（生物化学与分子生物学专业论文）wrky家族调控植物抗逆信号途径分子机制的初步研究.pdf

摘要 摘要 w r k y 转录因子家族主要存在于高等植物中，其功能主要与植物的防御反应、 逆境应答、衰老信号和生长发育等密切相关。 o s w r k y 3 0 是水稻中的一个w r k y 转录因子，含有2 个w r k y 结构域，属 于w r k y 家族第1 组的成员。m g f p o s w r k y 3 0 融合蛋白在水稻细胞中定位于细 胞核中；0 s w r k y 3 0 在体外能与w b o x 结合，具有w r k y 转录因子的普遍特征； 在酵母细胞中，0 s w r k y 3 0 具有转录激活功能，通过不同长度的截短突变体的研 究确定0 s w r k y 3 0 的转录激活结构域在其n 端。根据上述几个实验结果，可以 确定o s w 砌( y 3 0 是转录因子，具有w r k y 家族转录因子的典型特征。 进一步研究了伪翮噬玎d 在a b a 和干旱诱导下的表达谱，发现伪眦k 乃d 受a b a 和干旱诱导，说明仍聊朋? o 参与了与趾认相关的干旱信号途径；获得 了仇蹄，尼k 乃0 的过表达转基因植株，通过对过表达转基因植株在干旱条件下的筛 选，发现伪阡账乃d 过表达株系比野生型有更强的耐旱能力。 伪翮聆d 同时还受s a 、j a 和病原菌等多种信号因子的诱导，从功能上提 示了与m a p k 可能的联系，植物m a p k 与防御反应，逆境应答等密切相关。同时， 通过分析o i w r k y 3 0 蛋白的结构发现o s w r k y 3 0 的n 端有1 个保守的结构域， 该结构域含有多个s p 位点( s e r i n e p m l i n es 沁) ，是潜在的m a p k 磷酸化位点。 通过酵母双杂交实验验证3 个m a p k 成员与o s w r k y 3 0 的相互作用，发现 o s m a p k 5 a 和o s w h “k l 与o s w r k y 3 0 存在相互作用，而0 s b w m k l 与 o s w 砌( y 3 0 没有相互作用。 通过o s w r k y 3 0 不同截短突变体与o 湖k 5 a 和o s w m k l 相互作用的 研究发现，o s w r k y 3 0 是通过s p 位点与m a p k 发生相互作用的，w r k y 结构域 在w r k y 转录因子与m a p k 相互作用过程中起了重要作用，当只含有o s w r k y 3 0 的n 端s p l - 6 或s p 2 5 的区域与o 舢k 5 a 能发生相互作用，但作用相当弱，而 在加上w r k y 结构域后，这种相互作用增强了很多。但o s w r k y 3 0 与两个m a p k 的相互作用过程中对w r k y 结构域的要求是不一样的：对o s m a p k 5 a 只需要1 个w r k y 结构域，而对o s w j u m k l 需要2 个w r k y 结构域都存在。通过荧光 互补实验，证明了o s w r k y 3 0 与0 s m a p k 5 a 在水稻细胞中存在相互作用，这是 首次从体内证明了w r k y 转录因子与m a p k 能相互作用。原核表达了o s m a p k 5 a 和o s w r k y 3 0 ( 1 6 1 8 a a 部分) ，体外磷酸化实验验证了o s w r k y 3 0 能被 o s m a p k 5 a 磷酸化。这样从不同方面验证了o s w r k y 3 0 是m a p k 的底物。 对o s w r k y 3 0 的n 端富含s p 位点的结构域在g e n g b 姐k 数据库中搜索，发 现了2 8 个w r k y 转录因子都含有此结构域，根据其中最保守的5 个连续的氨基 摘要 酸残基命名该结构域为s p t t g 结构域( s p t t gd o m a i l l ) 。从拟南芥和水稻转录因 子数据库中补充了4 个w r k y 转录因子，总共获得3 2 个w r k y 转录因子含有 s p l t g 结构域。这3 2 个w r k y 转录因子都属于w r k y 家族中最保守的第1 a 组。 进一步克隆了其中的7 个，分别是拟南芥中5 个、水稻中2 个，加上o s w r k y 3 0 一共是8 个。研究了这8 个w r k y 转录因子与m a p k 的相互作用。o s m a p k 5 a 与8 个w r k y 转录因子在酵母细胞中都能相互作用，通过p g a l 活性检测以及观 察在s d ，1 邗- l e u - h i s a d e 平板上生长情况，比较了o s m a p k 5 a 与8 个w r k y 转 录因子在酵母细胞中相互作用的强度，其中o s m a p k 5 a 与a t t k y 2 、 a t w i u ( y 2 0 、o s w r k y 3 0 、o s w r k y 5 3 和o s w r k y 8 0 相互作用较强，而与 a t w r k y 2 5 、a t w 砌( y 2 6 和a t 哏k y 3 3 作用较弱。