（生态学专业论文）硝基蒽衍生物光毒性细胞毒理学研究.pdf

中央民旗大学硕士研究生论文 摘要 为研究多环芳烃类物质尤其是硝基多环芳烃对细胞d n a 链的破 坏作用以及多环芳烃发生光化学反应后毒性的变化情况，本论文选用 碱性彗星分析( 单细胞凝胶电泳) 实验作为实验方法进行研究。实验 首先采用紫外光作为阳性对照物对鼠淋巴细胞进行紫外诱变实验，以 建立适用于本实验的彗星分析毒性评价体系：随后采用嚣明鼠、淋巴细 胞作为实验细胞，以不同浓度的慧、9 一硝基憋、9 乙基1 0 硝基蒽作 为毒性参照物，观察其在不同紫外光照射时间和无光条件下与鼠淋巴 细胞作用瑶的彗星状荧光图像。观察指标为彗星状荧光圈像的尾部 d n a 百分含量( t a i l d n a ) 、尾长( t a i l l e n g t h ) 、尾距( t a i l m o m e n t ) 、 o l i v e 尾躐( o l i v e t a i l m o m e n t ) 四项指标。 结果显示：蒽、9 硝基蒽、9 乙基一l o 坪肖基蒽三种化台物在无光 照、紫外照射条件下均对鼠淋巴细胞造成损伤，同时由于化合物本身 发生光化学反应，使得细胞所受损伤的毒性来源发生交亿。同时 t a i l d n a 、t a i l l e n g t h 、t a i l m o m e n t 、o l i v e t a i l m o m e n t 四项指标所呈 现的曲线形式不同，其中o l i v e t a i l m o m e n t 线性趋势最好，建议采用 o l i v e t a i l m o m e n t 作为首选评价指标，其他指标作为辅助指标，多指 标共同评估的评价体系。研究结果表明：具有光化学活性的p a h s 类 物凄可以与紫外光共黼作用，通过接皴、摄入等途径对生物体内细胞 产生毒害作用。 关键词彗星分析，多环芳烃，紫外光，进性 中央民族丈学硕士研究生论文 i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h et o x i c i t yo fp a h ( p o l y c y c l i ca r o m a t i c h y d r o c a r b o n s ) e s p e c i a l l y t h a to ft h e n p a h ( n i t r a t e dp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ) ，a n dt h ec h a n g eo ft h et o x i c i 哆a f t e rp a h sa r e e x p o s e dt ou v ，w ei m p l yc o m e ta s s a y ( s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ) a so u rm e t h o d s t ob e g i nw i t h ，l y m p h o c y t eo fw h i t em o u s ei ss e l e c t e da s t h et a r g e tc e l l a n du vi sc h o s e n 弱t h ep o s i t i v ec o n t r o lt os e tu pt h e e v a l u a t i o ns y s t e mf i tf o rm y e x p e r i m e n t i nt h ef o l l o w i n gs t e p s ，w eu s c a n t h r a c e n e ，9 n i t r o - a n t h r a c e n e 。9 - e t h y l 1 0 n i t r o a n t h r a c e n e a st h et e s t c o m p o u n d st op r o c e s st h ec o m e ta s s a y ，t h e nw ea n a l y z et h ep h o t ot og e t t h e d a t aw e n e e d t a i l d n a ，t a i l l e n g t h ，t a i l m o m e n t a n d 0 l i v e l r a i l m o m e n ta r et h ef o u ri n d i c a t o r s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a ta n t h r a c e n e ，9 - n i t r o a n t h r a c e n e a n d9 - e t h y l 1 0 n i t r o a n t h r a c e n ec a nc a u s el y m p h o c y t ed a m a g e dw h e n e x p o s e dt ou v o rk e e p e di nd a r k n e s s a st