a u n i b r a c t e a t ah s i a oe lk c h s i ai sa l li m p o r t a n tm e d i c i n a lp l a n t b e l o n g i n gt ol i l i a c e a e , f r i t i l l a r i a r a p dt e c h n i q u ei su s e di na n a l y z i n gt h eg e n e t i c d i v e r s i t yo f2 3s a m p l e sf r o mf o u rd i f f e r e n tr e g i o n so fq i n g h a ip r o v i n c e ，t h er e s u l t s w o u l dr e v e a lt h eg e n e t i cb a c k g r o u n do ff r i t i l l a r i ao fq i n g h a ip r o v i n c ea n dp r o v i d e t h eb a s i ci n f o r m a t i o nf o rb r e e d i n gv a r i e t i e sa n dp r o t e c t i o n , e v a l u a t i o n , u s eo f g e r m p l a s m r e s o u r c e s t h em a j o rf i n d i n g sa r ca sf o l l o w s 1 i nt h ee x p e r i m e n t ，f i v ee s s e n t i a lf a c t o r sw h i c hm a ya f f e c tt h er e s u l to fr a p d w e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dt w os i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t so f a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dc y c l et i m e s t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h eo p t i m a l c o n d i t i o n so fr a p d - p c rs y s t e ma n dr e a c t i o np a r a m e t e r sw e r e2 5 n gt e m p l a t ed n a ， 0 8 p m o l lr a n d o mp r i m e r , 0 2 0 m m o l ld n t p s ，1 5m m o l lm 9 2 + ，0 8ut a q e n z y m e t h er e a c t i o np r o c e d u r ew a s9 5 i n5m i n ，t h e n4 0c y c l et i m e s 丽t l l9 4 c i n4 5s ，3 7 i i l1m i n ，7 2 ci n2m i n ，l a s t l y7 2 。ci n5m i n ，a n ds t o pr e a c t i o na t4 c 2 t h e r ew e r c4 0r a n d o mp r i m e r su s e df o rt h ep c ra m p l i f i c a t i o no fg e n o m i e d n af r a g m e n t t e no ft h ep r i m e r sc o u l da m p l i f yp o l y m o r p h i cb a n d s ，6 7o f9 5 a m p l i f i e db a n d sw e r ep o l y m o r p h i c ，a c c o u n t sf o r7 0 5 e v e r yp r i m e rc o u l da m p l i f y 5t 012p o l y m o r p h i cb a n d s ，w i ma na v e r a g eo f6 7b a n d s 3 a c c o r d i n gt o $ 2 3p r i m e rp a i r so f2 3s a m p l e so ff r i t i l l a r i aa m p l i f i c a t i o n r e s u l t sb u i l d0 lm a t r i xa n du s et h