o s w j ir m k l 与a t w r k y 2 、 a t w r k y 2 0 、o 娟，r k y 3 0 和0 s w r k y 8 0 相互作用较强，但与o s w 褂吖5 3 不作用， 与a t w r k y 2 5 、a t w 砌“2 6 和a t w r k y 3 3 作用较弱。克隆了o s m a p k 5 a 在拟南 芥中同源的m a p k ：a t m a p 硒。研究了a 删a p k 3 与8 个w r k y 转录因子在酵 母细胞中相互作用，结果与o s w j l ，m k l 相应的结果类似。上述实验结果证明了： 含有s p t t g 结构域的w r k y 转录因子与m a p k 存在相互作用。进一步在水稻细 胞内证明了0 s w r k y 8 0 与o s m a p k 5 a 存在相互作用。 最后，讨论了s p l l g 结构域在联系w r k y 家族与m a p k 家族中的重要意义， 含有s p t t g 结构域的w r k y 转录因子在抗逆信号途径上的重要作用。 关键词：w r k y ，转录因子，m a p k ，生物和非生物胁迫，相互作用，底物，s p l l g 结构域 中图分类号：q 9 4 6 1 i l a b s n 砌 a b s t r a c t 1 kw r k yp r o t e i i l sm a i n l yp r e s e n ti nh i g h e rp l 觚t s ，a n da r c 既t e i 、r ei n v o l v e di n d e 董萌r e s p 0 咀s i v e ，s t r e s ss i g i l a l ，s e i l e s c e n c e 觚ds o m ed e v e l o p m e mp r o c e s s c s o 娟n t k y 3 0i sam e m b e ro fw r k y 衄l s c r i 鲥o n 缸t o r 妇i l yi n r i c e i th 笛t w o w r k yd o 1 a i l l s 缸db e l o i l g st og m u pio fw r k y 缸i l i l y - g f pf i 戚o np f o t e i no f 0 s w r j ( y 3 0w 勰m a i n l ye x p r e 鹳e di l lt l l en u c l e 噼o f r i c cc e l l s ；o s w r k y 3 0p m t e i nc a n b i n dw 二b c xi nv i 们，w - b 0 医i sac o m m o nc i se l 锄e n tb i n d e db yw r k y 妇r a 】皓c r i p t i o n 缸t o r s ；i ny e a s tc e l l s ，o s 硼y 3 0h a d 衄l s c r i p t i 枷v 撕鸣m ea b i l i t yo f n 矗n s p t i o n 枷v a 虹o no fd i 丘b r e l l t 臼伽a t e dm m a n to fo s w r k y 3 0w a sa l s od e 屯e c t e d i y e a s tc d l s 髓d 吣r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i no fo s w r k y 3 0w 勰f o u n di ni 乜 n 咖i n a lr e g i o n t h e s er e s u l 乜i n d i c 砒l 站也a to s w r k y 3 0h a dt h et ”i c a lc h a r a c t e r s o f w r k y 托m s c r i o t i o nk t o r s 1 k e x p r e s s i o np r o f i l e so fo s w r k y 3 0u n d e ra b a t r e a t m e n ta n dd m u g h ts 仃鹳sw 讹 锄a l y 乃e db yr 一p c r 粕dr _ e a l t i m ep c i lt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fo s w r k y 3 0w e r e u 雌g u k l t e db ya b a t r e a n n e n t 粕dd r o l 蛳s 吮船，锄g g e s t i n g 也a to s w r k y 3 0 娜 i n v o l v e di na b a - r e l a t e dd r o u g h ts i g n a lp a t h w a yi nr i c e nw 髂a l f o u n d 血a t 洲【p f e s s i o n 仃a | 1 s g c n j cl m so fo s y 3 0h d m o r ed r