h ep h o t o c h e m i s t r yr e a c t i o n p r o c e e d i n g , t h ei n g r e d i e n t sa t t r i b u t et ot h et o x i c i t yh a v ea l s oc h a n g e d m e a n w h i l e f i g u r e s a r ed i f f e r e n t a c c o r d i n g t od i f f e r e n t i n d i c a t o r s ， o l i v e t a i l m o m e n tf i g u r es h o wg o o dl i n e a rt r e n d ，s ow es u g g e s tt h i s i n d i c a t o ra st h eb e s ti n d i c a t o r , a n dt h eo t h e r sn e e dt ou s et h ec o m p l e m e n t i n d i c a t o r si no r d e rt om a k eng o o de v a l u a t i o n a tl a s tw ec o n c l u d et h e c o o p e r a t i v ea c t i v i t i e so f b o t hu v a n dp a h s ，a n dt h et o x i c i t yo ft o x i c i t y o fo r g a n i s m k e yw o r d sc o m e ta s s a y , p a h , u v , t o x i c i t y 2 中央民族丈学硕十研究生论文 第一章绪论 生物圈内存在多种多样的生态系统，构成这些生态系统的基本元素是不同种 类的生物个体，在遗传信息和环境变化的调控和影响下，生物体完成其新陈代谢 和生长发育等生命活动。而基因是决定生物体遗传发育和代谢的内因，环境因素 则会对这些生命活动产生各种各样的影响。细胞受到的环境影响可分为由感知细 胞获得的外界环境因素信息和由细胞直接接触到的化学因素。随着细胞生物学和 分子生物学的发展，基因的表达和细胞的发育分化增殖已经成为生物学家共同面 对的课题，丽其中环境因索也是研究的重中之重。 当外界环境因素直接作用于细胞遗传物质时，细胞遗传信息的表达和调控就 会发生一定程度的改变，而当外界因素对遗传物质有破坏作用时，就会对严格遵 守复制表达规律的基因链的结构造成影响，基因链的复制过程严格遵守了碱基配 对的原则，一个碱基遭到破坏都将使细胞产生极其严重的影响虽然细胞具有自 我修复的能力，但当毒害作用过大时这种修复作用就会失效，细胞就会产生变化， 随着臭氧空洞的日益扩大，到达地球表面紫外线强度和辐射量日益增大，一些具 有光化学活性的环境污染物受到紫外光的作用后结构发生改变，并与紫外光共同 作用，表现为生物体生命指标的改变如病变、衰老、甚至会造成稳定的遗传病变， 这种病变开始时只会影响生物个体，随着生物体的繁衍，将会对物种、种群、乃 至生态系统造成破坏，因此我们必须对这种物质的危害程度进行准确的评价，从 而对化合物毒性的研究和相关标准的制定提供依据。 第一节p a i l s 光毒性 大多数种类的多环芳烃来源于木材，天然气、汽油、重油、有机高分子化合 物、纸张、作物秸秆、烟草以及石油、煤等化石燃料等含碳氢化合物的物质经不 完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。环境中多环芳烃的主要来源是化 学工业污染源、交通运输污染源、生活污染源和其他人为源。 中央民族大学硕十研究生论文 自然环境中多环芳烃广泛存在于人类生活的环境内如大气、水体、土壤、作 物和食品中。目前已知的多环芳烃约有2 0 0 多种大气中p a l l s 以气、圃两种形式 存在，其中分子量小的2 环3 环p a h s 主要以气态形式存在，4 环p a h s 在气态、颗粒 态中的分配基本相同【l 】5 环7 环的大分子量p a l l s 则绝大部分以颗粒形式存在。 目前，国内外已经有了大量对环境中p a h s 的存在和分布情况的研究报道【2 】， 国际上许多研究癌症的组织和美国环保总局也对可能对人类致癌的化合物进行了 分类。研究表明，环境中普遍存在的p a l l s 会在肺部、膀胱、皮肤组织诱发恶性肿 瘤，而空气中污染物经过复杂的协同作用，使得人类患癌症的几率大大增加。例 如，据报道，美国一些空气污染比较严重的大城市，患肺癌致死的几率显著提高， 而p a h s 是空气中主要致癌因素。 在生理条件下，p a l l s 本身并不与牛物大分子发生反应，而是产生能够使暴露 于光线下的皮肤或眼部组织受到损害，包括致突变和肿瘤。当它进入生物体时， 这些光敏性的物质首先在自身免疫系统的代谢及转运作用下通过局部渗透或者内 吸收循环系到达靶组织，p a i l s 在哺乳动物体内的代谢主要是在肝脏，虽然其他的 代谢酶也参与在新陈代谢过程中，但催化作用主要是细胞色素酶t 4 5 0 由于p a l - i s 极性和水溶性都很小，使褥其易于从体内排除，这完全是一个清除和生物降解过 程，然而一些p a h s 可以立即与核酸反应，形成共价化合物，导致基因毒性p _ 。 