（生物化学与分子生物学专业论文）atp生物发光法中atp提取剂的研究.pdf

华东师范大学硕士学位论文摘要 摘要 a t p - 生物发光法是一种用于分析待检测样品中有无微生物及其数量的方法。 自2 0 世纪4 0 年代末期虫萤光素一萤光素酶体系在萤火虫中被发现并被用于检测 a t p 含量，该方法已逐渐成为精确测量a t p 水平及检验微生物的快速方法。随着 食品生产的危害分析与关键控制点( h a c c p ) 制度的普遍实行，迫切需要一种快 速简便的微生物检测方法满足市场需求，因此提高该方法的检测灵敏度、改进检 测方法并扩大检测应用范围，成为目前研究比较活跃的领域，为了使虫萤光素酶 检测方法达到广泛的应用，十分有必要选择合适的a t p 提取剂及其提取方法以使 该方法更趋方便、完善。 本文作为a t p 提取剂的初步研究，主要内容包括：阳离子季铵盐类a t p 提取 剂的选择及提取方法的确定，阳离子季铵盐类a t p 提取剂提取环境的构建，阳离 子季铵盐类a t p 提取剂提取细菌a t p 机理的初步探索，a t p 生物发光法与传统微 生物检测方法在实际应用中的比较。上述工作将为a t p 生物发光试剂盒产品的开 发及a t p 生物发光法在食品及环境领域的广泛应用提供了良好的基础。 通过对细菌a t p 提取效果的比较，获得了如下结果：确定了季铵盐阳离子表 面活性剂类a t p 提取剂的浓度为0 0 5 ，提取时间为3 m i n ；并确定了a t p 提取剂 复配的最佳条件：p h 值5 2 ，c u “浓度为0 1 - 0 耻g m l ，d e a e 的浓度为0 0 5 ， p h m g 与b a b 复配的最佳浓度为1 、时间为3 m i n ；另外，为配合a t p 提取荆工作， 缓冲体系中小牛血清白蛋白( b s a ) 及e d t a 的浓度分别确定为0 0 4 - 0 0 6 和 0 4 m m 。 大肠杆菌和金黄葡萄球菌被季铵盐阳离子表面活性剂类a t p 提取剂处理后， 其数量、超微形态结构及2 6 0 h m 紫外吸收物均发生变化，表明了季铵盐阳离子类 a t p 提取剂作用于细胞外部结构并进而改变细胞通透性；对本研究采用的a t p 提 取荆与其它两种市售的a t p 提取剂的高效液相色谱图进行了比较分析，由出峰时 间的不同判断本论文中研究的季铵盐阳离子表面活性剂类a t p 提取利与其它提 取剂成分不同，具有创新性。 对利用a t p 生物发光法检测环境空气、肉类食品及流质牛奶饮品的微生物的 具体方法进行摸索，并与传统的平板计数法进行比较，相关性可达到0 9 5 ，从 而为该方法的实际应用奠定了基础。 关键词：a t p 一生物发光法；a t p 提取荆；季铵虢类阳离子表面活性剂；虫萤光素 一萤光素酶 华东师范大学硕仁学位论文摘要 a t p - b i o l u m i n e s c e n c em e t h o da l l o w e dt h e r a p i dq u a n t i f i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m sb ym e a s u r i n gt h e i ri n t r a c e l l u l a ra t p i nt h ef i r e f l yl u c i f e r i n - l u c i f e r a s e b lr e a c t i o n t h eb i o c h e m i s t r yo ft h eb i o l u m i n e s c e n tr e a c t i o nw a sf i r s td e s c r i b e di n t h el a t e 1 9 4 0 s ，a n d i t su s ei nt h ed e t e r m i n a t i o no fa t pc o n t e n t u s i n g t h e l u c i f e r i n - l u c i f e r a s es y s t e mw a sf i r s td e s c r i b e di n1 9 4 9 s i n c et h e ni td e v e l o p e dt oa v e r y a c c u r a t em e a n so fm e a s u r i n gl e v e l so fa t p h a c c pw a si n t e r n a t i o n a l l y r e c o g n i z e d ，w h i c hd e m a n d e dh i g h e rs t a n d a r d so fm e t h o dt od e t e c tm i c r o o r g a n s i m i t w a sn e c e s s a r yt oc h o o s ea na t pe x t r a c t o rw i t hh j i g he f f i c i e n c yt oi m p r o v et h eb l s e n s i t i v