o u g h tt o l e 砌c e 衄1w i l d t y p 龉山1 d e rd l 伽g h t s e s s n w 笛r 印o r c e dt l l a to s w r k y 3 0w 勰a l i n d u db ys a ，j at r e a n n e “c sa n dp a m o g e i l s i n 触，s u g g c s t i n gt l l e 矗m c t i o 玎 a lr e l a t i o n s l l i pv v i t hm 址 kw h i c hi sah n a 如i l i l y i n v o l v c di b i o t i ca i l da b i o t i cs i 辨a lp a m w a y s m e 柚w h i l e ，妇s b 仙o t u r eo f o s w r k y 3 0 w a s 锄础y z e da n dac o n s e r v e dd o m a i ni n c h j d i n 2s e v e r a it w dl i n k e da n i m oa c i d s ： s e 面e - p r o l i n c ( s ps i t c li i l1 1 1 en 劬n i n a lo fo s w r k y 3 0w 雒f o i l i l d s ps i t ei s c a n d i d a t ep h o s p h a t e ds i t eb ym a p k b yy e a s tt w o h y d 蹈s a y i tw 器f o i l n dt h a t o s m a p k 5 aw l l i c hi sam e l n b e ro fm a p ka 掣d u p 缸l do s w 删k 1w m c hi sa m 锄b c ro fm a p kd 掣o u pi m 麟t c dw i mo s w r k y 3 0 ，o s b w m k lw h i c hi sa l s oa m e m b e ro f m a p kdg r o u pd i dn o ti n t e r a c t 、v i t l lo s w r k y 3 0 i n t e m c t i o n sb 嘶v e e nd i 任白e n t 们n c a t c dv 盯s i o i l so f o s w r k y 3 0 锄dt 、v om a p k sw e r e l a b s t r a c l a 删v e d nw a sf b u n dt h to s w r k y 3 0i n t e 耐c d 、“t l lt w om a p k sb vi t ss ps i t c s w r k yd o m a i l lw 觚i m p ( 嚏t a mi nt l l ep r o c e s so fi m e m c t i o nb e 如，e e no s w r k y 3 0 柚d t w om a p 酗，t 】心西o n s 证c l u d i n gs p lt os p 6o rs p 2t os p 5c o u l di 1 1 ：t e m c tw i _ i h o s m a p k 5 a ，b u ts 慨g i hw 舔憎yp o o r w r k yd o m a i l lc o l l l ds t r e n g m e nt h e i n 蛔阻c t i o nb 帆e no s w r k y 3 0a i l do s m a p k 5 文t w ow r k yd o m a i l l s 、v e r e n c c e s s a r vw h e no s w r k y 3 0i f l t e f a c t e dw i t l lo s w 丁u m k l 血i sw 勰d i 丘b r e n t 如m o s m a p k 5 a b yb i f cv i s u a l i z a t i o 皿o s w r k y 3 0i 1 1 t e r a c t h l g 谢也o s m a p k 5 ai nr i c e c e u s 啪sc o n f i m l e d nw a st 1 1 ef i r s t 哪n1 l l a tw r k y 虹a n s c r i p d o nf 如雠i n t e r 翻c t e d w i 山m a p ki nv i v o o s w 砌( y 3 0w 鹤p h o s p h o r a t e db yo s m a p k 5 ai l lv m 趾lm e 糟s u bv e r i f i e do 州嗽y 3 0w 船a 册b s t r a t eo f m a p 艮 a 胁u s i n gt 地q u 即c eo fo s w r k y 3 0n t e r m i n a lc o n s e r v e dd o 玎1 a i ni