（生物化学与分子生物学专业论文）hbx与survivin协同致癌调节hbxip作用分子机制的研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文 ( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和 中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：f 2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并己通过论文答 辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 年月 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 h b x 与s u r v i v i n 协同致癌调节h b x i p 作用分子机制的研究 姓名邱丽艳学号 2 1 2 0 0 7 0 8 4 3 答辩日期年月日 论文类别博士 口 学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所生命科学学院 专业 生物化学与分子生物学 联系电话 1 3 8 1 1 8 7 6 7 8 7e m a i l q i u l i y a n 2 0 0 8 1 6 3 c o m q 备注：是否批准为非公开论文 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 ： 一 。擎研审茸礤珥丢妊汤非娶申甭g 也毒￥拦掣驯谚萃拱珥毒拦妤非氍 肆固辫蕈詈专蒋( 粉鲤草一) 皇藓晕勘甲。萃观珥毒明千班、千斟晕鲥明士群辫椠出耍肆砰戮章：霹 钞 茸砚妊影非紧裂徘显著 ：瑕母 1 i e 口缸 琶裂擘1 1 4 写乡蝴d t i l 0 0 f 9i g o o e u e x h n t b i l b 硼l g l 9 l 8 i1 8 e i 县印当治 杀解甭壬髟野杀科解甭硒牟涮杀杀性粤再臻 罢 黜 口千进华亲会刨口坐6 磷珥掣 口珥嘉环牟千渔周千、照蟹嘉 r -千斟 眙椠茸砚 噼皆釉o j o e 酶目挺嚣 妒8 0 l o o el 乙 鲁杀磷鲤好黟秘 延掘朝0 串碑壬髟目勤d ：i x f l h 聃暾譬疆刨饵u i a l l i r i $ 与x f l h 目型茸砚 目k 日罗匆0 f o z i 酮耍箩复厂：专蓊y 砰群磊檗勘 。型囝勘s 圜瞠酬雨延i f ! 甲辑碰擎一岳玛津砰群卓。犁酶娶丁牟黧晕刨y 章 。兽目y 卓甲酱g 司业貊密剧业圈蹲墟一荜掣朝覃砚卓鹭辑旨列壬早革砚珥杀朝覃瞥：辫 嚣茸砚裂觋1 己冀智助印鞘毕勘阿刨 1 f 区杀杀y 拦单观吾茸砚珥杀朝y 卓：韶率y 卓 。山w x a p u ! f 1 0 0 8 ：1 9 1 o z t t 。乙。乙，：d u t i ：辏豳勘肆圈翁耍蕈蕾硝士印茸磁 。茸砚拦影刨髟础瞠疆群g 翠柳暂础希群瞠革群惭叫业甲刮睁肇哿茸砚再杀妊影非 。唑砰朝茸砚擎髯勒渐融茸翠目哿y 卓翱回。暂殂昏粤身释蟛鞑鼻豳* 髀鹭辩联犁群壕 茸砚百杀珂醉y 劲冀狲壬砷并理茸识爵赤明圈群犁群革篱群硎田壬印( 罂椠) 肚晦半杂国车 唑抬g 擅冒掣辑性围审吲醉嘉谭砰岩勤覃嵌珥杀( 哥) 5 茸砚珂森明妊影莓瞥砑责军群辉旦辚 叫杀￥妊阜犁群￥肇僻旦辚辨谢( ) o 暂哿冒粤醺丐岛捧生、甄膝茸弓茸祺疆相骅茸、拳 磷善目茸砚辑群丁斛囡群翠婆凹雨蛳掣罂希群缎瞬岛勤锋固翠林蜞勘茸砚珥杀明妊影 琳询世珥奈阴目抱蚀哇素骥椠( z ) o 窜辫磉茸弓茸刁4 珥秦千班斟赤￥拦单y 嘴箕茸 拱珥秦雨延丑塾量哿碍壬0 事酉计茸肇归黪、由缮出卷询也辫嘉( 猕士审谣卓暗由骝狮辨母) 茸砚珥杀莓鬻举群2 群彭话某台 臻珥秦( i ) ：由砰目辫覃谟爵柔鲷掣圈联举群善砰勤鐾 翠阜衅杀￥妊单。犁群盈葛朝目唑哇撵劲茸砚珥杀甭跖抱￥单杀￥妊卑掷上弓毕y 牢 。_ 鹜f 士印翠醉涩卓彗辑茸砚珥亲朝y 牢迈瞥杀￥妊卑掣蟛簖梁勘臻 百杂千煦、千斜明罂錾餮哗酲葛甘唑瞠攀劲茸观爵杀雨距抱壬￥素￥妊单辫谢 、峰砰群甘哥茸孤珥毒毒￥妊掣 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目h b x 与s u r v i v i n 协同致癌调节h b x i p 作用分子机制的研究 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月 日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密l o 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于l o 年) 摘要 摘要 乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 感染与肝癌的发生具有十分密切的 关系，乙肝病毒x 蛋白( h b x ) 在肝癌的发生发展中具有十分重要的作用。然 而，h b x 的致癌作用机理目前仍不十分清楚。