i t y t h i sp a p e rc o n c e r n e dw i t hs e v e r a lf a c t o r so na t pe x t r a c t o ri n c l u d i n g ：t h e s e l e c t i o no fa l l 册e x t r a c t o ra n da t pe x t r a c t i n gm e a s u r e m e n t ；t h eo p t i m i z a t i o no f f a c t o r sf o ra t pe x t r a c t i o n ；t h ep r e l i m i n a r ys t u d yo nt h em e c h a n i s mo fb a bo n b a c t e r i a ；t h ec o m p a r i s o no fa t p b i o l u m i n e s c e n c em e a s u r e m e n ta n dp l a t ec o l o n y c o u n t i n gi nd e t e c t i n gt h em i c r o o r g a n i s m si nt h ea i r , c o o k e db e e fa n dm i l k 1 1 l ec o n c e n t r a t i o no fa n dt h ee x t r a c t i n gt i m eo ft h eq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l t c a t i o ns u r f a c t a n ta sa t pe x t r a c t o rw e r ee s t a b l i s h e d ；s o m ei m p o r t a n tc o m p o u n d i n g f a c t o r sf o ri m p r o v i n gt h eb li n t e n s i t yw e r ea l s os t u d i e da n do p t i m i z e ds u c ha s h e a t i n g , m i c r o w a v e ，a c i da n da l k a l is o l u t i o n ，c u z + ，p h m ga n dt h ei n g r e d i e n t si nt h e b u f f e rs o l u t i o n t h eb a c t e r i a lc e l l sw e r eo b s e r v e du n d e rt h et r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e a n dt h el e a k a g eo fb a c t e r i aw a sd e t e c t e db yu l t r a v i o l e tr a ya t2 6 0 h ma f t e rb a c t e r i a e x p o s u r i n gt ob a b t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em e c h a n i s mo fe f f e c to fb a bo n e c o l ia n ds a u r e u sw a sm a i n l yd e s t r u c t i o no fp e r m e a b i l i t yb a r r i e ro ft h eb a c t e r i a l c e l l s t h ec o m p a r i s o no fb a ba n dt h et w oo t h e rs a l e da t pe x t r a c t o r sb yh p l c s h o w e dt h a tt h eq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l tc a t i o ns u r f a c t a n tw a sc r e a t i v ea sa t p e x t r a c t o r t h ep r o c e s st od e t e r m i n et h eb a c t e r i ai ne n v i r o n m e n t a la i r , m e a ta n dm i l kr a p i d l y u s i n ga t p b i o l u m i n e s c e n c em e t h o dw a si n v e s t i g a t e da n dc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a l p l a t ec o l o n yc o u n t i n gm e