n c l u d i gm i l m s ps i t e s t o b l a s t i l lg e n e b 姐k d a t a b a ，2 8 m e m b e r s o f w 砌( y p r o t e i i l s 砌c ha l s o h a v e 也i so o n s e r v e dd o m a i l lw e r em s c o v e r e d a c c o r d i n zf h ec o n d n u e d 硼n 劬a c i d sr e s i d u e s ， t b i sc o n s e r v e dd o m a i n 啪s m c d 笛s y 兀gd o m a i n 4m o 、r k yp r 砷：i n 3w h i c h i n c l i l d e ds p t t gd o m a i nw e r ef o u n da 舭rs e a r c h i n ga r a b i d o p s i sa n dr i c et r a n s c r i p t i o n 梳t o r sd a t 曲a s e ，s oa l lo f3 2m e 删b e r so fw r k yp r o t e i f l sw e f o u df m a l l y - 蛆lo f t h 锄b d o n g t o i ag r o 叩o f p l 姐t w r k y 胁l 坝w 量l i c h w 私龇m o 髓哪l s e e dg r o u p o f w r k y f a 砌v - 5m e m b e r si 1 1a r a b i d o d s i s 粕d2m e m b e 硌i nr i w l l i c hh a v es p 丌r gd c 嘎n a i nw e r e c l o n 。d 1 1 l ei m e r a c d o n sh 蛳v e e n 也e s cd r o t c i l l s 锄dt w om 【a - p k s ：o s 丛p k 5 a 锄d o s w _ h 舢1w e r e 粗a l y z c db yy e a s t 咖_ h y b 矾a s s a y s t h es 缸吼g i 王l so fi i l t e r a c t i o m b e t w 啪m e s ew r k yp r o t e i n s 姐dt w om a p bw 骶删l y z e db yd 咖鲥n g g a l a c t i 嘶缸dg r o 、v mi ns d - t r p l e u - h i 争a d cp l a t e t h es h n g m so f 面灯a 嘶o n s b e t w 蝴o s m a p k 5 a 趾da t w r k y 2 a t w r k y 2 0 。o s 喂k y 3 0 ，0 s w r k y 5 3a n d o s w r k y 8 0w e r eh i 曲髓m 姐也a tb e t w e e n0 s m a p k 5 aa r na t w r k y 2 5 ，a 婚佩i ：y 2 6 a n da 阿，r k y 3 3 o s w j ir m k11 1 a ds o m ed i 丘b r e n t 丘o m0 s m a p k 5 a i td i dn o ti n t e r a c t w i 山0 s w r k y 5 3 b u tw i t ho t h e rm e r i i b e r so s w 丁u m k lw 嬲s i m i l 盯证t h0 s m a p k 5 a a t m a p 髓。am e m b e ro fm a p k 缸n i l vo f 缸a b i d o p s i sa n dah o m o l o g u eo f o s m a p k 5 a w a sa l s oc l o n e d t h es t r e n m so fi n t e r a c t i o n sb e t 、v e e na t m a p k 3a i 】d t 1 1 e c l o l l c dw m c yp r o t e h 塔w h i c hh a v es p t t gd o m a i l lw e r ea l s 0 锄a l y z e d ，龇 r e s l l l t sw e r es 枷l a r 、i t ho s w j u m k l t h e s er e s l l l t s l ，r o v e dw r k yp 腻i n si n c l u d i n g s p t t gd o m a i ni n t 啪c t e d 研t l lm a p k s b yb i f c “s u a l i z a t i o n ，i tw a sf o u n dt h a t i v a b s t r a c t 0 s w r k y 8 0i n t