我们实验室前期研究工作发现，在 h b x 导致的恶性转化过程中，h b x 、s u r v i v i n 和h b x i p 三者形成复合物协同发挥 转化功能，h b x 和s u r v i v i n 扮演了至关重要的角色，h b x i p 不但发挥桥梁功能连 接h b x 和s u r v i v i n ，使三者形成复合物；而且本身还具有重要的致癌作用。为了 进一步阐明h b x 与肝癌发病的关系，本研究应用人正常肝细胞系，探讨了h b x 和s u r v i v i n 对h b x i p 的上调作用，对其分子机制进行了详细研究。 主要研究内容分为三个部分： 一、h b x i p 基因启动子的鉴定及其功能分析 实验室前期工作建立了稳定转染h b x 基因和s u r v i v i n 基因的细胞系，分别 命名为l 0 2 x 、l 0 2 s 和l 0 2 x s ，以此作为研究h b x i p 启动子的细胞模 型。为了筛选h b x i p 基因启动子的功能片段，以细胞基因组为模板，通过n c b i 筛选出h b x i p 基因转录起始位点上游序列并设计多对引物，p c r 扩增后将其产 物连接到t 载体进行测序鉴定；测序成功后将该基因亚克隆至p g l 3 b a s i c 荧光 报告基因载体上；瞬时转染l 0 2 x s 、h 7 4 0 2 、h e p g 2 等细胞系，然后用双荧光 报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果显示，p 3 2 3 3 - 1 6 7 3 ( 包含c r e b 结合位点) 的荧光素酶活性是p g l 3 b a s i c 的8 倍以上，而其他启动子片段( 不 包含c r e b 结合位点) 荧光素酶活性则相对较低。这表明p 3 2 3 3 - 1 6 7 3 区域内 存在调节h b x i p 转录的顺时作用元件，同时c r e b 结合位点可能在h b x i p 的 转录活性调控中起一定作用。 一 二、h b x 和s u r v i v i n 对h b x i p 启动子甲基化水平的影响分析 本实验室的前期研究工作已证明h b x i p 发挥桥梁的功能连接h b x 和s u r v i v i n 使三者形成复合物导致正常肝细胞发生恶性转化。我们在共转h b x 和s u r v i v i n 的 细胞系l 0 2 x s 中通过r t p c r 发现h b x i p 在m r n a 水平上调，免疫印迹技术发 现h b x i p 蛋白表达水平上调。为了在表观遗传修饰水平阐明h b x 和s u r v i v i n 协同 上调h b x i p 的分子机制，我们应用硫酸盐d n a 测序法检测了h b x i p 启动子的甲 基化水平。结果显示，相对于l 0 2 ，l 0 2 x ，l 0 2 s 细胞系，l 0 2 x s 细胞系中 摘要 h b x i p 启动子的三个c p g 岛2 1 6 5 - 2 1 7 1 ，2 2 8 2 2 2 8 7 和2 3 2 6 2 3 3 0 处于低甲基 化状态，这与h b x i p 表达上调相一致。该结果表明，h b x 和s u r v i v i n 可共同诱 导h b x i p 启动子区域的去甲基化从而促进其表达。 三、h b x 和s u r v i v i n 通过c r e b 转录因子促进h b x i p 的转录 已有文献报道h b x 蛋白可与转录因子c a m p 应答元件结合蛋( c a m p r e s p o n s ee l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n ，c r e b ) 结合来调节其靶基因的转录。我们通 过对h b x i p 启动子序列分析发现，h b x i p 启动子序列中含有c a m p 反应元件 ( c a m p r e s p o n s ee l e m e n t ，c r e ) 。本研究应用染色质免疫共沉淀检测发现，h b x 蛋白可与h b x i p 基因相结合，但干扰c r e b 后h b x 蛋白则不能与h b x i p 基因 结合。说明h b x 蛋白可通过转录因子c r e b 来调控h b x i p 的表达。那么s u r v i v i n 在该过程中发挥什么作用呢? 为了说明这一问题，我们将s u r v i v i n 干扰后用h b x 蛋白的抗体做染色质免疫共沉淀分析发现，s u r v i v i n 干扰后h b x 与h b x i p 基因 的结合受到影响，该结果说明s u r v i v i n 在这一过程中也起到了重要的功能。 综上所述，h b x 与s u r v i v i n 协同，从启动子d n a 甲基化修饰和蛋白质d n a 结合等方面上调h b x i p 的表达。上述研究将为深入揭示h b x 的致癌机理提供新 的实验依据，并进一步丰富h b x 致癌的分子机理，对于肝癌的预防及治疗具有 重要的理论价值。 