t h o d n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e s et w om e t h o d s k e yw o r d s ：a t p b i o l u m i n e s c e n c e ；a t pc x t r a c t o r ；q u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l tc a t i o n s u r f a c t a n t ；i u c i f e r i n - l u c i f e r a s e 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名：4 鸟盘2 日期：迎：! 丝 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：俑形 日期：逊：6 ：! 垡 导师签名：南少峦 日期： 趔孵 华东师范大学硕上学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 a t p 生物发光法研究概述 1 1a t p 生物发光法发展概况 生物发光计数法是一种经过简化的生物化学方法，利用a t p 与虫荧光素一荧光 素酶( l u c i f e r i n l u c i f e r a s e ) 复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷( a t p ) ( 见 图i - i ) 。荧光素酶在镁离子存在的条件下，与还原荧光素和a t p 结合形成荧光素 酶一荧光素一单磷酸腺苷的复合物，该复合物与氧结合时发出荧光： l u c i f e r a s e a _ r p + l u c i f e r i n + 0 2 _ 一一o x y l u c i f e r i n + a m p + p p i 十c 0 2 + l i g h t ( 5 6 5 n m ) 实质上，虫荧光素酶促进的生物发光反应，使用了a t p 分子内的化学能，激 发了荧光素氧化脱羧作用，然后产生发光。该反应的详细机制己由o e l u c a 和 m c e l r o y 进行了综合的评述【1 1 。萤火虫荧光素酶几乎唯以a t p 为特异的底物【2 1 ，来 自自然界其它核苷的影响可被忽略。反应的最佳条件是p h 7 7 5 ，2 0 2 2 。当固 定发光试剂于饱和量下，每一a t p 分子能释放出一光子，因此光子的数量与a t p 含 量成正比。发出的光及a t p 含量可使用相对发光强度( r l u s ) 来衡量，这些单位 均可直接使用，而不必计算具体的a t p 量或菌落形成单位( c f u s ) 。光子的数量可 采用a t p 荧光仪进行测量，该仪器通常包括一个光电倍增管及增幅器，与其相连 的记录仪，或是支流图表记录，或是脉冲波记录，这取决于该测量仪是由直流电 模式操作，还是光子计数模式。大量市售光测量仪和成像系统已可以对微弱发光 量的反应进行检测i ”】，反应的结果在数分钟内即可获得，a t p 荧光仪最快能在1 5 秒钟内测定食品中是否存在酵母菌、霉菌或细菌细胞，灵敏度可达1 个微生物 2 0 0 m l 6 1 。 。 x 。n 弋，大彭。嵌! 一士一h 。， i i h 图卜1 ：a t p 结构式 f i g l 一1 ：t h es t r u c t u r eo fa t p 萤火虫中这一反应最初存2 0 世纪4 0 年代未期破发现门，应用荧光索一荧_ ) 匕索 华东师范大学硕 学位论文 第一章文献综述 酶体系检测a t p 含量最初在1 9 4 9 年被阐述1 8 1 ，自那时起，已逐渐成为一个精确 测量a t p 水平的方法，可以达到对观察对象的实时监控。由于a t p 普遍存在于 包括微生物在内的一切活细胞内，且每种微生物细胞中的a t p 含量是恒定的， 所以样品中a t p 含量与样品中微生物的数量有关，从而使得a t p 的存在成为检 测样品中有无微生物及其数量的极佳依据。a t p 生物发光法被广泛地应用在各领 域中，快速检测宇宙空间水系统中微生物量是该技术较早应用的领域之_ 1 9 1 。奶 制品工业也迅速采用了这一新技术【1 0 l ：从评估奶制品工厂的卫生状况到预估牛奶 及其它奶制品的上市时间，均采用了该技术。作为卫生方面的检测器，a t p 生物 发光法在食品工业中的应用己为很多学者研究调查过1 1 1 2 1 。除此之外，该技术 还可广泛用于检测样品中的微生物量，样品可以是作为初培养物的微生物细胞， 也可以是被激活的污泥，或是发酵流体i ”i 。 1 2a t p 生物发光技术 该技术包括以下步骤：擦拭环境表面以取得样品、样品a t p 萃取、添加荧光 素和荧光素酶混合物、测定生物发光量、求出a t p 浓度和活菌数。通常，细菌表层 有细胞膜和细胞壁包裹，故样品未经处理是不能测定a t p 的。测定时需先将样品 与微生物用的a t p 提取试剂混合，使细胞膜和细胞壁松弛，提取出a t p ，a t p 提取 试剂由多种成分构成，目前其中较常用的是以表面活性剂为基质的专用试剂；然 后，再与荧光素和荧光素酶生物发光试剂作用，用荧光仪测定a t p 与发光试剂反应 的生物发光量。 