e r a c t e dw i mo s m 魄p k 5 ai l lr i c ec e l l s f i i l a l l y w ed i u s dt h ek e yr o l eo fs p r r gd 咖a i ni nr e l 砷e d 谢t l lw r k y 铷 i l i l ya n d m a p k 涮l y ，t h ei i n p o r b i l c eo fw r k yp m t e i i lw l l i c hc o n t a i l l i n gs p t t gd o m a i ni n b i o d c 趾da b i o d ct i e s ss i g a lp a t h 、 m y k e yw o r d s ：w r k yt r a n s c r i p t i o n 缸t o r ，m a p kb i 甜c 锄d 曲i o t i cs 骶s s ，i i l t e r a c t i o l l ， s u b s 订a t e s p t t gd o m a i r i v 论文独创。队声明 本论文是我个人存导师指导f 进行的研究j 作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地力外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对木研究的启发和所做的贡献均己在论文中作了明确的声l 目 并表刁ir 谢意。 作者签名： 论文使用授权声明 日期：立丛尘 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公粕论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 名；彭嘲铆虢拉乒一隰半掣 i 。 第一章综述 第一章综述 1 w r k y 转录因子家族介绍 转录因子( t r a n s c r i p t i o n 也称为反式作用因子( 仃a 璐- a c t i gf j c t o r ) ，是指能 够与真核基因启动子区顺式作用元件( c i s 七l e m 锄t ) 特异性结合并调控基因转录的 d n a 结合蛋白( l i u e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。从蛋白质结构分析，转录因子一般包含两个必要 的功能区：d n a 结合区和转录调控区。d n a 结合区能够识别基因启动子区的特异 序列，转录因子一般根据d n a 结合区的结构进行分类，常见的有：锌指结构( 五n c f i n g e 哪，h c l i x 咖m h e l i 】【，亮氨酸拉链结构( 1 e u c i 舱z i p p 神，h e l i ) ( - 1 0 0 p _ h e l 议和h i 曲 m o b i l 时g r o u p s 等( s c h 忸b c 锄dr h o d e s ，1 9 9 1 ；h c c h m 纽，d s ，1 9 9 5 ；s a u r t ， 1 9 9 0 ；m u r r e ，c a n db a m m o r e ，d ，1 9 9 2 ) 。转录因子的转录调控区与鼢姨多聚酶以 及其他的调控蛋白相互作用，从而影响基因的转录( s 田e r ，l ，1 9 9 5 ；a g a l i o t i “以， 2 0 0 。 w r k y 转录因子家族主要存在于高等植物中，在一些低等生物中包括低等藻 类及原生动物中也有少量发现。最早被鉴定的植物w r k y 基因是甘薯( 加妒d 幻刎珊) s 尸_ 用( 即即：s w e 耵p o t a l of a c t o r1 ) 基因，其基因产物特异地与 甘薯印鲫聊f 糟基因和p - 淀粉酶彬k ，0 基因启动子区域的s p 8 序列识别，从而 参与并调控植物糖信号途径的建立( i s h i g u r oa n dn a k a u 均，1 9 9 4 ) 。随后，相继在 野燕麦( 一v 明口力f 獬；删) 、欧芹( n 加配砌删c r 印堋；凡聊哪! ，2 ，3 ) 和拟南芥 ( 4 r 6 锄哪玻z 护j ) 等不同植物物种中克隆到相应的翮猢藿因，并对它们的生 物学功能进行了研究限u s h t “口f - ，1 9 9 5 ；鼬l s h t 甜口7 ，1 9 9 6 ；d e p a t c r 甜以，1 9 9 6 ； e u l g e m 甜以，2 0 0 0 ；u l k 盯锄d s o m s s i c h 2 0 0 4 ) 。目前，在p f 缸数据库( v e r s i o n 2 1 o ， 2 0 0 6 1 1 ) 中已经收录了5 1 个物种，总计5 3 4 个含w r k y 结构域的蛋白( f i 蚰甜讲， 2 0 0 国。 1 1w “转录因子的结构特点及识别序列 w r k y 基因家族因含有保守的w r k y 结构域而得名，包含大约6 0 个氨基酸， 其n 端有w r k y g q k 7 个氨基酸和紧邻的1 个锌指结构，属于锌指型( z 血- f m g e r t y p e ) 转录调控因子( e u l g e m 甜以，2 0 0 0 ；y u 甜耐，2 0 0 1 ；d o n g 甜口，2 0 0 2 ) 。