硝基多环芳烃【5 l ( n p a h s ) 的致癌性研究始于2 0 世纪8 0 年代初，由于n p a h s 有硝基功能基团，使得硝基多环芳烃的代谢反应涉及复杂的途径，包括环氧化物 和硝基还原。代谢反应方式也包括硝基功能基团的还原，多环芳烃羟基氨的中间 产物能够与d n a 形成d n a j j f l 合物。 这些光毒性化合物的一般特性是它们能够吸收太阳光中的特定波长的光，并 产生受激发的中间体、活性氧簇或者最终产生的稳定的光化学产物使得电子或能 量转移到分子氧、溶剂或者与细胞中的生物大分子发生生物反应，这些生物反应 或者中间物质能够破坏细胞结构如细胞膜、核酶、氨基酸或蛋白质以及细胞中的 辅酶等，反应的结果是形成了单线态氧、超氧化物、e a h 自由基、d n a f l 由基、 氧化p a l l s 反应中间体和其他反应中间体。最终导致严重的细胞毒性和遗传毒性。 由于破坏程度以及被破坏生物大分子的种类有所不同，破坏后的细胞可能会被修 2 中央民族大学硕十研究生论文 复成为无害状态也可能破坏严重而导致细胞死亡，还可能会造成基因突变对后代 产生有害的影响作用。这些都与光遗传毒性的诱导机制相同1 8 】口有证据表明，p a h s 及其混合物对于微生物、植物，单细胞生物以及动物体都具有光毒性，而且关于 p a i l s 暴露于光线下比黑暗中毒害作用更强的相关报道也已经发表，并表明其毒性 增强超过1 0 0 倍一些文献对于此具有此类光毒性的化学物质进行了总结【6 】。 总的来说，光毒性的机理可以总结为两种方式：动态光毒性，在化学生物 光转移过程中，由激发产生的能量转移到生物大分子上导致生物分子的能量增高。 电子转移产生p a l - i s 和生物分子自由基，短暂的生物中间体如单线态氧1 9 l 、超氧自 由基，从而造成细胞损伤；致毒光产物，在光降解过程中，一些相对稳定的光 化合物如醌、硝基p a l - l s ，不管有没有光照的参与，这些物质都具有毒性r ”。 光能够诱导多种分子破坏细胞膜、蛋白质和d n a 。经过照射的蒽等p a h s 分子 与人类血浆蛋白反应产生蒽一蛋白质共价化合物，从而使蛋白质胶联。 而目前研究的主要方向集中在对d n a 破坏的研究上，这些都是由于p a h s 分子 的致癌性以及其代谢反应后形成的d n a 自f l 合物有关。d n a 与光化学产物作用可能 造成的破坏包括：单链断裂双链断裂碱基缺失8 位的鸟嘌呤氧化物嘧啶 二聚体嬗) d n a j h 合物d n 晓间发生胶联d n a 与蛋白质之间的胶联。目前研究 也已取得很大的进展。 第二节过去建立的毒性评价体系 以往对于光毒性的研究主要是对实验动物或者志愿测试者进行生物个体水平 的检测，而测试的内容主要是临床症状例如红斑、水肿或者炎症1 1 4 1 。由于急性光 毒性与严重晒伤的症状十分相似，都会使受测试生物的皮肤都产生水泡因此， 处于道德考虑和相关法律的规定，使得这些类型的实验逐渐被淘汰，而新兴的体 外实验方法得以广泛应用，实验中采用了红血细胞和其他哺乳动物细胞例如淋巴 细胞、表皮细胞、以及最近刚发展出来的专门用于光安全测试的重组表皮模型 近些年来，在这个领域出现了很多分析光毒性的技术，包括有：大环d n a ( 裸 露d n a ) 毒理学实验f 排1 羽、应用细菌的光毒性实验( a m e s 实验) 1 1 3 1 、h p r t m l a 3 中央民族大学硕七研究生论文 分析【 i 、体外染色体畸变实验( c a 实验) 【阍、体外微核实验( m n t ) 微核实 验是根据环境污染物能引起染色体畸变后其片断不能重新并入子代染色体而形成 小核或微核的原理来检测诱变物质对染色体损伤作用一种简单易行的方法、姐妹 染色单体交换实验( s c e ) 该实验是对染色体损伤后姐妹染色单体间d n a 片断的 交换进行的检测、彗星分析( c o m e ta s s a y ) 或称单细胞凝胶电泳。 几乎所有的新化合物的毒理评价体系都采用的是紫外一细胞活性相关性。而 上述实验都是毒理研究中最常用的。其中最早的要属1 9 8 0 4 z 代的体外染色体畸变 实验和h p r t 实验，用来研究采用补骨脂素的牛皮癣疗法。1 9 9 0 年代a m e s 实验则 首先被用于对防晒剂的毒理研究。并且无照射条件下建立的操作同样适用于紫外 照射条件下的实验。而对于未知新化合物光毒性的评价，体外染色体畸变实验较 为灵敏和准确。而近年来微核实验( m n t ) 发展迅速，它比c a 实验的灵敏度和特 异性更高，但这套检测手段的标准操作规范还正在探索中。这几年来，由于彗星 分析技术的独特优势，使之在毒理学检测方面得到了非常广泛的应用。 第三节彗星分析实验综述 f 1 日o s t l i n g ( 1 9 8 4 ) l l ，嘈次提出彗星实验( c o m e ta s s a y ) 也叫单细胞凝胶电泳 技术( f i n # ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ，是一种在单细胞水平上检测d n a 损伤与修 复的方法。