不少公司已创造了各式系统，主要分为以下三类【1 4 l ：基于试管的，基于笔式 探头的，基于擦拭的系统。尽管基本原则相同，但确切操作仍各有变化。基于试 管的系统操作如下：擦拭待测表面，浸于某种稀释液中以获得样品中的各种形式 的a t p ，吸取整数量的样品加入试管，并加入必要的反应物，再由光测量仪测量 反应发光强度。而笔式探头系统的过程如下：擦拭待测表面，笔式探头伸入液体 样品中，并加足量体积入反应杯中，产物随之产生，将该探头插入测量仪中即可 获得读数。而基于擦拭的系统，其过程如下：擦拭样品并将拭子置于特定容器中， 该容器中还有a t p 释放剂和必要的反应物，这些试制混合后再将拭子直接置于 测量仪的测量室中，清洁度的测量可直接从拭子的反应结果中获得。在某些该类 型的系统中，拭子在测量i j 须先蘸取参与反应的试剂。现在市面上有很多自成体 系的测量系统，值得注意的是，不同测量仪得到的相对发光强度的读数不具有可 比性，除非我们通过标准a t p 曲线将相对发光强度值转换成a t p 的含量进行比 较。 2 华东师范犬学硕e 学位论文第章文献综述 糕黔椿= l 不确定 - j 检验结果不合格 1 3a t p 生物发光系统的应用 a t p 生物发光法的应用范围十分广泛。美国f d a 己认可使用a t p 检测系统和试 剂盒用于牛奶细菌数的快速检测【1 5 l 。2 0 0 1 年召开的首届中美食品安全及其全程控 制研讨会暨微生物快速自动检测技术培训班也将a t p 快速检测技术作为培训内容 之一。目前，a t p 生物发光技术已在更多领域具有广泛的应用，主要分为以下几 个方面： ( 1 ) 荧光素酶检测：萤火虫荧光素酶基因( 1 u c ) 是一个可以用在真核生物和原 核生物表达体系的绝佳报告基因，研究基因的转录和表达，它发射出来的光持续 稳定，并可以达到最大化，光强度与荧光素酶成函数关系。该方法的特点是无任 何背景噪音，简单快速，灵敏度高，且发光稳定，可适用于手动或全自动和高通 ( 2 ) 生理途径和酶的检测分析：所有a t p 产生或降解的酶反应或与此相关的生理 途径都可以用萤火虫荧光素酶体系来进行检测。可以通过终点法或动力学分析来 测试分析物，且通过测试反应产生出来的光强度能够持续检测a t p 水平。可以应 用在氧化磷酸化过程，如诊断先天的代谢疾病；三酰甘油中的脂降解，如用于肥 胖的研究；p p i 分析，如d n a r n a 聚合酶活性分析；肌苷酸激酶同功酶活性分析， 如诊断急性心血管梗塞；a t p a d p a m p 比率分析，如细胞凋亡研究；a t p 磷酸计 ( 3 ) 快速细胞计数：a t p 存在于所有的活细胞中，可以用于生物物质的预测，通 过不同的处理可以分辨来自不同细胞类型的a t p 。 ( 4 ) 细胞增殖和细胞毒理：细胞活力的促进或抑制可以通过在细胞培养中a t p 水平的变化来获得，定量分析细胞对外来物质的反应可以通过测试在外来物质之 前和之后的a t p 含量变化而获得。其特点是快速，高灵敏，可高通量进行，适合 于大规模药物筛选。 ( 5 ) 卫生学检测：所有的活细胞都有a t p 存在，萤火虫荧光素酶反应中产生的光 强度与样品中的生物污染所含有的a t p 成正比，应用在个人卫生学检测，如护士、 外科医生；医院、老人的监护和临床中的接触表面；液体表面；工业食品生产工 食品生产环境的清洁度检测是h a c c p 的蓖要内容。以往食品生产环境的清洁 度管理大郜采用棉拭墩枪测微，卜物的方法，以表所附着微， 物硅为指标，微7 卜物 华东师范大学硕上学位论文第一章文献综述 检验多采用平板培养法，一般当日不能出结果，因而不能满足h a c c p 管理系统的要 求。因为食品残渣是食品生产环境主要的污染物质，因而可作为评价食品生产环 境清洁度的指标：同时，由于各种食品中均含有a t p ，而且a t p 耐热性较强，在食品 加工和烹饪时的加热条件下，食物原料中仍将含有一定量a t p ，因而以a t p 为指标， 采用a t p 生物发光法，可迅速、灵敏地检测食品生产环境的清洁度。换言之，a t p 生物发光法既可检测微生物，又可检测食品生产环境中的食品残渣。这种方法十 分适合h a c c p 系统的清洁度检测。例如，用a t p 生物发光法可迅速地检测食品生产 线及菜板、菜刀、厨房、食品操作台等处的清洁度。目前，国外已将这种方法广 泛应用于h a c c p 系统。 近年来，这种方法已在食品工业许多领域被采用。例如，酸奶制造过程中用平 板菌数计数法测定发酵过程中乳酸菌数往往要滞后，而影响生产管理。研究表明， 乳酸菌数和a t p 浓度随酸奶发酵时间增加而同步增加，两者成高度正相关( 相关系 数0 9 7 4 ) ，即用a t p 生物发光法可快速检测乳酸菌数，而便于酸奶生产的管理。此 外，这种方法还可用于肉及肉制品杂菌污染的测定、啤酒酵母的活性测定、评价 奶品厂卫生状况、估测牛奶及奶制品的保鲜期、粉状食品和调味品的细菌学测定 等。如进一步提高其灵敏度， t p 生物发光法可望发展为方便、快速、经济的微生 物检测方法，在食品工业上将展示出广泛的应用前景1 1 6 】( 表1 1 ) 。 