es o f t w a r en t s y s 2 10t oc a l c u l a t es i m i l a r i t y c o e f f i c i e n t sb e t w e e na l lv a r i e t i e sw h i c hd e t e r m i n e st h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h et w os p e c i e s ，t h eg r e a t e rt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t ，t h ec l o s e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h ev a l u eo ft h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t so f2 3s a m p l e sw e r eo 3 3 3 3t o0 916 7a n dt h e a v e r a g ei s0 6 2 5 t h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tb e t w e e na m 4a n dh u m6 f r o mj i u z h i c o u n t yi st h el a r g e s to fa l lt h a tm e a n st h ec l o s e s tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et w o c l u s t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a t ：f o u rp l o t so f2 3s a m p l e s ，e a c hs a m p l ep l o to ft h e s a m p l e sw e r eg a t h e r e di nac l a s s ，i n d i c a t i n gs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ti sc l o s e l yr e l a t e dt o t h es a m p l el o c a t i o n i i k e yw o r d s ：f r i t i l l a r i a - u n i b r a c t e a t ah s i a oe tk c h s i a ，r a p d ， g e n e t i cd i v e r s i t y , s i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t 目录 中文摘要i a b s t r a c t ，i i 前言：l刖磊：l 第一章文献综述、3 。1 1 遗传多样性研究方法3 1 1 1 形态学水平标记j 3 1 1 2 细胞学( 染色体) 水平标记4 1 1 3 生化水平标记：。5 1 1 4 分子( d n a ) 水平标记6 1 2r a p d 技术在植物种质资源研究中的应用1 0 ，1 2 1 品种和品系的鉴别1 1 1 2 2 遗传多样性和遗传分化研究1 2 1 2 3 分子遗传图谱的构建和遗传育种1 2 1 2 4r a p d 技术在贝母属植物研究中的应用1 3 1 3 本论文的研究意义和目的1 4 第二章材料和方法1 5 2 1 试验材料与试剂1 5 2 1 1 试验材料1 5 2 1 2 试验试剂和仪器。1 5 2 2 方法j ：1 7 2 2 1 总d n a 的提取。1 7 2 2 2 总d n a 的检测。1 9 2 2 3r a d p 反应体系的构建和优化2 0 2 2 4 引物筛选，2 1 2 2 5 扩增产物的检测2 2 2 2 6 数据的分析与统计2 2 第三章结果与分析一2 3 3 1 总d n a 纯度和浓度的检测结果2 3 i v 3 1 1 电泳法检测结果2 3 3 1 2 紫外分光光度法检测结果+ 2 3 3 1 3 紫外分光光度法对全部2 3 个样品总d n a 的检测结果2 4 3 2r a p d 最佳反应体系的构建2 5 3 2 1 正交试验结果与分析2 5 3 2 2 退火温度和循环次数的单因素试验结果2 8 3 2 3r a p d 反应体系与反应程序的建立2 8 3 3r a p d 结果的统计与分析2 9 3 3 1 扩增结果的多态性分析2 9 3 3 2 引物$ 2 3 扩增结果分析j 3 0 3 3 3 相似系数分析。