单细胞凝胶电泳所需细胞数量非常少，往往只需要数千个细胞，适用 于各种真核细胞，所需设备简单，试剂花费少且易得，而且快速、灵敏，从采样 到结果分析只需数小时，整个过程可在一个工作日内完成，每1 0 9 个相对原子质量 d n a 分子中可检测出o 1 个d n a 断裂1 1 s l 。由于以上优点，彗星实验已被广泛应用于 生物学、l i 缶床和毒理学等科研领域。 一、彗星分析( 单细胞凝胶电泳) 的发展历程 彗星分析技术是从其他相关技术中受到启示而产生的技术，首先应该提到的 是在1 9 7 6 年发明了一种研究d n a 损伤的方法【埘是将含有非离子型去垢剂和高摩 尔浓度n a c i 的裂解液裂解细胞，细胞膜在这种条件下将被破坏的细胞质和核质从 4 中央民族丈学硕十研究生论文 细胞中游离出来，染色体结构破坏，与之附着的大量组蛋白也被高盐抽提，剩下 的只有核骨架。当d n a 损伤时在这样的实验条件下会发生解旋，使d n a 碎片从 细胞核向外扩散形成“h a l o ”，当d n a 损伤的程度加剧时，h a l o 环的面积就会增大 【刎。 此后在1 9 7 8 年，科研人员在其基础上首次在单个细胞的水平上对d n a 损伤进 行定量检测1 2 “含有靶细胞的琼脂糖铺在载玻片上，用裂解液裂解细胞，裂解液 中含有很高浓度的盐和表面活性剂，然后在弱碱性条件下将d n a 解旋，中和后使 用吖啶橙作为染色剂，采用显微分光光度计测定绿色荧光与红色荧光强度，根据 两种荧光强度的比值定量分析d n a 的损伤程度。但是该实验的条件受到很大限制， 该研究方法未能得到广泛应用，但是给随后该领域的发展起到承前启后的作用。 为了提高方法的灵敏度，o s t l i n g 帛t l j a n h a n s o n 发展了中性微凝胶电泳技术，即 中性彗星分析( 单细胞凝胶电泳) 技术【切。首先将细胞包理于琼脂糖凝胶中，置 于显微镜载玻片上，用高浓度的表面活性剂和盐裂解，然后在中性条件下短时间 电泳，d n a 碎片从细胞核向阳极移动，从而形成类似于彗星尾巴的形状细胞中 d n a 损伤越大，断片移行的距离也就越长，d n a 的移行可用溴化乙锭( e b ) 染色后 用显微光度计测定o l i v e r 等改良了上述中性s c g e ，采用更严格的溶解条件，使 9 5 以上的细胞蛋白质被除去。在中性条件下，d n a 链仍保持双螺旋结构，偶然 的单链断裂( s i n g l e s t r a n d e db r c a l 【s ，s s b s ) 并不影响d n a x 3 t 螺旋大分子的连续性。只 有当d n 坝链断裂( d o u b l e - s t r a n d e db a b 。d s b s ) 时，才使d n a 断片进入凝胶中迁 移。因此，中性条件下裂解和电泳只能检测d s b s ，不能测定s s b s ，而许多物质诱 导的d n a 单链断片数量比双链断片高5 - 2 0 0 0 倍。所以，中性s c g e 检测d n a 损伤的 敏感度明显不高。它的使用也仅限于研究放射线和拟辐射化合物对d n a 的损伤作 用。因此1 9 8 8 年s i n g h 瞄建立了碱性彗星实验( p h 1 3 0 ) ，该实验能够检测单、双链 的断裂和碱性不稳定点( 某些损伤因子能够导致脱嘌呤或者脱嘧啶位点的产生，形 成碱性不稳定点吲，其在强碱条件下能够转换成d n a 链的断裂) ，从而使检测的灵 敏度得到极大改善。大部分具有基因毒性的化学试剂所诱导的d n a 单链断裂和碱 性不稳定点要多于d n a 双链的断裂，如x 射线和h 2 0 2 诱导的d s b s 与s s b s 之比分别 是1 ：2 0 和1 ：2 0 0 0 ，因此碱性彗星检测即成为十分灵敏的d n a 损伤的检测方法 5 中央民族大学硕十研究生论文 2 0 世纪9 0 年代以来，s i n g h 与o l i v e 的两个实验室分别重点研究了影响细胞彗星 图像的因素并努力提高该方法的灵敏度，他们对实验中的某些关键处理过程对结 果的影响进行了研究。1 9 9 0 年，o l i v e 等建立了尾长指标并首次叙述了“尾矩( t a i l m o m e n t ) ”的概念1 2 , q ，定义为尾部d n a 占总d n a 的百分比与尾长的乘积。各研究 者用实验证实该指标比以前所使用的指标都优越，很快就被广泛接受。随后，各个实 验室相继建立了一些新的分析指标，如：彗星矩陋l ，尾惯量嗍等 为了检测某些特异性的d n a 损伤，有的研究者将损伤因子作用后的细胞再用 特异性修复酶处理，修复酶可将特异性d n a 损伤转换成d n a 链的断裂，从而提高 了彗星实验检测的特异性。如核酸内切酶l l i ( e n d o n u c l e a s ei l n 可以用来检测嘧啶氧 化损伤【2 7 】，随后1 9 9 6 年，c o l l i n s 等对该方法进行了进一步改进，并利用核酸内切 酶i i i o ! n d o i i i ) 和甲酰胺嘧啶糖基酶分别检测了氧化嘧啶和8 羟摹鸟嘌呤的损伤。 