表1 1 ：a t p 生物发光法在食品工业的应用范围 t a m e l l ：t h ea p p l i c a t i o n so f a t p - b i o l u m j n e ”e n c ei nr o o d - | n d u s t r y 检测项目 原料 生产过程及设备的检测 产品的检测 检测内容 食品原料的微生物检测 用棉拭法进行生产环境的卫生学检测 酒类制作过程中的微生物浓度检测 酸奶制作过程中的微生物检测 清洗罐及食品器具的水质卫生学检测 食品生产线的卫生学检铡 酵母菌、乳酸菌等菌种的发酵活性检查 酒类产品中残留微生物的检测 饮料、矿泉水、天然水的微生物检测 酱油、汤汁、酸奶等液体食品的微生物检测 肉类、水产品、蔬菜等食品的微生物检测 a t p 生物发光技术的适宜性应在各种试验中得到验证，如从特定的生产环境 中的各器械表【酊获得样品进行检测，并辅以一定的1 j 生学榆测【1 4 j 。十分有必要将 a t p 生物发光法应用剑卫，卜枪测中，建立一套a t p 浓度标准以作为清洁足甭有 效的指标。这就需要在各种特定的7 l 产 厂中确定a t p 水平的最低，最岛丰，j i 准。 4 华东师范大学硕t 学位论文第一章文献综述 a t p 较低的水平出现在清洁与消毒灭菌后，而较高的水平出现在清洁之前。结果 应从数周时间里不同地方收集的样品获得，以确保结果能真实有效地反映出a t p 的含量并作为卫生能否达标的标准。在这期间，关键控制点，如清洁剂的浓度， 接触时间及溶解的温度均应受到详细控制以确保卫生状况达到最佳。采样点既应 包括在h a c c p 过程中处于关键控制点的仪器设备，也应随机在环境中抽检。由 于仪器表面性质的不同，可能使用不锈钢，也可能使用聚丙烯材料，另外使用的 清洁或消毒剂的化学成分也会有所不同，因此，在已清洁的表面其a t p 的水平 会有所变化。所以在制定a t p 评判标准时，这些对a t p 水平造成影响的背景因 素应考虑进去。 要选择一个系统还要考虑其它很多因素，一个重要因素就是待分析样品的数 量，这决定了我们是使用单管的便携式测量仪，还是实验室内使用的处理多个测 量样品的测量仪。系统能否保存数据并将其转换的能力也是很重要的，特别是在 检测结果趋势的分析中。其它需要考虑的重要因素还有，仪器设备的成本，所需 的技术支持的水平。各种不同的系统在便携性及操作的简易性上也是有所不同 的，因此我们还要考虑到该系统的终端使用者的水平，他们是否为专业技术人员， 是基于实验室工作的人员，还是基于工厂工作的人员。 1 4a t p 生物发光技术的优势与劣势 微生物检验是食品制造及流通过程中的卫生学检验和质量管理的重要项目， 评价一个卫生项目是否有效，可以用以下几种方法：肉眼检测，棉拭法及微生物 的分析，相关联的平板计数或a t p 生物发光法。检测食品中及食品生产环境的 微生物传统方法费时费力，其方法自上世纪以来基本未改变。传统意义上说，检 测清洁度的方法总是集中在直接的肉眼评估或紧接着的琼脂平板方法，即使用棉 签擦拭生产环境表面以采集样品，再使用选择性或非选择性琼脂平板培养来评估 食品中微生物方面的污染，对总菌落的计数可能须在2 4 4 8 小时之后，而如果要 检测或评估某一特定微生物的存在( 如酵母，霉菌或沙门氏菌) 需要4 7 天时间， 检验结果往往滞后。许多食品在生产当天就必须出售，因此急需有即时性的细菌 学检验方法。换句话说，如果产品生产出来，却要一直等到微生物检测结果合格 方可销售，就需要多支出一笔昂贵的储存费用【”l 。且必须指出的是，只有那些恶 劣卫生环境中的微生物可被检测到，而肉眼不可见的产品残余物是否存在就不可 检测了，而且结果也不能迅速有效地避免已污染的环境被再次使用。 a t p 生物发光法能检测微生物也能检测食品产品的残余物。检测结果迅速产 生以使我们能在清洁度不达标时及时采取补救措施。该方法是一个具有积极性的 操作系统，生产设备需掘此方法检测得到结果合格后方能继续使用，同时还叮以 作为验证产品中存在微7 卜物污染的工具。样品表由n 青沽度的及时确认对f 促进清 5 华东师范大学硕十学位论文 第一章文献综述 洁品的更多使用有着积极作用。总体来说，该方法简单易行，对实验条件的要求 也不高。 早在2 0 世纪7 0 年代h b a u m a n 就曾建议对保证食品的微生物安全性方面进 行彻底全面的改变【1 8 】，他提倡一种预先控制策略，不再依赖事后分析检查。 b a u m a n 介绍了食品生产的危害分析与关键控制点，即h a c c p 这一概念。h a c c p 概念包括了分辨出特定危害点及对它们预防的必要措施，危害点的界定包括了生 物学的，化学的及物理学的污染【1 9 1 。这一方法着重于预防并贯穿在食品链的每一 环节中，自食品的生产直至终端消费者【刎。h a c c p 已为国际社会普遍认可，并 作为系统方法中的一项工具，同时可与整体质量管理体系或i s 0 9 0 0 0 质量体系结 合使用。近年来，国外普遍实行h a c c p ( 食品生产的危害分析与关键控制点) 制度，更加迫切需要在食品制造过程中能快速，简便检测食品生产环境的清洁度 的方法。