3 l 3 3 4 聚类分析一：3 l 第四章讨论3 5 4 1 样品总d n a 的提取j 3 5 4 2r a p d 反应体系中各因素对r a p d 结果的影响3 5 4 3 正交试验设计在r a p d 分析中的应用3 6 4 4 扩增条带的取舍处理3 7 4 5r a p d 技术的可控性3 7 第五章结论：3 8 参考文献j 3 9 v 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性r a p d 分析 上- | - 刖声 暗紫贝母( f r i t i l l a r i a u n i b r a c t e a t ah s i a oe tk c h s i a ) 系百合科( l i l i a c e a e ) 贝母属( 厅f t i l l a r i a ) 植物，本种为1 9 8 5 年版中国药典收载常用中药“川贝母 中“松贝 的来源种，由肖培根等鉴定并命名【。2 0 0 5 年版中国药典收载川 贝母为百合科植物川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母或梭砂贝母的干燥鳞茎，前三者 按形状不同分别成为“青贝或“松贝 ，后者习称“炉贝 【2 j 。暗紫贝母为川 贝母来源之一，多年生草本，高1 5 2 0 厘米，鳞茎球形或圆锥形。茎直立，无毛， 绿色或深紫色。叶除最下部对生外，均为互生或近于对生，无柄叶片线形或线状 披针形；花单生于茎项，深紫色，略有黄褐色小方格；有叶状苞片1 ，花被片6 ， 外轮3 片近长圆形，内轮3 片倒卵状长圆形，蜜腺窝不明显；蒴果长圆形，6 棱， 棱上有宽约l 毫米的窄翅。暗紫贝母野生于高海拔，阳光充足、腐殖质丰富、土 壤疏松之草原上，常见于四川西北部、青海东南部等地区中海拔2 8 0 0 4 5 0 0 米的 草地上f 3 1 。 目前对暗紫贝母的研究主要集中在化学成分、药用价值和组织培养研究几个 方面。余世春、肖培根1 4 在1 9 8 9 年对暗紫贝母的化学成分进行预试验中表明其鳞 茎除含生物碱外，尚含糖类、有机酸、皂甙、甾醇类、内酯香豆素类成分。在随 后的两年中他们又陆续发现了松贝甲素、谷甾醇及硬脂酸与软脂酸的混合物【5 l 和松贝乙素【6 l 。韵海霞、陈志c 7 】采用气相色谱一质谱联用法( g o - - m s ) 分析暗 紫贝母鳞茎7 5 乙醇提取物用乙醚萃取后得至, j 1 3 种化学成分。暗紫贝母是我国特 有的中药材，以地下鳞茎入药，总皂甙和生物碱是有效活性成分f 引，用于肺热燥 咳、干咳少痰、阴虚咳嗽、咳痰带血，被国家列入三级野生药材保护品种1 9 。植 物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细 胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生 的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术【1 0 1 。由于暗紫贝母对生长 环境要求极苛刻，喜寒凉气候，野生分布于高山高原草地上，低于海拔3 0 0 0m 就很难生长，因此很难人工引种栽培，产量很少，价格昂贵【】，因此对暗紫贝母 的组织培养就显得十分重要，一般取暗紫贝母的鳞茎进行组织培养。谭丰苹等1 1 2 】 应用正交实验研究了生长调节物质病毒唑、茉莉酸甲酯、油菜索内酯、腐殖酸钠 对组织培养暗紫贝母小鳞茎生长的影响，发现病毒唑有显著活性。进一步对不同 浓度病毒唑的效果进行优化试验，结果表明：病毒唑1 0m g l 是提高小鳞茎生长 率的最适浓度。蔡朝晖等【l3 】研究了培养基中不同蔗糖浓度和添力1 3 l - 酪氨酸或l 一 赖氨酸对组培暗紫贝母鳞茎的生长率和生物碱含量等的影响，结果表明：蔗糖浓 青海师范大学硕士学位论文 度为5 时，鳞茎的生长率和生物碱含量最高，培养基中添加氨基酸可以提高鳞 茎的生长率。此外，蔡朝晖【i 卅等还研究了不同培养温度条件及培养方法对组织培 养暗紫贝母生长的影响，结果发现：在2 0 、2 5 条件下，无论是光培养还是 暗培养，平均生长率差别不大，但在1 5 条件下，平均生长率明显较低；摇床 上培养材料生长得最快，固体培养次之，转床上生长得最慢。 本论文通过r a p d 分子标记技术对暗紫贝母进行基因水平的研究，克服了形 态、生化等方面受环境因素影响较大的缺点。r a p d 技术的分析结果将有效的揭 示青海省暗紫贝母的遗传背景，为我省暗紫贝母优良品种的选育及其种质资源的 保护、评价和利用提供基础资料。 2 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性r a p d 分析 第一章文献综述弟一早义陬琢硷 1 1 遗传多样性研究方法 地球上所有的植物、动物、微生物，它们所拥有的全部基因以及各种各样的 生态系统，共同构成了生物多样性。生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和 生态系统多样性【1 5 】。