1 9 9 7 年，s a n t o s 2 8 1 等首次将s c g e 技术与d n a 荧光原位杂交技术( n u o r e s c e n c c i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 结合起来，为s c g e 技术的应用开辟了新的途径。 在第三届人口与环境突变世界大会上，i 由s p c i t ，g s r a m , r t i c e ，r 主持成立了 彗星实验工作小组，以便对全世界从事彗星实验检测的人们提供方法和应用上的 支持。 1 9 9 9 年3 月2 5 2 6 日在华盛顿举行的国际遗传毒性检测程序工作会议0 w o t p ) 上彗星实验的指导方针得到确立。与会代表们认为碱性彗星实验吲最适合用来检 测各种物质的遗传毒性。这是因为碱性彗星实验能够检测d n a 单链断裂( s s b ) 、碱 性不稳定点( a l s ) 、d n a 之_ 间的交联、d n a 与蛋白质之间的交联以及与d n a 单链 断裂相关的不完全切除修复位点等多种d n a 损伤。会议对碱性彗星实验的各个步 骤进行了介绍，并对不同的彗星实验方法进行了介绍例如用不同p h 的电泳缓冲 液进行电泳，以区别d n a 链的断裂和碱性不稳定点。用各种修复酶和抗体检测特 异性的d n a 损伤，用中性扩散实验来区别凋亡和坏死，用非细胞体系来检测待测 试剂和d n a 的相互作用i 冽等，这些基础性的研究为这项技术在实践和理论中的发 展都起到了十分巨大的作用 2 0 0 1 年，n a d i n 等建t s c o e 锈t 染法1 3 0 j ，进一步提高了损伤d n a r 析的灵敏 度。 6 中央民族大学硕十研究生论文 此后，彗星分析作为一门发展势头非常强进的方法，广泛的应用到各研究领 域之中，然而对于该实验的一些具体操作和评价指标，目前还没有一个统一的标 准，g e i s e n b r a n d a 等人与2 0 0 2 年p 、h a r t m a n n 等人分别于2 0 0 3 1 3 2 1 及2 0 0 4 3 3 1 年发表 了最新的彗星分析操作指南，对于彗星分析标准的全球统一化起到了指导作用。 2 0 0 5 年至今，全球应用彗星分析方法进行的实验在生物，医学、环境等相关 领域更加广泛的得以应用，发表的文章数量不断增多。 二、彗星分析( 单细胞凝胶电泳) 的原理 哺乳类动物体内细胞的d n a 的分子量很高并呈超螺旋结构。在细胞核中， d n a 双链以组蛋白为核心形成核小体，在核小体中d n a 为负超螺旋结构，当细胞 内的d n a 没有受到外界因素破坏时进行电泳实验，则外加电场不会使d n a 在凝胶 中迁移。而当各种因素使得细胞d n a 链断裂时，d n a 的负超螺旋结构将会遭到破 坏，在细胞裂解液作用下，各种膜结构被破坏，细胞内的各种蛋白、r n a 及其它 成分均扩散到裂解液中，而核d n a 分子量很高不能进入凝胶，仍然保留在核区。 d n a 翟e 碱性环境中螺旋，被破坏后形成的d n a 碎片从超螺旋结构中释放出来，这 些d n a 碎片分子量较小而且多为单链，所以在电泳时带负电荷的d n a 碎片就可以 离开核区向电泳槽阳极移动。未被破坏的d n a 在电泳中滞留于核中形成较大的荧 光亮点，游离出来的d n a 碎片则形成的类似彗星尾部的微小的荧光亮点，从而形 成彗星分析实验中所特有的“彗星”状图像。d n a 受损伤愈严重，产生的d n a 碎 片就越多也越小，相同电泳条件下迁移的d n a 量就越多，由于凝胶分子筛具有空 问阻挡效应，使得越小的d n a 碎片电泳迁移率越大，迁移的距离也愈长。 三、彗星分析( 单细胞凝胶电泳) 的基本实验流程 在o s t i n g 等的中性电泳和s i n g h 等的碱性电泳基础上，现已发展了多种实验方 法，比较常用的是碱性条件下的电泳，其基本实验路线包括以下步骤。 ( 一) 准备细胞 该实验中主要生物基础物质是各种细胞，不同实验最终均需获取一定数量的 7 中央民族大学硕叶：研究生论文 均匀分散的各种细胞，有的是通过体外培养获得嗍，有的是通过组织分离获得1 3 5 1 ( 二) 检测细胞活性 在电泳前应检测细胞活性，一般采用台盼蓝染色计数，存活率一般需大于 9 0 ，然后用p b s 配制一定浓度细胞悬液。 ( 三) 铺胶 近年来尽管己在制胶等各方面进行不断改进，例如由传统的磨砂载玻片上铺3 层凝胶的“夹心法”改进为2 层或单层灌胶法，但胶板易损坏和胶落的问题仍没有 得到很好解决，并且操作步骤多、时间长，给该技术的规范和推广带来一定困难。 目前一些国外公司研制了一些殊的载玻片，例如t r e v l g e n 公司的t r e v i g e n c o m e t s l i d e t m ，这种载玻片提高了低熔点琼脂糖和载玻片的附着力，并且减少了常 规制胶方法中既耗时又不可靠的底胶制备方法。但是这些产品价格不菲，为节省 成本一般需多次使用，在其使用过程中多次浸染e b ，这样会造成交叉污染。 ( 四) 裂解 裂解细胞的原理之前已经叙述过了，主要是为了除去膜和蛋白，以便使断裂 的d n a 片段能够在外电场所施加的电场力的作用下从细胞核区中游离出来 裂解液由高盐与表面活性剂构成。