食品生产环境的清洁度检测是h a c c p 的重要内容，以往的管理大都采 用棉拭取检微生物的方法，以表面附着微生物量为指标，同样在当日不能出结果， 因而不能满足h a c c p 管理系统的要求。由于食品残渣是食品生产环境主要的污 染物质因而可以作为评价食品生产环境清洁度的指标；同时食品中均含有a t p ， 而且a t p 耐热性较强，在食品加热和烹饪时的加热条件下，食物原料中仍将含 有一定量的a t p ，因而以a t p 为指标，可迅速，灵敏地检测食品生产环境的清 洁度。a t p 生物发光法可以作为一种简便快速的微生物检验方法和食品生产环境 清洁度的检测方法满足以上的需求。 表1 - 2 ：a t p 生物发光法的特点 t a b l e l - 2 ：t h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f a t p b i o l u m i n e s c e n c e 优点缺点 可作即时性测定有时灵敏度达不剑要求 测定范围广受游离a t p 和体细胞干扰 可自动化操作受盐等成分干扰 操作简便、快速不能作细菌鉴定 可做活性测定 a t p 生物发光法存在的首要问题是灵敏度有时达不到卫生学要求。从灵敏度 角度讲，a t p 生物发光法要求样品中细菌浓度最低不少于1 0 0 0 个m l ，但这种灵敏 度有时达不到卫生学要求。另外，在食品细菌学检验时，还可能存在非细菌性a t p 和其他成分干扰的问题，主要足食品中所含动物和植物的体细胞游离出的a t p 可 使测定值偏高。食物中含有的盐分等成分对a t p 测定也有干扰。为了提高灵敏度， 可采用过滤法和前培养法并用的方法。过滤法的步骤大体如下：采用0 4 5 “m 的滤 膜过滤样品，细菌颗粒和0 4 矾1 1 1 的嘲体粒子将保尉在滤膜上。过滤的样品越多， 6 华东师范大学硕：t 学位论文 第一章文献综述 滤膜上的细菌就越多，即可达到浓缩细菌的效果，提高灵敏度。过滤法不仅对酒 类、饮料、酱油、饮用水等含固体成分少的样品有较好的浓缩细菌的效果，对其 它样品，也可达到去除干扰物质和游离a t p 的目的。当样品中含有动物或植物的体 细胞时，体细胞也可能保留在滤膜上，因此需添加只作用于体细胞的a t p 提取试剂， 使体细胞中的a t p 被释放出来，然后再清洗滤膜，将非细菌性a t p 及其他干扰物质 清洗掉。以去除干扰因素。另外，当游离a t p 浓度比细菌细胞内a t p 浓度高出许多时， 可用三磷酸腺苷双磷酸酶进行处理，使游离a t p 分解。对于含固体成分多且活菌数 较少的样品，采用过滤法也很难进行a t p 生物发光法测定。此时需进行短时间的前 培养，使细菌增殖到可进行a t p 测定的程度。例如，测定调味剂样品时，可先用灭菌 的大豆、肉汤制做的培养基在3 5 培养4 6 d 时，然后进行a t p 浓度测定。 另一方面，a t p 生物发光法不能简便地表示出病原菌是否存在，而只能给出 样品表面总体a t p 水平，且受到仪器自身对光强灵敏度的限制，方法检测微生 物的范围也受到限制。与此同时，清洁剂等其它一些化学品的存在也很可能干扰 正常的生物发光反应。还有，相对于传统的培养技术所需的廉价材料，该方法所 需的试剂较昂贵。这种需要高技术含量，昂贵仪器的方法，小规模的食品生厂商 是负担不起的。另一个使得该方法不能为普遍接受的障碍是该方法的测试结果不 是以传统的形式出现的【2 l j ，而是以相对发光强度等这样的形式出现，甚至用红， 黄，绿这样的信号表示结果通过卫生标准与否，这一概念是很多习惯于计算菌落 数而进行评判的微生物学工作者难以接受的。 1 5a t p 生物发光法最新进展 尽管目前存在的a t p 生物发光法可以满足约9 0 的食品工业的要求，但在 某些情况下需要检测到低量的细菌，因为细菌的低水平不一定表明该产品安全合 格，最近就有一对改进的方法，以满足这个需求。 一种使用酶促扩大低水平a t p 的a t p 循环系统已由英国伯明翰大学研究出 来【2 2 1 。该扩大系统包括荧光素，荧光素酶，磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) ，腺苷一 磷酸( a m p ) ，肌激酶，丙酮酸激酶，这一系统可有效地使所有a m p “扩大”转 化成a t p 。这一系统能够检测到浓度低至2 6 p r o 的a t p 。不同寻常的是，这一系 统不能使用最大发光输出来确定清洁度，而这是a t p 生物发光系统使用最常见 的。相应地，它是用达到最大发光输出一半时的时问( t 1 2 ) 表示的，这可与i o g l a t p l 相关联，并被用束确定清洁度。通过巧妙处理该系统中各因子，此反应可用以适 应各种不同需要。该系统中灵敏度的提高是通过反应物的设计与巧妙处理达到 的，而不是通过复杂的测量仪系统。一个使用腺苷酸激酶的扩大体系也由英困的 化学与牛物防御部研究出来。次方法使用本来就存在于各种细菌中的胞内酶腺纾 酸激晦，将酶底物腺许二磷酸( a d p ) 转换成a t p ，而a t p 由于荧光索，荧光 7 华东师范大学顾 学位论文第一章文献综述 素酶的存在而释放出光1 2 3 l 。