遗传多样性的起源可概括为以下几种途径 1 6 - 1 9 】：染色体结构 和数目的变异、基因突变、新基因的产生、d n a 序列的重复。遗传多样性作为 生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性、物种多样性的基础。一方面， 任何物种都具有其独特的基因库和遗传组织形式，物种的多样性也就显示了基因 的多样性【2 0 1 ；另一方面，物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单元，生 态系统的多样性离不开物种的多样性，同样也离不开不同物种所具有的遗传多样 性。广义的遗传多样性是指生物界中所有遗传变异的总和，但狭义的遗传多样性 是指种内的遗传多样性，即种内基因的变化，包括种内显著不同的居群间和同一 居群内的遗传变异的总和，亦称基因多样性1 2 。在一般情况下，遗传多样性的概 念是指狭义的范围和内容。对遗传多样性的系统性研究可以追溯到达尔文的物 种起源一书中，该书中用大量的资料和相关证据揭示出生物中普遍存在变异的 现象，并且变异具有一定的遗传倾向，他把这种可遗传的变异成为多样性【2 射。随 着生物学及其相关学科的快速发展以及生化技术和实验手段逐步完善，检测遗传 多样性的层次也在逐步深入，从早期的形态学水平、细胞学( 染色体) 水平、生 化水平直至到达目前的分子( d n a ) 水平。遗传多样性常以多态位点比例 ( p ) ( p r o p o r t i o no f p o l y m o r p h i cl o c i ) 、等位基因平均数( a ) ( a v e r a g e n u m b e ro f a l l e l e s p e r l o c u s ) 、平均期望杂合度( h e ) ( a v e r a g ee x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t y ) 和观察杂合度 ( h o ) ( a v e r a g eo b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t y ) 来度量【乃j 。目前，众多方法各有其优缺点， 在实际的应用过程中应根据具体情况选择适当的方法，以最终达到认识和了解遗 传多样性及其生物学意义的目的。 1 1 1 形态学水平标记： 形态学标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r ) 是指那些能够明确显示遗传多态性的外观 性状，如株高、叶形、花色、叶质等相对差异。从形态学或表型性状来检测遗传 变异是最直接也最简便易行的方法，由于表型和基因型之间存在着基因表达、调 控、个体发育等复杂的中间环节，如何根据表型上的差异来反映基因型上的差异 就成为用形态学方法检测遗传变异的关键所在。通常利用的表型性状有两类： 3 青海9 币范大学硕士学位论文 一类是符合孟德尔遗传规律的单基因性状( 质量性状、稀有突变等) ，另一类是 由多基因决定的数量性状【2 4 】。 一 当采用符合孟德尔遗传的质量( 单基因) 性状为遗传标记时，尽管通过遗传分 析可以确定编码这些性状的基因位点，但这类简单遗传的性状在生物类群的众多 性状中所占比例很小，反映的基因位点太少。即使能分析一大批此类单基因位点， 但由于这种方法所能知道的基因都是可变的( 有2 个以上的等位基因，否则检测不 出来) ，因此仍不能作为整个基因组的代表，从而不能客观地反映遗传变异水平。 对于数量性状，多基因假说认为它是许多基因共同作用的结果，表现为群体性， 只能用数理统计的方法估计一些遗传参数，反映遗传变异的特点，洞察其中的规 律【2 5 1 。对能充分反映基因组，受多基因编码的数量性状来说，目前也只能大致估 算“有效因子 的数目，且同样存在着与单基因性状检测类似的问题。在许多情 况下，利用形态标记检测遗传多样性仍是最现实的方法，尤其是在时间有限且不 具备开展其他形式的遗传多样性检测实验时，形态学标记方法依然具有积极作用 2 h 。但此方法的缺点也较为突出【1 9 ，2 62 7 】：通过自然突变或物理的、化学的、生 物的人工诱变获得具有特定形态特征的材料耗时太长，同时突变所具有的不定向 性和可逆性加大了工作的难度和不可预见性。此外，遗传表达过程还受到控制性 状基因的显隐性和自然环境的影响。因此，仅仅通过形态学标记来准确、系统的 研究遗传多样性还是远远不够的，还必需进行更深层次的研究，并加以验证和比 较。 1 1 2 细胞学( 染色体) 水平标记 +一 细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征、 染色体的形态特征和结构特征的标记。染色体是遗传物质的载体，是基因的携带 者。