根据 w r k y 结构域数量及锌指结构的类型，可将w r k y 家族分为三个组：第1 组包含2 个w r k y 结构域，第1 i 、i i i 组只有1 个w r k y 结构域；第1 i 和第1 i i 组的区别在于锌 指结构的不同，第1 i 组的锌指结构为c 2 h 2 型f c x 4 5 c x 2 2 2 3 h x 1 h ) ，第1 i i 组为 第一章综述 c 2 h c 型( c x 7 c x 2 3 - h - x 1 c ) ( e u l g e m ，甜口f ，2 0 0 0 ) 。对拟南芥和水稻w r k y 家族 成员根据序列同源性尤其w r k y 结构域的同源性，构建系统发生树，从而对、r k y 家族进行分类，也已经有几个报道，但相互之间都有一些差异( d o n g 甜讲，2 0 0 2 ； z h 柚ga n d w 锄g ，2 0 0 5 ；w u 甜以，2 0 0 5 ) 。根据拟南芥和水稻w r k y 蛋白质家族系统 发生树，拟南芥i 组和i h 组w r k y 蛋白质分别独立聚集成一组，组w r k y 蛋白质 被划分为2 a 2 e 等5 个亚组( e u l g e m 甜讲，2 0 0 0 ) 或i i a i i g 等7 亚组( d o n ge f 以，2 0 0 2 ) 或2a + 2b ，2c 和2d + 2e 等3 个亚组( z l m ga n d w a n g ，2 0 0 5 ) ；而水稻i 组w r k y 蛋白质独立聚集成一组i i i 组w r k y 蛋白质分别聚集成i i i a 年i i i b 等2 个亚组，而i i 组w r k y 蛋白质被划分为i i a _ i i j 等l o 个亚组( q i u 盯口f ，2 0 0 4 ) 。、珈等( 2 0 0 5 ) 以 w r k y 结构域的系统发生关系及锌指结构的特征为基础，将w r k y 家族分为三个 大组八个亚组：第1 组包括i a 和i b 两个亚组，i a 通常含有两个w r k y 结构域，该 组的锌指结构为c 2 h 2 ：第1 i 组包括a 、i i b 、i k 和i i d 四个亚组，通常含有一个w r k y 结构域，锌指结构同第1 组相同；第1 i i 组包括i a 和i i i b 两个亚组，也是含有一个 w r k y 结构域，但其锌指结构为c 2 h c 。 图1 1w r k y 结构域的结构 f i g1 1t h en m rs o l u t i o ns t n c t i l 糟o f t h ec t e 珊i n a lw r k yd o m a i no f t h e a i 鼍b i d o p s i st h a l i a n aw r k y 4p r o t e i n r a s a k ip f 口，2 0 0 5 ) t h es 订u d 删c o n s i s t so f af o u r - s t r a n d e db e t a s h e e t ，、v i 也az i n cb i n d i n gp o c k e t i o r m e db v l ec o n s e e dc v s h i sr e s i d u e sl o c a t e da to n ee n do f t l l eb e t a - s h e e t r e v e a l i n gan o v e lz i n ca n dd _ n ab i n d i n 譬殉僦t i 】r e n 圮w r k y g q k 托s i d u e s c o n s p o n dt ot l l em o s tn - t e 皿协a lb e t a s 廿 m d ，k i n k e di nt i 忙m i d d l eo f t h es e q u e n c eb y t l l eg l yr c s i d u e ，w h i c he m i b l e se x t c s i v eh m p h o b i ci n t e m c t i 0 1 1 si i l v o l v i n gt h et r p f e s i d l l e 柚dc o n t r i b u t e st ot h es t n l c t i l m ls t a b i l i t vo f t h cb e t a s h e e t b a s e do n ap m f i l co f n m rc h e l l l i c a ls 1 1 i f cp e n i l r b a t i o 璐，、v cp r o p o s et h a tt l l es 锄es 缸a n dc n t e r st l l ed n a 叠即l o v ea n df o r r i l sc o n t a c t sw i t l lt l l ed n a b a s e s 第一章综述 w r k y 结构域是w r k y 蛋白生物学活性必需的。