这一系统也能够检测到低浓度水平的a t p ，确定存 在的细菌数量。与此同时，t e t s u y a ( 2 0 0 3 ) 等也研究了一种比传统的h t p 生物发 光法敏感约i 0 0 0 0 倍的发光法【州，可以检测到低至一个菌落形成单位( c f u ) 的 大肠杆菌。该方法与上述方法原理基本相同，通过腺苷酸激酶( a d k ) 将生物体 内1 分子a m p 与1 分子a t p 转化为2 分子a d p ，多聚磷酸激酶( p p k ) 再将a d p 重新转化为a t p ，这将达到扩大a t p 的效果，而高度纯化的p p k a d k 融合蛋白 可以有效地确保这一效果的实现。 图1 - 3 ：a t p 扩大系统 f i g l - 3 ：t h e a t pa m p l i f i c a t i o ns y s t e m 英国防务科技实验室( d s t l ) 发明了一种对食品污染微生物的快速检测新 方法【矧，其特点是检测速度特快、检测面宽、结果可靠。该方法能在8 小时内检 测出食品污染菌，许多污染菌的检出时间甚至不到一个小时。其设计原理与以上 研究类似，是基于改进的a t p 生物荧光技术，利用生物代谢中的腺苷酸激酶( a k ) 而发展形成的，能检测沙门氏菌、里斯特菌、大肠杆菌0 1 5 7 及其它的一些食品 污染微生物。利用该方法能在一个工作日内检测出低水平的e c o l i 0 1 5 7 。 尽管前面已指出a t p 生物发光法不能检测特定的微生物，现在有一种使用基 因工程改造的噬菌体的方法有望弥补这缺陷。噬菌体是一种感染特定细菌的病 毒，一些噬菌体具有特异性，只能感染一种特定的细菌。有显示表明我们可以将 编码细菌荧光素酶的基因转入噬菌体，当其感染特定宿乇时，宿主就能够产生酶 并发光，这表明快速检测特定的微生物足完全有可能的【圳。s h u i t u 等( 2 0 0 0 ) 将免疫磁性捕捉技术与a t p 荧光素荧光素酶技术结合测定特异的大肠杆菌 0 1 5 7 ：h 7 ，细菌被特定的免疫磁珠捕捉后在a t p 提取剂的作用下释放细胞内 a t p ，由a t p 生物发光法测定a t p 含量1 2 7 1 。 另外，t o m h i h i r o 等( 2 0 0 0 ) 也研究了将a t p 生物发光法结合荧光染色显微 技术束确定微，物的数髓和种类1 2 8 l 。这种新的方法将微7 卜物固定任一层多聚碳酸 8 华东师范欠学硕士学位论文第一章文献综述 盐滤膜上，将快速显微探测技术( r m d s ) 得到的像点信息与荧光显微镜的样品 台的检测结果相对应，能够检测到1 个酵母细胞或1 个含2 0 - 3 0 乳酸菌细胞的菌 落。 除了以上两方面对a t p 生物发光法改进外，n h a t t o r i 等( 2 0 0 2 ) 成功分离 了一种对苯扎氯铵有抗性的新型荧光素酶( l i l - 2 1 7 l 4 9 0 k ) 1 2 9 1 ，它有两处突变 ( a l a 2 1 7 l e u ，g l u 4 9 0 l y s ) 。这种突变酶较商业上常用的热突变荧光素酶l c r u c i a t a 和p h o t i n u sp y r a l 缸对苯扎氯铵更具有抗性，它可以使应用在a t p 生物发光法中 的苯扎氯铵浓度增大，既能提高细胞内a t p 的提取率，也能有效地抑制去a t p 酶。 2 a t p 生物发光法中a t p 提取方法的研究进展 2 1 传统的a t p 提取方法 国内在a t p 生物发光法这方面的研究报导较少，更没有广泛地实际应用【3 0 l ，其 主要原因在于对这一技术的具体方法缺乏研究，在应用中用了不恰当的提取剂和 不合适的微生物a t p 提取方法【3 1 i ，致使测量结果不理想，从而放弃使用这一技术进 行微生物快速检测分析。 目前已在各类文献中有所报道的微生物a t p 提取方法有很多，主要包括加 热、超声、酸、表面活性剂及其它一些有机溶剂等提取方法f 3 2 埘。通过对超声、 加热超声、加热、三氯醋酸( t c a ) 、氯仿等五种提取方法进行的比较【3 4 1 ，超声 加热方法最佳，加热次之。这两种方法对微生物a t p 分析抑制较小，提取率商，但需 副加设备，操作繁琐，难于推广。超声方法的提取效果尚可，但不能使降解微生物 体夕f a t p 的三磷酸腺苷双磷酸酶( a p y r a s e ) p 5 咬性，故会水解微生物a t p ，从而使 分析的细菌a t p 水平较实际水平大为降低。氯仿的提取效率较低，且不使a p y r a s e 变性而水解细菌a t p 。t c a 对细菌a t p 有较高的提取效率，且能很快使a p y r a s e 变 性，价格低廉，易于得到，不需副加设备，但为了降低t c a 对萤光素酶的抑制，需对 t c a 进行适当的稀释才可得到较为满意的结果，目前所知的大多数a t p 提取剂均 对萤光素酶活性有一定的抑制l s l ，必须进行稀释这步骤，这也是导致a t p 生 物发光法灵敏度降低的一个原因1 3 9 l 。 