染色体数量和结构的变化必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要 来源，也是生物进化和物种形成过程中的重要资料，在任何生物类群的天然居群 中都存在或大或小的染色体变异，这些变异在进化过程中起着十分重要的作用。 染色体变异主要表现为染色体组型特征的变异即染色体数目变异和染色体结构 变异。染色体数量的变化包括整倍性和非整倍性变化，整倍性是指染色体数日按 照某一基数成倍的增加或减少的现象，非整倍体体内染色体数比该物种的正常合 。 子染色体数( 2 n ) 多或少一个至若干个染色体。非整倍体在减数分裂形成配子过 程中，由于同源染色体联会发生紊乱，无法形成正常的配子以至植株发育失败或 发育不正常，因此在物种进化中的研究意义不大，但该现象仍普遍存在，如在十 字花科的c a r d a m i n ep r a t e n s i s 种内就发现了多达5 4 种染色体数目。另外，c h a e n a c t i s 4 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性r a p d 分析 d o u g l a s i i ，c l a y t o n i av i r g i n i e a ，o t t e l i aa l i s m o i d e s 等都发现了染色体数目极大的变 异1 2 习。相比较染色体数目变化，染色体结构的变化在植物中更为普遍。据估计， 大约每5 0 0 个个体中就有一个结构变异发生【2 8 】。染色体的结构变异主要包括：染 色体中某一片段的缺失、染色体中增加了某一片段、染色体某一片段的位置颠倒 了1 8 0 。、染色体的某一片段移接到另一非同源染色体上。对染色体结构变异的 鉴别，通常采用细胞学的常规方法进行。如根据减数分裂同源染色体联会期间的 特征判断染色体片段的缺失、重复、倒位和易位。但是，由于制片技术和观察时 机的把握上的影响，实现的难度较大。目前从染色体水平检测遗传多样性常利用 核型分析核染色体分带技术来完成，染色体分带技术是基于某些染色体染色方法 产生具有种属特异性横纹的差示染色带，这些显带图型在发育过程中以及不同组 织的细胞间是恒定的。常用的显带技术主要有：c ( c e n t r o m e r e ) 带、q ( q u i n a e r i n e ) 带、g ( g i e m s a ) 、r ( rr e v e r s e ) 显带技术、复制显带技术、抗体显带技术、d n a 杂交 显带技术等，尤其是染色体分带的c 带技术应用较为广泛，如m i y a m o t o 在p a r i s t e 臼呻h y l l a 中发现了c 带多态性【2 9 1 。除了数目和结构上的变异，染色体水平上的多 样性还体现在染色体的着丝点位置、缢痕和随体等核型特征上。这些特征的变异 使种内出现细胞型的多样性【2 2 1 。 细胞学标记虽然可以克服形态标记的某些不足，但是细胞学标记所需的材料 需要花费较大的人力和较长的时间来培育，同时，某些物种对染色体数目和结构 变异的反应敏感，容易死亡，有些适应变异的能力较差。对染色体数目相等、形 态相似的物种或类群，或同一居群的不同个体来说，单纯用染色体资料研究遗传 多样性就失去了分辨能力，而对一些不涉及染色体数目，结构变异或带型变异的 性状，难以用细胞学方法检测。但是，随着染色体制片技术的日益成熟，电子显 微镜的应用、各种分带技术、染色体原位杂交技术应用与发展，细胞学水平标记 的应用领域将会逐步宽广。 1 1 3 生化水平标记 生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 是指以生物体内生化性状为标记，主要包括 血型标记、血清蛋白标记和同工酶标记等【3 0 l ，生化水平上研究遗传多样性主要是 利用同工酶标记和非同工酶形式的蛋白质标记，非酶蛋白质，主要是指种子中储 藏的蛋白质。植物遗传多样性研究中常用的酶标记有同工酶和等位酶，同工酶 广义上是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶，但是显示不同的 物理或动力学性质，如等电点、最适p h 、底物亲和力或抑制物效应等。特 定酶的不同同工酶形式通常是从不同基因衍生而来的，常常出现在身体的 5 青海师范人学顾l 二学位论文 不同组织【3 1 1 。按照国际生化联合会( i u b ) 所属生化命名委员会( c b n ) 的 建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。 同工酶是生物界广泛存在的一种普遍现象，并以共显性方式表达，是生物 体在长期进化过程中形成的对机体内复杂代谢方式的一种适应，同工酶是 基因表达的结果，酶在结构上的差异主要来源于基因，同工酶谱带是基因 表达后的一种表现型，因此通过分析同工酶谱带就可推知基因、基因表达 过程和生物体内进行的各种代谢与表现型的关系。