这些成分使所有蛋白质变性，膜结构被破 坏，细胞内的大部分物质被溶解，扩散至裂解液中，与d n a 相结合的组蛋白在高 盐的作用下也与d n a 分离，扩散到裂解液中。 ( 五) 解旋 解旋的目的有两个，一是将双链d n a 变成单链，二是使r n a 降解。 目前彗星实验常用解旋液( 1 r a me d t a + 3 0 0 m mn o h ) 的p h 值在1 3 以1 - ，细胞 d n a 在此环境下，很快变性解旋，由双链变成单链，同时高碱能使l 心a 全部水解。 ( 六) 电泳 凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法。它有许多优点：简单，快速，灵敏， 成本低，凝胶电泳有分子筛和电泳的双重效果，所以分离效率很高。 与常规的琼脂糖凝胶电泳相比，彗星实验中d n a 迁移则受制于更多的因素， 包括细胞裂解的程度，d n a 解旋的程度，染色体高级结构等。 彗星实验一般选用低电压( o 5 5v c m ) 和短时n ( 5 3 0m i n ) 电压过高、 8 中央峙族大学硕十研究生论文 电泳时间过长虽然能提高检测灵敏度，但可能会使正常的细胞形成少许拖尾而出 现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假 阴性结果。 ( 七) 中和 即将电泳后玻片上的高碱性环境中和掉，以便下一步的染色。 ( 八) 染色 中和后要进行的步骤就是染色，所用染料有吖啶橙、溴化乙锭、碘化乙锭等 多种目前大多数实验室采用的是溴化乙锭( 髓) ，这种物质毒性很大，但是价 格低廉。染色时间为2 2 0m i t t ，防止荧光衰减，应尽快阅片。 ( 九) 细胞观察与图像分析 结果的采集工作主要是在显微镜下完成的，通过带有落射荧光的显微镜，我 们可以清晰的看到细胞所发出的激发荧光。受到损伤的细胞呈现出彗星形状，细 胞损伤越严重，彗星的尾部就越长，我们通过光学采集系统以及相应的软件( c a m p 1 2 2 ) 对彗星的各项指标进行分析，最终对于细胞的损伤程度进行评价，得出相 应的结论 ( 十) 评价指标 在对彗星图像进行分析时，目前绝大多数采用软件分析，这些指标可归纳为 各种距离相关性指标和荧光强度相关性指标，而这些指标经过数学计算就可以得 到相关的评价标准。为了使该实验能够更加准确的评估细胞受到的毒害作用，不 断有新的评估指标诞生。而且为了证明这些新指标的准确性，更多的基础性研究 得以进行 四、彗星分析实验与其他毒理实验灵敏性的差异 彗星实验是一套非常敏感的用来评价遗传性损伤的系统，它能够检测出细胞 群中d n a 损伤与修复在细胞间的差别；所需的样品细胞少“l - l o o o o 个) ，而且目前 国内外已经基本采用电脑显微成像与软件辅助分析方法，使得彗星分析实验结果 的人为干扰因素大幅度降低，大大提高了它的灵敏度。一些研究证实彗星实验的 9 中央民族大学硕十研究生论文 敏感性较高，能在1 0 t o d a d n a 分子中检测出1 个断裂。另外，由于某些致癌物或诱 变剂具有交联作用，在形成d n a - d n a 以及d n a - 蛋白质的交联后，增加了d n a 分 子量从而阻止d n a 的迁移，降低了彗星实验的敏感性。值得注意的是，不同诱变 剂的毒作用性质不同，也会影响实验方法的敏感性。如对金属化合物、氧化剂， 彗星实验的敏感性高于a m e s 实验，而对黄曲霉毒素b 1 ，彗星实验的敏感性低于 a m c $ 实验 第四节实验的目的与意义 多环芳烃这种环境污染物致癌性很强，是一种隐性的杀手，也是环境污染物 中最重要的监测项目之一。多环芳烃的真正危险在于它们暴露于太阳光中紫外光 辐射时的光致毒效应。多环芳烃最主要来源于原油提炼过程以及油类和煤炭的燃 烧，比如汽车尾气的排放，通过吸附在粒径小于5i lm f 3 6 】的烟尘及颗粒物中，通过 大气、水广泛传播阳。这类物质在环境中是普遍存在的，这些颗粒物可直接进入 肺泡，危害人体健康1 3 ”。由于p a h s 中存在多环系统，多环芳烃类的离域大键可 以吸收太阳光的可见( 4 0 0 7 0 0 砌) 和紫外( 2 9 0 4 0 0 n m ) 部分【3 9 , 4 0 l ，p a h s 和光线共 同作用导致d n a 单链断裂，d n a 碱基氧化并形成d n a 共价加合物，产生系列反应， 对细胞结构造成破坏。随后产生的生物化学反应，对生物个体乃至种群及整个生 态环境造成极大的危害。因此，光化学反应作为水、土壤、大气中多环芳烃转化的 种重要途径而受到广泛重视1 4 l 】。因此，深入了解多环芳烃的光毒性机理对于此 类化合物的治理以及其对生物的致毒效应有着十分重要的意义。并且能够阐明多 环芳烃对人体的危害，研究防治多环芳烃污染的措施，将有助于人们更好的保护 环境、净化环境，从而维护人类健康。目前对于多环芳烃光毒性及细胞毒理学的 研究尚存在着许多关键科学问题，而对于硝基多环芳烃的光化学产物的毒理学相 关研究更是少之有少在测定技术方面缺乏标准的测定方法体系，在毒性筛选方 面缺乏有效的毒性评价体系，在机制方面缺乏有效的剂量一效应关系研究方法等。 