对于不同的细胞需选择不同类型的a t p 提取剂【柏1 ，如t c a 适用于提取微生物 a t p ( 如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌) 和体细胞，而t r i t o n x - 1 0 0 仅适用于提取体细 胞a t p ，如全血细胞、红血细胞、有粒细胞。 2 2 季铵盐类阳离子表面活性剂结构及分类 以上方法虽然提取效率较高，但存在操作不便，不利于广泛应用的缺点，在 实际应用中逐渐以阳离子表面活性剂，特别是季铵盐类阳离子表面活性剂如苯扎 氯铵( b a c ) 4 1j 、苯扎溴铵( b a b ) 作为a t p 提取剂的星要成分，b a c 已被证明在 华东师范大学硕 学位论文第一章文献综述 提取a t p 的效果上同t c a 一样有，效1 4 2 州】。 1 9 1 5 年j o c o b s 首次合成季铵盐类表面活性剂，并指出这种化合物有一定的杀 菌作用。1 9 3 5 年d o m a g k 进一步研究了其杀菌作用及其化学结构的关系，后来 w e t z e l 进行了临床消毒试验后，逐步引起了重视1 4 5 l 。我国在1 9 6 4 年研究了一种季 铵盐类化合物一苯扎溴铵( 新洁尔灭) 的杀菌作用，1 9 7 1 年总后药检所进行了进 一步研究，并推荐作为消毒剂使用l 。季铵盐类阳离子表面活性剂有单链季铵盐 和双链季铵盐两类，前者以苯扎溴铵为代表，临床上使用的还有度米芬( 十二烷 基二甲基苯氧基溴化铵) 和消毒净( 十四烷基= 甲基吡啶溴化铵) ，它们均属于 低效消毒剂，仅能杀灭般繁殖体和亲脂病毒。后者为双链季铵盐，以百毒杀( 双 十烷基二甲基氯化铵) 为代表，可以杀灭各种微生物，包括细菌芽胞，属于商效 消毒剂1 4 5 “”。近年来，在美国药典和一些专著中，又有一些新季铵盐类消毒剂 出现，对它们的杀菌作用和使用价值，有待进一步评价l 搏5 0 1 。季铵盐类阳离子表 面活性荆的消毒作用受到多种因素的影响，如拮抗物1 4 7 船l 、酸碱度 4 7 4 8 5 、温 度及其它有机物1 4 5 4 75 2 1 。为了克服微生物对季铵盐阳离子表面活性剂易产生抗 药性等一些问题，研究单、双链季铵赫联合应用的同时，也在研究其他物理及化 学因素对季铵盐阳离子表面活性剂的增效或协同作用1 5 3 l 。 苯扎溴铵( b a b ) 主要成分为溴化二甲基苄基烃铵，按无水物计算，含烃铵 盐以c 。h * b r n 计。在常温下为黄色胶体，低温时能逐渐形成蜡状固体，振摇时产 生大量泡沫，易溶于水或乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚或苯。耐热，可贮存较 长时间而效果不减，性状稳定。它为阳离子型表面活性剂类广谱低效杀菌消毒剂 i ，能改变细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起杀灭作用， 对革兰阳性细菌作用较强，对绿脓杆菌、抗酸杆菌和细菌芽孢无效，能与蛋白迅 速结合。虽然苯扎溴铵具有神经毒性，但较苯扎氯铵( b a c ) 的使用却更广泛。 有一点值得注意的是，苯扎氯铵在报道文献中多为氯化二甲基苄基烃铵的混合 物，区别仅在于烷基链长度( c 8 c 1 8 ) ，而苯扎溴铵是十二烷基二甲基溴化铵【4 7 1 。 2 3 季铵盐类阳离子表面活性剂协同作用 要达到提高生物发光反应的灵敏度的目的，可以从两个方面考虑：一方面提 高作为a t p 提取剂的季铵忿阳离子表面活性剂杀菌效果，以实现最大程度地提取 细菌体内a t p ；另一方面应减少因a t p 提取剂的存在而产生对萤光素酶活性的抑 制。 为了克服微生物对季铵盐阳离子表面活性剂易产生抗药性等一些问题，研究 单、双链季铵赫联合应用的同时，也在研究其他物理及化学因素对季铵豁阳离子 表向活性刺的增效或协同作用。研究者在研究了一些理化因子和苯扎溴铵的协同 杀芽胞作用时f 5 s5 “，发现热【5 75 剐、微波1 5 0 4 s l l 、甲醛l “i 、远红外【6 3 l ，铜离子l 、 1 0 华东师范大学硕t 学位论文 第一章文献综述 戊二醛【舒蚓、氢氧化钠等对苯扎溴铵有增效作用，在它们的共同作用下，杀灭 枯草杆菌黑色变种芽胞的作用明显加强，而紫外线、乙醇、氯己定和盐酸等f i 6 7 - m l 也有报道可增强苯扎溴铵的杀菌作用，但无明显增效。另外，一些季铵盐复方消 毒剂的配方也在研究之中，如季铵盐消毒剂对醛类消毒剂有明显增效作用，而且 可以减少醛的气味以及降低醛的腐蚀性【6 2 j ；季铵盐可以作为碘伏的载体，这种碘 伏的杀菌作用明显加强，用于皮肤粘膜和表面消毒【7 1 】；季铵盐和酚类化合物，以 及一些麻醉剂在高温条件下有协同杀芽胞作用【7 2 1 ；由单链季铵盐十六烷基苄基氢 化铵和双链季铵盐双癸基苄基氯化铵组成的复方季铵盐消毒剂的杀菌作用较两 种季铵盐单独使用的效果好【7 3 l ；新洁尔灭等对洗必泰有协同杀灭金黄葡萄球菌和 大肠杆菌的作用1 7 4 j 。 p h m g 和p i g a b 均为阳离子型杀菌剂，二者结构类似，其中p h m g 又可分为 p h m g i ( 磷酸聚六亚甲基胍) 和p h m g i i ( 盐酸聚六亚甲基胍) ，均具有广谱 杀菌作用，p i i m b 的结构式见图卜4 ，其中