同功酶标记的原理是利用 凝胶电泳技术将同工酶中结构不同的各族酶类分开，用专一的底物和特殊染料， 把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱【3 2 1 。在利用同工酶技术进行遗传学 分析与群体遗传学研究时，特别要求取材的一致性，否则它们间的差异并不是由 遗传而是由发育而造成的。同工酶结构的相似性反应了生物间一定的亲缘关系， 因此，同工酶谱带可以作为物种鉴定、起源进化和遗传变异的重要指标。等位酶 是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式，“等位酶”的概 念由p a r a k a s h 等于1 9 6 9 年提出，将它从同工酶概念中分离出来。等位酶电泳技术 是目前检测遗传多样性最为普遍的方法，等位酶分析的遗传学基础在于：根据中 心法则，组成酶蛋白质多肽链的氨基酸种类和顺序是由d n a 核苷酸链的碱基编 码所决定的。所以当d n a 链上结构基因发生点突变时，一个或多个核苷酸发生 了置换，就会导致由它编码的氨基酸的改变，从而可以直接影响蛋白质的构型和 静电荷。通过电泳能够分离和鉴别这种酶蛋白质的变体，从而推断假定酶基因位 点的所有等位基因的存在【3 3 】。 生化标记有以下主要优点：一是表现近中性；二是直接反映了基因产物差异， 受环境影响较i x ；三是生化标记过程中使用的技术已很成熟，可操作性强。自1 9 5 9 年，m a r k e t 和m o i l e r 首次提出同工酶概念以来，同工酶和等位酶分析已广泛应用 于植物的系统发育、进化和变异等诸多方面，进一步丰富了遗传多样性的研究检 测方法。 1 1 4 分子( d n a ) 水平标记 随着遗传多样性研究的深入发展，遗传多样性标记已从传统的以表型识别为 基础的形态标记、以染色体的结构和数目为特征的细胞学标记以及具有组织、发 育和物种特异性的同工酶标记拓展到了目前广泛开展的以d n a 多态性为基础的 d n a 分子标记【3 4 j 。2 0 世纪8 0 年代以来，分子生物学技术的快速发展为遗传多样 性检测提供了更直接，精确的方法，即直接检测d n a 本身的序列变化。遗传信 息是d n a 的碱基排列顺序，因此直接对d n a 碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性r a p d 分析 性最理想的方法，与前3 种遗传标记相比，分子标记具有如下优点【1 6 3 5 】：( 1 ) 直 接以d n a 的形式表现，不受环境、季节及个体发育状况等其他因素的影响；( 2 ) 不存在上位性效应；( 3 ) 数量极多，几乎遍及整个基因组；( 4 ) 多态性高，不需专 门创造特殊的遗传材料；( 5 ) 表现为中性标记，既不影响目标性状的表达，又与 不良性状无必然的连锁：( 6 ) 大多数分子标记表现为共显性，能有效鉴别出纯合 基因型和杂合基因型，从而提供系统完整的遗传信息；( 7 ) 部分分子标记甚至还 可以分析微量d n a 和古化石样品。 下面介绍几种遗传多样性研究中常用的分子标记技术，包括r f l p 、r a p d 、 s s r 、a f i p 。 1 1 4 1r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 标记。 r f l p 是d n a 限制性片段长度多态性的简称，r f l p l 扫b o t s e i n 3 6 】在1 9 8 0 年首先 提出，是最早发展的分子标记技术，是用已知的限制性内切酶消化从生物体中提 取d n a ，经过电泳、印迹、探针杂交，最后用放射性自显影、显色或发光分析 显示与探针互补的d n a 片段。因为每种限制酶识别专一的碱基序列，d n a 序列 的变化就会导致酶切位点的减少或增加，限制片段的长度发生变化就会显示多样 性。r f l p 技术主要包括以下基本步骤，d n a 提取一用限制性内切酶酶切 d n a 一用凝胶电泳分开d n a 片段一把d n a 片段转移到滤膜上一利用放射性 标记的探针杂交显示特定的d n a 片段( s o u t h e r n 杂交) 和结果分析。作为第 一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学相关内容研究 中，主要有p 凡弱】：品种鉴别、种质资源的筛选与评价；动植物的亲缘和进 化关系；育种研究；杂种优势的利用。r f l p 技术运用于植物抗性研究还只 是近几年的事，r f l p 能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用r f l p 技术， 对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净d n a ，则可直接 从酶切后的电泳。