第1 组w r k y 蛋白虽然含有2 个w r k y 结构域，但位于c 末端的w r k y 结构域足以介导w r k y 蛋白与其目标 d n a 的特异结合，而n 末端w r k y 结构域单独不能与d n a 结合，其生物学功能不 详。w r k y 成员的另一个共同点是w r k y 结构域对应的编码序列中都有1 个内含 子，且其位置高度保守，其存在的意义尚不清楚，可能是参与调节转录后加工 ( e u l g 锄甜讲，2 0 0 0 ) 。在w r k y 结构域中位置高度保守的内含子分为两种类型：一 种是位于编码r 的位点，在密码子a g g 中的两个g g 之间剪接，称为r 型内含子； 另一种内含子在编码v ( 缬氨酸) 的位点前剪接，v 位于锌指结构c 2 h 2 的第2 个c ( 半 胱氨酸) 之后的第6 个位点，称为v 型内含子( w u ，甜口t ，2 0 0 5 ) 。 除了具备高度保守的w r k y 结构域和c y s 2 h i s 2 ( 或h i s c y s ) 锌指型结构域外， 部分w r k y 蛋白质还有一些其他的结构域，例如：亮氨酸拉链l z s ( 1 e hz i p p e 巧) 以及富含丝氨酸苏氨酸域( s e r i i l e _ 廿鹏o n i r i c hr e g i o n ) 、富含谷氨酰胺域 ( 曲l l a m j n e 莉c hf e g i o n ) 和富含脯氨酸域( p r o 硒c - r i c hr e 西0 n ) 等结构( e l 】1 9 e m 甜以， 2 0 0 0 ；u l k e ra n ds o m s s i c l l ，2 0 0 4 ) 。这些结构域的存在使得这些w r k y 蛋白可能通过 蛋白质之间的相互作用形成同源二聚体或异源二聚体而调控靶基因的表达，或者 对这些w r k y 蛋白的调控活性有重要影响。 在所有研究过的可能受w r k y 蛋白调节的基因启动子中，都能发现 哪a c ( c 田这样的保守序列，称为w b o x ，是w 砌吖蛋白特异的d n a 结合区， 其中t g a c 是核心，固定不变( d ua n dc h e n ，2 0 0 0 ) 。事实上，已研究过的w r k y 蛋白目标基因中，绝大多数都是基于能与w r k y 蛋白特异结合的特性而识别出来 的，因此，w j b o x 成为识别和筛选w r k y 目标基因的必要条件。大多数目标基因启 动子中都含有多个w b o x ，它们之间的位置相近，或同向或呈回文结构排列 ( 砌e c h m 锄甜耐，2 0 0 0 ；j a k o b y 盯以，2 0 0 2 ；c h 甜讲，2 0 0 2 ；m a l 。c k “甜，2 0 0 0 ) 。 如皱叶欧芹的厅彤隧w 启动子中有3 个w 勘x ，位置靠近，其中2 个( w b 和w c ) 呈回 文排列。这种排列方式明显有利于w r k y 蛋白的结合，使基因表达水平提高。另 外，这3 个w b o x 的作用具有协同效应，而不是简单的叠加( y o d a 甜讲，2 0 0 2 ) 。用 人工合成的启动子，其中只含、n b o x 而排除其它可能的转录因子结合元件，研究对 病原体及其诱发因子或创伤反应的结果表明，w b o x 足以介导防卫或胁迫反应，且 反应程度与w b o x 的数量及位置有关但l l s b t o n 甜讲2 0 0 2 1 。因此，w b o x 的数量、 排列方式、间距以及侧翼序列( n a i l k i n gs c q u e n c e ) 等的不同可导致基因表达调控的 特异性。 大量的研究通过测试目标d n a 凝胶电泳迁移( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l 时s h i f t ， e m s a ) 的结果表明，分离纯化的w r k y 蛋白以及经病原体或防卫反应信号分子诱 导的植物细胞核抽提物都能与w b o x 结合( m a l e c k 盯讲，2 0 0 0 ；h a r a 盯讲，2 0 0 0 ；y u 第一章综述 甜以，2 0 0 1 ) 。这些实验同时也表明，如果w b o x 中的核心序列t g a c 中的任一核苷 酸被替换，w r k y 蛋白与之结合的能力就大幅下降或完全消失，表明这种结合是 非常特异的。这种结合需要金属离子参与，用金属络台剂如e d t a 或 1 ，l o - o - p h e n a t h r o i i n e 处理可阻断其结合。最有可能的金属离子是z n + 2 ，这与w r k y 蛋白中含有锌指结构是一致的( m a e o 甜以，2 0 0 1 ；h a r a 甜以，2 0 0 0 ) 。另外，w r k y 蛋白的结合还需磷酸化，因为用碱性磷酸酶预处理强烈抑翩这种结合( y a n g 甜靠， 1 9 9 9 ) 。 