关键词肝癌乙型肝炎病毒x 蛋白s u r v i v i nh b x i p 分子调控 a b s t r a e t ab s t r a c t i n f e c t i o no fh e p a t i t i sbv i r u s ( h b v ) i sc l o s e l yr e l a t e dt ot h eo c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n to fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) m a n ys t u d i e sh a v es h o w nt h a t h b vx p r o t e i n ( h b x ) ，e n c o d e db yh b vxo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) ，p l a y sa n i m p o r t a n t r o l ei nt h e d e v e l o p m e n to fh c c h o w e v e r , t h em e c h a n i s m f o r h b v - i n d u c e dh c cr e m a i n st ob ee l u c i d a t e d o u rp r e v i o u sw o r kd e m o n s t r a t e dt h a t h b x ，s u r v i v i na n dh b x i pf o r m e dac o m p l e xi nt h et r a n s f o r m e dl 0 2c e l l s h b xa n d s u r v i v i np l a y e dac r i t i c a lr o l ei nt h i sp r o c e s s ，w h i l eh b x i pf u n c t i o n e da san e c e s s a r y l i n k e rb e t w e e nh b xa n ds u r v i v i n t of u r t h e re l u c i d a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh b x a n dh c c ，w ee x p l o r e dt h em e c h a n i s mo fu p r e g u l a t i o no fh b x i pm e d i a t e db yh b x a n ds u r v i v i ni nt h ec a r c i n o g e n e s i su s i n gan o r m a lh u m a nl i v e rc e l ll i n ea sm o d e l t h i s s t u d yi n c l u d e st h r e ep a r t sa sf o l l o w s ： i d e n t i f i c a t i o no fh b x i pp r o m o t e r r e g i o n i nc e l l s s e v e r a lc e l ll i n e s s t a b l y - t r a n s f e c t e dw i t hh b xa n ds u r v i v i ng e n ew e r ee s t a b l i s h e di no u rp r e v i o u s s t u d i e s ，s u c ha sl 0 2 一x ，l 0 2 一s ，l 0 2 一x - s t od e f i n et h em i n i m a lh b x i pp r o m o t e r r e g i o n , a n di d e n t i f yt h ep u t a t i v ec i s e l e m e n t sw h i c hr e g u l a t ec o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o n o fh b x i p ，w eg e n e r a t e das e r i e so f5 a n d3 - d e l e t i o nr e p o r t e rc o n s t r u c t sb yi n s e r t i n g p c rf r a g m e n t so fv a r i o u ss i z e si n t ot h ep g l 3 b a s i cv e c t o r t h ep r o m o t e ra c t i v i t i e s o ft h ec o n s t r u c t si nh c cc e l ll i n e sa n de n g i n e r r e dl 0 2c e l ll i n e sw e r em e a s u r e d t h e d a t as h o w e dt h a tp 3 2 3 3 - 1 6 7 3 ( c o n t a i n i n gc r e bs i t e ) e x h i b i t e d 8 - f o l d sh i g h e r l u c i f e r a s ea c t i v i t i e st h a nt h a to fp g l - 3 一b a s i c m a r k e dr e d u c t i