本实验的意义就在于对多种多环芳烃类物质以及他们光化学产物光毒性进行 研究，通过建立彗星分析评价体系，衡量不同评价指标之间的一致性，找出最为 中央民族大学硕士研究生论文 可靠、快速、精确的评价指标，对于今后毒理学评价及毒性的研究工作有一定的 借鉴意义。 l l 中央民族大学硕十研究生论文 第二章彗星分析紫外诱变检测体系的建立 第一节材料与方法 一、实验材料 r ) 实验动物昆明鼠，雌雄不限，体重为1 8 2 2 克，购自中国科学院动物研究 所，动物均为北京市动物管理委员会颁布许可证的2 级小鼠 ( 二) 诱变条件1 0 0 w 紫外灯美国s p e c t r o l i n es b 一1 0 0 p f3 6 5 n m ( 三) 试剂 n a h c 0 3 ：北京化学试剂公司分析纯相对分子量8 4 0 1 n a c l ：二 t 京化学试剂公司分析纯相对分子量5 8 4 4 k c i ：= f p , 京北化精细化学品有限责任公司分析纯相对分子量7 4 5 5 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ：北京世纪红星化工有限责任公司分析纯相对分子量 3 5 8 1 4 k h 2 p 0 4 ：北京世纪红星化工有限责任公司分析纯相对分子量1 3 6 0 9 n a 2 e d t a ：a m r e s c o 相对分子量3 7 2 - 2 二甲基亚砜，( d m s o ) ：a m l e s c o 相对分子薰7 8 1 3 正常熔点凝胶琼脂糖( n m a ) ：( n m a ) ：s h a n g h a iy i t ob i o i n s t r u m e n t c o m p a n y l i m i t e d r e g u l a r 低熔点凝胶琼脂糖( l m a ) ：p r o m e g a 乙醚：北京化学试剂公司分析纯相对分子量7 4 1 2 t r i s ：a m l e , s c o 相对分子量1 2 1 0 t r i s h c i ：a l n r e , s c o 相对分子量1 5 7 6 4 肌氨酸钠- a m r e s c o 相对分子量2 9 3 - 4 t r i t o n x - 1 0 0 ：a e l l r e s c o 相对分子量6 4 6 8 6 n a o h ：；j ；京北化精细化学品有限责任公司 中央民族大学硕士研究生论文 甘油：a m r e , s 台盼兰：a n l r e , s c o 相对分子量6 7 0 0 t r i s b a s e ：n o v o n 鼠淋巴细胞分离液：天津灏洋生物制品科技有限责任公司 ( 四) 溶液 p b s ( p h 7 2 7 正常熔点的琼脂糖凝胶( n m a ) 溶液( o 7 5 ) 低熔点琼脂糖凝胶( l m a ) 溶液( ( o 7 5 ) 裂解液( 2 s m o l l n a c l ，1 0 0 m m o l l e d t a n a 2 , 1 0 m m o l l t r i s1 肌氨酸钠，使 用前加入1 t d t a n x 1 0 0 ，1 0 d m s 电泳液( 1 m m n a 2 e d t a , 3 0 0 m m n a 0 h ，p i l l 3 0 或 1 3 0 ) 中和液( o 4 m ，p h 7 5 的t r i s 缓冲液) 染色液( o - 5 溴化乙锭) ( 五) 主要仪器 荧光显微镜o l y m p u sc x 4 1 成像系统p e n g u i n1 5 0 c l m 气流烘干机河南省予华仪器有限公司 天平上海精密科学仪器有限公司0 1 m g m i l l i q 超纯水机m i l i p o t e 冰箱容声b c d 2 7 2 a y 紫外灯美国s p e c f r o i j n em o d e ls b - 1 0 0 p f3 6 5 n m 4 2m w c m 2 电泳槽北京六一仪器公司 d y c p - 3 4 a 离心机s i g m as a t t o r i u s1 - 1 5 k 电泳仪君益东方佯c z 5 灭菌锅t o m ya u t o c l a v es s - 3 2 5 移液枪e p p e n d o f f 2 5 ul ，2 0 i ll 、2 0 0 i ll 、1 0 0 0 ul 中央民族大学硕十研究生论文 p h 计雷磁p h s - 3 c 电子调温电热套天津市泰斯特仪器有限公司 水浴锅北京长风仪器有限公司1 5 0 0 w 载玻片c a t n o 7 0 1 型新康医疗器械有限公司 分析软件：c a m p1 2 2 二、实验方法 ( 一) 鼠淋巴细胞的提取 本实验采用小白鼠淋巴细胞作为实验对象。首先用乙醚使小鼠昏迷，采用心 脏取血法，采集l m l 血液( 3 0 l ll 肝素) ，2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，取中问层的白 细胞和血小板，按照1 ：1 比例加入鼠淋巴细胞分离液，2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，取 中层淋巴细胞。 ( 二) 通过细胞存活率预测诱变剂量 本实验采用4 2 m w c m 剂量的3 6 5 n m 紫外光作为阳性致突变因素，对鼠淋巴 细胞照射并观察细胞的存活率。目标存活率应大于9 0 才能比较确切的反映受测 试物的遗传毒性，照射剂量过大将对导致细胞毒性，导致细胞死亡。每组实验使 用同样的操作条件进行两次平行对照实验。 1 准备细胞 将提取的小鼠淋巴细胞用适量p b s 缓冲液稀释至1 0 6 - 1 0 7 m l 的细胞悬液，用 移液枪将细胞悬液移入9 6 孔细胞培养板中。 2 紫外照射 将上一步准备好的细胞板置于紫外灯下1 5 c m ，调整位置，使得细胞位于紫外 灯最强光照范围之内( 紫外照射实验均完成于避光暗室内，温度恒定) 实验中采用的照射时问为：5 m i n 、1 0 r a i n 、1 5 r a i n 、2 0 r a i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 、4 0 m i n 、 1 4 中央民族大学硕十研究生论文 5 0 m i n 、6 0 m i n 。 3 细胞活性的检测 进行到不同的照射时间时用移液枪将细胞悬液吸出移入另一培养板中，用微 量加样器吸取0 5 m l o 1 台盼兰置于各孔中，吹打均匀，染色1 - 2 m i n 。 取一滴染色后的淋巴细胞悬液滴入细胞计数板，按标准操作记录计数板的相 应方格内的淋巴细胞数量。 淋巴细胞的存活率= 堇璺至旦墨差詈嘉釜器曩型，0 0 公式二， 以此计算出不同染色剂量下的淋巴细胞存活率。 ( 三) 紫外照射 根据上述预测的步骤进行紫外照射实验，并根据计算公式 细胞悬液细胞总数d ( 细胞悬液浓度) ；尘盔查整亟塑堕望墼。1 0 公式2 - 2 4 ( 计数前如果已经稀释，则乘以稀释倍数) 根据公式2 - 1 计算细胞存活率( ) 。 ( 四) 彗星实验凝胶板的制备 实验采用双层铺胶法，据有关文献记载，双层铺胶法对于实验结果没有影响 淋巴细胞悬液的制各： 将提取到的淋巴细胞用p b s 稀释，制得5 1 0 6 浓度的淋巴细胞悬液，避光封 存，用于彗星电泳实验凝胶板的制备 1 普通载玻片的预处理 以往文献中提到的彗星实验用载玻片预处理很繁琐，不易制备，而且很容易 脱胶，本实验中将载玻片的四周粘上宽2 r a m 的细玻璃条并用粘合剂粘牢，这样将 凝胶固定在玻璃槽中，可以完全解决普通载玻片脱胶的问题，为防治交叉污染， 中央民族大学硕十研究生论文 所有玻片均只使用一次。 2 第一层凝胶的制备 首先用记号笔将载玻片编号，然后制备o 7 5 的正常熔点琼脂，称取0 7 5 9 正 常熔点琼脂溶解与1 0 m i p b s 中加热至微沸，用移液枪吸取2 0 0 l 平铺与预制的 载玻片中，4 下固化l o m i n 。 3 第二层凝胶的制各 制备o 7 5 的低熔点琼脂，称取o 7 5 9 低熔点琼脂溶解于1 0 m l p b s 中加热至 微沸，然后放入3 7 水域中以防止再次凝固，将细胞悬液和低熔点琼脂按照l ：2 的比例混合均匀取1 0 0 pl 平铺在第一层凝胶上( 每板约1 0 0 0 0 细胞) ，4 0 下固化 l o m i n 。 ( 五) 最适裂解时间 将固化好的凝胶板浸入新配制的4 c 细胞裂解液中( 2 s m o l l n a c l ，1 0 0 m m o l l e d t a n a z , 1 0 m m o l l t r i s1 肌氨酸钠，使用前加入1 t r i t o n x - 1 0 0 ，1 0 d m s o ) ， 置于4 c 冰箱中避光保存，分别裂解1 h 、2 h 、3 h 、铀，以确定最佳裂解时间 ( 六) 解旋与电泳 将彗星电泳凝胶板从裂解液中取出后，用超纯水洗涤，除去多余水分并置于 水平电泳槽内，由于本实验不存在点样，所以凝胶扳两端朝向问题不需要考虑， 但建议靠近阳极端，将电泳槽置于4 c 冷冻层析柜中，将新配置的预冷置4 c 电泳 缓冲液( 1 m m n a 2 e d t a , 3 0 0 m m n a 0 h 。p h l 3 0 或 1 3 0 ) ，液面高于凝胶板2 至3 m m ， 解旋4 0 r a i n 电压为电泳槽两极间的距离与电场强度( 0 8 v c m ) 的乘积，本实验中采用的 电泳槽两极距离为3 2 c m ，故调整电压为2 6 v 。本实验中需要固定的是电场强度， 与电流无关，因此只需保持电压固定、电流恒定即可。电泳时间为2 0 m i n 。 ( 七) 中和 中央民族大学硕十研究生论文 电泳完毕后，将凝胶板从电泳槽中取出，放入平盘中，将4 c 的0 4 m 。p h 7 5 的t r i s 缓冲液缓缓滴入凝胶上，中和1 0 m i n ，然后更换中和液再中和1 0 m i n ，超纯 水洗净后用滤纸吸去多余水分 ( 八) d n a 染色 用注射器将0 5 m g l 的e b 溶液滴到载玻片上，染色2 r a i n 后，用超纯水洗涤 多次，将水吸取，实验过程中注意防止e b 污染。 ( 九) 荧光检测 每组实验均平行做两次，每种处理每次取5 0 个细胞进行检测。将凝胶板置于 荧光显微镜下观察拍照，本实验采用零级1 5 0 万像素黑白数码成像采集系统，能 够非常灵敏的采集微弱的荧光，使得实验更加精确，数据