w r k y 转录因子除能识别w b o x 外，有些还能识别其他结合序列，例如：大麦 的w r k y 转录因子s u s i b a 2 能识别糖反应信号的保守序列s i 瓜e ( s u g a rr e s p o l l s 沁e ) ( s m 甜以。2 0 0 3 ) 。这些序列的识别反映了w r k y 家族基因功能的多样性。 1 2w r k y 家族的起源和进化 一直以来，w r k y 类转录因子都被认为是植物所特有的( e t l l g e m 盯讲，2 0 0 0 ) 。 在原核生物细菌和原核生物光合蓝细菌( 蓝藻) 、真菌、动物和人的基因组之中趱 未发现w r k y 基因的存在。最近，在原生生物蓝氏贾第鞭毛虫( g j 酊荫口妇6 ，蛔) 、 粘菌( 砒咖j 地f f “md i 脚豇拓姗) 和莱因哈德衣藻( o 砌卿如肥伽f ) 的基因 组中分别鉴定出一个w r k y 基因( w u 甜讲，2 0 0 5 ；z h a 雎酣口，2 0 0 5 ；u l l 酣姐d s o m s s i c h ，2 0 0 4 ) ，提示了聊t 髓整因的古老起源。而在植物界基因组之中，w r k y 基因家族成员随着植物从低等单细胞真核藻类到高等多细胞被子植物的系统演化 而迅速扩增。比如，衣藻基因组拥有1 个w r k y 基因、苔藓植物p 向旧c d 册f ，邢砌瑚，p 琊 基因组至少拥有1 2 个w r k y 基因、到裸子植物苏铁( c 弦船比v d 胁日，基因组至少拥 有2 1 个w r k y 基因、高等被子植物拟南芥基因组拥有7 2 个w r k y 基因和水稻基因 组至少拥有1 0 2 个w r k y 基因等，其w r k y 基因成员数量从1 个迅速扩增到至少 1 0 2 个。目前在真核单细胞衣藻、非光合真核生物黏霉菌d i 佛阳z i 跏枷i 如堋、 单细胞原生生物g 融勋”6 f 涮、低等植物苔藓植物p j j 9 瞄埘f f 阳? f 口胛据埘和蕨类 植物( 砒f 叩r 盯妇，耐肼访f 等基因组之中所发现的聊y 基因编码产物含有2 个 w r k y 结构域，均属于第一大类型。从裸子植物苏铁( c 如唧坤v o 砌口) 基因组中所 克隆的2 1 个聊l 毽因之中，1 5 个属于第1 组，而另外6 个属于第1 i 组( d l k e ra n d s o m s s i c i l ，2 0 0 4 ) 。这些结果暗示了第1 组w r k y 基因可能代表了最原始的形式。从 水稻和拟南芥w r k y 蛋白进化树的分析结果比较中发现，两者的第1 、i i 组和第1 i i a 亚组的部分成员分别紧凑地聚集在一起，而i i i b 亚组的成员却没有聚集在一起，这 表明i i i b 贬组的基因大部分是在单子叶植物和双子叶植物分化之后产生的。此外， 水稻第1 i i 组w r k y 基因的数量较拟南芥急剧扩增，这提示水稻第1 i i 组腓朋毽因的 进化比拟南芥的活跃，并且这组基因可能在单子叶植物中具有特殊功能( w up ，以， 4 第一章综述 2 0 0 5 ；表1 ) 。各组或亚组间的一些过渡类型基因也为w 砌( y 基因的进化提供了有 价值的线索。 瓤撼翮懈济暇醛黼鼗莹n 簸 i i e1 n n m b 州0 f 眦y 驰删f 怕mm 忡a n da 博味i o p d - 。 g r 帅p 蝴崦伸u p 三筮二岫出l 一 a t w 【y侥w r k y l3 2m b1 41 4 1 b貅抑 i l2 加 l h i i i a l l i b 砌 7 2 l i m 上述发现和研究证据预示着：第1 组、y 基因成员可能是植物w r k v 基因家 族最古老的类型，并且可能起源于1 5 2 0 亿年前的真核生物起源之时( u l k e r 蛆d s 锄s s i c h ，2 0 0 4 ) ；丽第组和第1 组的w r k y 基因成员可能在苔藓植物起源之后才 在裸子植物或蕨类植物基因组之中出现，而w r k y 第1 i i 组的基因分歧是该家族进 化的后期事件。综合上述发现以及) ( i e 等( 2 0 0 5 ) 、z h a n g 和w a n g ( 2 0 0 5 ) 的资料， w r k y 基因的进化路线可以推测为：第1 组作为最原始的w r k y 类型，通过w r k y 结构域的丢失或分裂过渡到第1 i 组；第1 i 组可能是通过锌指结构中的h ( 组氨酸1 转交 成c 残基产生了第m 组。在基因家族的各组中，第j i i 组进化最活跃，第1 、组较保 守，其中第1 组更为保守。在各亚组中，i b 亚组较i a 亚组活跃，i i a 亚组较b 亚组活 跃，d 驱组较i i c 亚组活跃，u l b 亚组较m a 亚组活跃( 图1 2 ) 。 堕t c 嘶l c t c m d m l 匹五 吒蚕口一g m 岫嗽i y 6 一 w r k y d 蝴m d “p l 妇咖 娑，爵咖n 删， _ 1c 2 h c c 2 i c 卜一g 咖p n ，愀r g 蹦拍 图1 2 推测的水稻w 砌“家族基因进化路线( ) 【i ee ta i ，2 0 0 s ) 第一章综述 f 醺1 2d e d u c e de 、r o l u “o n a r y 舶m 州o r ko fo s w r k yg e n