o ni nl u c i f e r a s e a c t i v i t i e sw a so b s e r v e di no t h e rc o n s t r u c t s ( n o tc o n t a i n i n gc r e bs i t e ) c o m p a r e d 谢m p 一3 2 3 3 - 16 7 3 ，s u g g e s t i n gt h a tt h er e g i o no fp 一3 2 3 3 一16 7 3i st h ep r o x i m a lp r o m o t e r t h ee s s e n t i a l c s a c t i n g e l e m e n t ss h o u l dp o t e n t i a l l ye x i tw i t h i nt h i s r e g i o n m e a n w h i l e ，t h ed a t ai n d i c a t e dt h a tc r e bs i t em a yp l a yr o l e si nt h et r a n s c r i p t i o no f h b x i p h b xa f f e c t st h em e t h y l a t i o ns t a t u so fh b x i p p r o m o t e rr e g i o nw i t hs u r v i v i n w e f o u n dt h a th b x i pw a so v e r e x p r e s s e da tt h el e v e l so fm r n al e v e la n dp r o t e i ni n l 0 2 - x - sc e l ll i n e sb yr t - p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g t of u r t h e ri d e n t i f yt h e m e c h a n i s mo fh b x i p u p r e g u l a t i o nm e d i a t e db yh b xa n ds u r v i v i n , w ee x a m i n e dt h e d n am e t h y l a t i o ns t a t u so nt h e p r o m o t e ro fh b x i pb yu s i n g b i s u l f i t ed n a a b s t r a c t s e q u e n c i n g t h e d a t a r e v e a l e dt h a t t h r e ec p gd i n u e l e o t i d ei s l a n d s i n c l u d i n g 一216 5 # 2171 ，一2 2 8 2 a 2 2 8 7a n d 一2 3 2 6 - 2 3 3 0a r o u n dt h et r a n s c r i p t i o ni n i t i a t i o ns i t eo f h b x i pw e r eh y p o m e t h y l a t e di nl 0 2 - x - sc e l l sb u tn o ti nl 0 2 ，l 0 2 一xa n dl 0 2 - s c e l l s t h u sw ec o n c l u d et h a th b xa n ds u r v i v i n u p r e g u l a t eh b x i pt h r o u g h d e m e t h y l a t i o no fr e g u l a t o r ye l e m e n to fh b x i pg e n e h b xa n ds u r v i v i np r o m o t eh b x i pt r a n s c r i p t i o nt h r o u g hi n d i r e c tb i n d i n gt o h b x i pp r o m o t e ri n v o v l i n gc a m p r e s p o n s ee l e m e n t - b i n d i n g ( c r u m b ) i th a db e e n r e p o r t e dt h a th b xp r o t e i nc a nb i n dt oc r e b t or e g u l a t ei t st a r g e tg e n et r a n s c r i p t i o n i nt h i ss t u d y , w ef o u n dt h a tt h ep r o m o t e rr e g i o no fh b x i pp o s s e s st h ec a m p r e s p o n s ee l e m e n t s ( c r e ) w h i c h c a nb er e c o g n i z e db yc r e b t h e r e f o r e ，w e e