图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群 问不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异【3 9 加1 。r f l p 标 记的优点是：从病毒到高等真核生物，r f l p 普遍存在，它是自然发生的，不仅 数量大，而且同一位点上有较多的等位基因；r f l p 大多数是由于不编码蛋白质 区域和投有重要调节功能的区域发生了突变形成的，对植物本身无害，对重要的 经济性状也很少有次级效应；r f l p 能在植株、组织和细胞水平上测定，不受环 境的影响，能知遭变异的本质；大多数r f l p 的等位基因为共显性，因此在任何时 候分离群体中能区别所有的基因型。缺点是：对d n a 质量要求高、需要量大、操 作复杂，通常要接触放射性【1 6 3 3 _ 9 1 。 7 青海师范人学硕t 学位论文 1 1 4 2r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 标记 r a p d 是随机扩增多态性d n a 的简称，是1 9 9 0 年由美国杜邦公司的j g k w i l l i a m s 等人建立起来的第二代分子标记技术【4 l 】，此技术建立于p c r 基础之上， 使用一系列具有l o 个左右碱基的单链随机引物，对基因组的d n a 全部进行p c r 扩 增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机 引物单独进行p c r ，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以 扩增二引物结合位点d n a 序列的改变以及两扩增位点之间d n a 碱基的缺失、插 入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳 分离后通过e b 染色以检测d n a 片段的多态性；另外，为提高检测灵敏度，也可 对扩增产物进行同位素标记，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用放射自显影 检测。r a p d 技术具有以下特点： ( 1 ) r a p d 分析时所需样品为基因组d n a ，是直接在d n a 水平上的检测，因 此样品的收集不受季节、时间、发育阶段、组织类型和环境条件的限制， 也不存在组织特异性，灵敏度高，对比性较强，由于人工合成的引物种 类和数量较多，所以r a p d 标记的位点数量多，可以覆盖基因组d n a 中 的所有位点。 ( 2 ) r a p d 的检测对象是经p c r 扩增后的产物，因此对基因组的量即模板d n a 量 要求不高，同时对d n a 样品的纯度也无精细的要求，适合r a p d 反应的d n a 其o d 2 6 0 o d 2 8 0 值大约在1 8 2 0 之间。当样品d n a 中含有微量的r n a 时， 亦不会对分析结果产生太大影响【4 2 】，但模板d n a 中含有的一些小分子有机物 如某些蛋白质和脂肪可能会通过直接影响t a q 聚合酶的活性而间接影响扩增 结梨4 3 1 。 。 、 ( 3 ) r a p d 反应中p c r 要求与一般的p c r 要求区别较大，主要表现在：r a p d 扩增 是随机引物，无需专门设计，长度一般为1 0 个核苷酸，而一般的p c r 需要专 门设计的引物，且长度一般为2 0 个核苷酸左右；r a p d 反应的退火温度一般 在3 5 4 0 范围，而一般的p c r 退火温度在5 5 左右；r a p d 反应中一般 加单个引物，而一般的p c r 需加双引物；r a p d 反应中的循环次数一般为4 0 5 0 次，而一般p c r 循环次数为2 0 - - 3 0 次。 ( 4 ) r a p d 分析方便、快捷，无需克隆制备、同位素标记、s o u t h e r n 杂交等复杂性 工作，可以减少对工作人员的危害。 ( 5 ) r a p d 为显性标记，只能检测一对等位基因是否存在，无法区分基因型是杂 合的还是纯合的，通过单倍体育种获得的个体基因型是纯合的，因此可通过 对单倍体的r a p d 分析克服此缺陷；r a p d 容易受到扩增及反应条件的制约， 青海省四个地区暗紫贝母遗传多样性r a p d 分析 重复性和稳定性都不是很好，对于同一个样品，同一个引物在不同的反应条 件下扩增出的谱带出入较大，因此在具体实施前需对r a p d 反应体系进行必 要的优化。 ，+ j 1 1 4 3 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 标记 “ 简单重复序( s s r ) 也称微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e d n a ) 或短串连重复 ( s h o r t t a n d e m r e p e l s ，s t r ) 脚j ，其串联重复的核心序列为1 - 6b p ，其中最常 见是双核苷酸重复，即( c a ) n 和( t g ) n 每个微卫星d n a 的核心序列结构相 同，重复单位数目1 0 - 6 0 个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 s s r 标记的基本原理1 4 5 - 4 6 ：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过 p c r 反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用 p c r 的方法扩增出不同长度的p c r 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分 离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在真核生物中，存在许多2 5b p 简单重复序列，称为微卫星d n a 其两端的序列高度保守，可设计双引物 进行p c r 扩增，揭示其多态性。s s r 具有以下一些特点f 4 7 舶】：( 1 ) 一般检测到 的是一个单一的多等位基因位点；( 2 ) 微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合 子和纯合子；( 3 ) 所需d n a 量少；( 4 ) 在采用s s r 技术分析微卫星d n a 多态性 时必须知道重复序列两端的d n a 序列的信息，如不能直接从d n a 数据库查 寻则首先必须对其进行测序，因此，开发成本高，工作量大。 1 1 4 4a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 标记 a f l p 是扩增片段长度多态性的简称，是2 0 世纪9 0 年代发展起来的一项基于 p c r 技术的d n a 指纹技术，有广义和狭义之分。广义的a f l p 4 9 】是指所有通过p c r 反应产生的片段长度的多态性，其原理是d n a 多聚酶在催 f j ( _ , d n a 复制时需要一 小段核苷酸序列作为引物，由于不同物种或不同品种的基因组d n a 序列差异很 大，在复制特定的d n a 序列时所需引物的核苷酸序列也不相同，因而可扩增出 具有种或品种间差异的不同长度的d n a 片段来【3 4 】。狭义的a f l p 是r f l p 与p c r 相 结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组d n a 产生不同大小 的d n a 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板d n a ， 然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，引物由三个部分组成【删：核心碱基 序列，该序列与人工接头互补；特异性酶切序列：引物3 端选择性碱基。最后在 接头互补链的基础上添加l 3 个选择性核苷酸作引物对模板d n a 基因再进行选 9 i 青海师范大学硕士学位论文 择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的d n a 扩增片段，根据扩增 片段长度的不同检测出多态性。 a f l p 技术具有以下特剧3 0 舢5 3 1 ：( 1 ) 在理论上，a f l p 可产生的标记数目是 无数的，扩增效率高，多态性比例高；( 2 ) a f l p 呈典型的孟德尔方式遗传， 可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁，用于构建基因组的高密度连锁图谱；( 3 ) a f l p 标记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响，没有种属特异性，且a f l p 对模扳浓度不敏感，允许一定程度的共扩增；( 4 ) 基因组的不完全酶切会影响实 验结果，所以实验对d n a 纯度和内切酶的质量要求较高；( 5 ) a f l p 需要同位素或 非同位素标记引物，需具备特殊的放射性预防设备。同时a f l p 是项专利技术， 受专利保护，目前其分析试剂盒价格昂贵。 1 1 4 5r f l p 、r a p d 、s s r 、a f l p 四种分子标记技术的特点对比 随着分子生物学和相关实验技术的不断发展，目前应用于遗传多样性的分子 标记技术种类繁多且各具特点，除上述四种以外还有以下相关分子标记技术：可 变数目串联序歹d ( v a r i a b l en u m b e ro ft a n d e mr e p e a t ，v r r ) 、d n a 扩增指纹