x a m i n e dt h ee f f e c to ft h ep h y s i c a la s s o c i a t i o no fh b xa n ds u r v i v i no nt h e t r a n s c r i p t i o no fh b x i pg e n eb yc m pa s s a y 、析t l las p e c i f i ca n t i b o d ya n dp c r c h i p a s s a yr e v e a l e dt h ee c t o p i ch b x i m m u n o p r e c i p i t a t e d h b x i pg e n e a f t e rr n a i t a r g e t i n gc r e bm r n aw a su s e di nl 0 2 - x sc e l l s ，w ep e r f o r m e dt h ec h i pa s s a y 、析mt h ea n t i h b xa n t i b o d y o u rd a t as h o w e dt h a th b x i pp r o m o t e rc o u l dn o tb e e n r i c h e d ，d e m o n s t r a t i n gt h a te c t o p i eh b x a n ds u r v i v i nm a yb i n dt oh b x i pp r o m o t e r b yf a c i l i t a t i n g t h er e c r u i t m e n to fc r e b m o r e o v e r , k n o c k d o w no fs u r v i v i n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h eh b xb i n d i n gt oh b x i pg e n e ，s u g g e s t i n gt h a ts u r v i v i n p l a y s as y n e r g i s t i cr o l ei nt h ep r o c e s s t a k e nt o g e t h e r ，h b xa n ds u r v i v i na r ea b l et ou p r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fh b x i p b ye p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o na n dp r o t e i n - d n ab i n d i n gi n t h er e g i o no fh b x i p p r o m o t e r o u rf i n d i n gp r o v i d e si n s i g h t s i n t ot h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i si n d u c e db yh b x a n ds u r v i v i ni n v o l v i n gh b x i p k e yw o r d s ：h c c ；h b x ；s u r v i v i n ；h b x i p ；m o l e c u l a rr e g u l a t i o n i 、， 符号说明 h b x i p h b x d m s o e d t a f b s p c r r n a i r ，r - p c r s d s p b s a m p cd _ n a c r e b c i 也 m s p l b 符号说明 h e p a t i t i sbv i r u sxi n t e r a c t i n g p r o t e i n h e p a t i t i sb v i r u sxp r o t e i n d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d f e t a lb o v i n es e r u m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r n ai n t e r f e r e n c e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r 乙肝病毒x 蛋白结合蛋白 乙型肝炎病毒x 蛋白 二甲基弧砜 乙二胺四乙酸 胎牛血清 聚合酶链式反应 r n a 干扰 反转录p c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n a m p i c i l l i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c a m p r e s p o n s ee l e m e n t - b i n d i n g c a m pr e s p o n s ee l e m e n t s 磷酸盐缓冲液 氨苄青霉素 互补脱氧核糖核酸 c a m p 应答元件结合蛋白 c a m p 应答元件 m e t h y l a t i o n s p e c i f i cp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 甲基化特异性p c r l u r i a b r o t h v l u f i a 肉汤培养基 目录 目录 第一章引言7 第一节乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌发生的关系7 第二节s u r v i v i n 蛋白及其作用机制9 第三节h b x i p 基因及其表达产物h b x i p 蛋白1 0 第四节h b x 、s u r v i v i n 和h b x i p 三者复合物与肝癌发生1 2 第五节研究目的和意义1 2 第二章h b x i p 基因启动子的克隆及其功能分析1 3 第一节实验材料13 第二节实验方法15 第三节实验结果2 3 第三章h b x i p 表达上调及其启动子区域的甲基化分析3 2 第一节实验材料3 2 第二节实验方法3 4 第三节实验结果4 2 第四章h b x 蛋白通过c r e b 与h b x i p 基因结合调节其转录机制的初步探索4 9 第一节实验材料4 9 第二节实验方法4 9 第三节实验结果51 第五章讨论5 4 d 、结一5 6 参考文献一5 7 至i 谢6 1 第一章附录常规溶液配制一6 2 第一节l 细胞培养6 2 第二节2 免疫印迹实验试剂配制_ 6 3 第三节3 分子克隆实验试剂配制6 5 个人简历、在学期间发表的论文与研究成果6 7 第一章引言 第一章引言 第一节乙型肝炎病毒x 蛋白与肝癌发生的关系 1 1 1h b x 基因及其表达产物h b x 蛋白 原发性肝癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，h c c ) 是我国及亚洲和非洲部分 地区常见的恶性肿瘤。在我国，h c c 有其特殊性，表现为约8 0 9 6 的h c c 存在乙型肝 炎病毒( h e p a t i t i sbv i r u sh b v ) 感染。目前，h b v 导致h c c 发生的分子机理仍 未完全阐明。 图1 1h b v 基因结构 f i 21 1t h eg e n o m eo fh b v h b v 属于嗜肝d n a 病毒，由短链和长链组成，分子量为3 2 k b 。h b vd n a 共 有4 个开放读码框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 。分别称为s 、c 、p 和x 区。 so r f 编码h b s a g 的大、中、小三种蛋白；co r f 编码h b e a g 、h b c a g ：po r f 编码h b vd n a 的多聚酶；xo r f 最小，大约在4 5 2 - 4 6 2 个核苷酸之间。编码 长度约1 5 4 个氨基酸的多肽x 蛋白，分子量为1 7 k d ，即h b x a g 。主要位于胞 质内，少部分分布于核内。乙肝病毒( h b v ) 感染不仅可引起急、慢性肝炎，而且 与肝硬化、肝癌的发生密切相关。在h b v 编码的蛋白中，乙型肝炎病毒x 蛋白 7 第一章引言 ( h b x ) 被认为是参与慢性乙型肝炎病理过程和诱发肝癌的最重要的蛋白质。乙肝 病毒x 蛋白间接调控宿主细胞内许多基因的转录，广泛影响宿主细胞的各种生 命活动，包括调节细胞凋亡，抑制细胞d n a 的修复，干扰细胞有丝分裂和细胞 周期进程等等。 1 1 2h b x 与肝癌发生的关系 h c c 的发生与h b v 感染高度相关，这点早为人们所共识。国内外研究表明， 在慢性感染中，x 基因可能是h c c 发生的主要原因之一【l j 。h b x 可能是一种具 有致癌潜能的蛋白。最早是s h i r a k a t a 等 2 1 将含有h b x 基因的真核表达载体转入 n i h 3 t 3 细胞，导致高度表达h b x 基因的细胞接触抑制消失，并可使接种此种 细胞的裸鼠产生肿瘤。在h b v 致癌机理研究的动物模型方面，有研究表明，将 h b v 含有整个h b x 基因编码区的1 1 5 k b 的d n a 片段转移入小鼠胚胎细胞，经 免疫印迹法证实被接种小鼠的肝、肾等组织有h b x 基因的存在，约8 l o 月龄时 出现肿瘤结节，1 l 1 5 月龄时，大多数小鼠死亡，且均患有肝癌【3 】。因此肝癌的 发病率升高应是h b x 致癌作用较为直接的证据。此外，原癌基因r a s 与x 基因 具有协同作用，能够导致细胞转化【4 】。m i y 撕等1 5 】将从一例h c c 中分离得到 含x 基因的d n a 片段转染至永生化鼠肝上皮细胞，导致了转化的发生。得出结 论，增强子和h b x 的作用是引起慢性h b v 感染者癌前病变的肝细胞转化的重 要因素。同样，在转基因小鼠中，h b x 的表达能够缩短c m y c 诱导的癌变的潜 伏期，并且可加快肝增殖，加重肝损伤【6 j 。另项研究表明，h b x 通过上调b e c l i n l 的表达，增强了细胞对饥饿引起的自吞噬的敏感性。在对h b v 阳性肝细胞的研 究中也发现，h b v 感染增强了宿主细胞的自吞噬，而这一作用正是h b x 依赖的。 上述研究结果提示了h b v 感染的肝细胞在饥饿环境下一种可能的生存机制，为 研究h b v 感染与肝癌发生发展提供了新的思路。最近的研究发现h b x 的表达 使转基因小鼠对二乙基亚硝胺( d e n ) 诱导的肿瘤更为敏感【7 j 。 乙肝病毒x 蛋白是一种多功能的病毒调节因子，通过调节细胞和病毒的转 录活性、信号的传导途径、蛋白质降解、基因毒性应激反应等多方面，能直接 或间接地影响乙肝病毒的复制、肝细胞的增殖与死亡，并促进肝细胞的转化。 w a n g 掣8 j 分离原发性肝细胞癌患者的h b v 病毒并对其进行序列测定后发现， 大部分患者中存在由h b v 整合引起的h b x 基因3 端缺失，从而使x 蛋白的c 端截短的现象，并在h c c 的发展中起重要作用。我们实验室从慢性肝病患者的 8 第一章引言 血清和组织中分离得到乙肝病毒x 基因突变株发现，乙肝病毒x 蛋白羧基端的 第2 7 个氨基酸缺失，对人正常肝细胞增殖具有明显的促进作用，会导致肝癌的 发生。大量实验结果已明确h b x 为癌蛋白【9 1 0 1 ，具有明确的致癌作用，但是其 详细的分子机制仍不清楚。 第二节s u r v i v i n 蛋白及其作用机制 1 9 9 3 年c r o o k 等在一杆状病毒c p g vd n a 中首次发现一种同样发挥着抑制 细胞凋亡的功能，但与p 5 3 的并无同源性的基因，即c p l a p 。此后，在果蝇、 线虫、酵母及哺乳动物中陆续发现i a p ( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i s ) 家族成员。i a p 家族为一类内源性细胞凋亡抑制蛋白，在许多物种( 包括病毒、真核生物、哺乳 动物等) 中起着阻止细胞凋亡的作用。它通过多种因子起作用，行使其抑制凋亡 的功能。其成员已发现的有x i a p 、n i a p 、c i a p 1 、c l a p 2 、s u r v i v i n 和a p o l l o n 笔【1 1 】 寸o i a p 家族具有抑制细胞凋亡的作用。目前，认为s u r v i v i n 是细胞凋亡与细胞周 期检查点之间的界面分子( i n t e r f a c e ) ，s u r v i v i n 可能主要通过两条途径来抑制细 胞凋亡：直接抑制凋亡终末效应器蛋白裂解酶c a s p a s e3 和c a s p a s e7 的活性 来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程：( 墓) s u r v i v i n 与周期蛋白激酶c d k 4 、 p 3 4 c d c 2 2 相互作用阻断凋亡信号转导通路。其主要通过抑伟j l j c a s p a s e 家族成员介 导的蛋白酶级联反应过程中位于下游的效应分子c a s p a s e 3 、c a s p a s e 7 和c a s p a s e 9 活 性发挥作用。n 盯0 【通过某种途径诱导c l a p 2 表达，使细胞免于凋亡【i 2 。 s u r v i v i n 是凋亡抑制蛋白家族的新成员，它具有肿瘤特异性，仅表达于肿瘤和胚 胎组织，与肿瘤细胞的浸润转移及分化增殖有密切的关系【l3 1 。s u r v i v i n 基因在 近乎所有的癌组织中都有过量表达。如胃癌、结直肠癌、乳腺癌、非小细胞性 肺癌、膀胱癌、皮肤癌、神经纤维母细胞瘤等。这一普遍分布现象显示：s u r v i v i n 基因在癌症中可能处于失控的表达状态。近期研究也证实，在全球近4 0 0 万的基 因转录表达分析中，s u r v i v i n 基因是肿瘤组织中表达上调最为普遍的基因。 a m b r o s i n i l 9 9 7 年，a m b r o s i n i t l 4 】等利用效应细胞蛋白酶受体i ( e p r l ) c d n a 在 人类基因组文库的杂交筛选中首次分离出s u r v i v i n 基因，因可延长细胞的生存故 又名生存素或存活素。该基因全长1 5k b ，定位于1 7 q 2 5 ，含4 个外显子和3 个内 含子，s u r v i v i n 基因编码产物是由1 4 2 个氨基酸组成的蛋白，分子量1 6 2k d 。人 9 第一章引言 鼠蛋白同源性为8 4 3 。与i a p 家族的其他成员相比较，s u r v i v i n 结构特殊，i a p 家族一般含有2 3 个串联的含有半胱氨酸组氨酸共有序列在内7 0 个氨基酸组成 的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复系歹l j ( b a c u l o v i r u si a pr e p e a t ，b i r ) 分子以及羟基末 端环指结构，其中的b i r 分子发挥抗凋亡作用，而s u r v i v i n 仅含有一个单一的b i r 功能区，并由c y s4 6 p r o4 7t h r4 8 3 三个氨基酸插入序列将s u r v i v i n 分为两半， 羟基端不含有环指结构，代以交织螺旋结构( c o i l e dc o i l ) ，以区别于其他l a p 家 族成员。s u r v i v i n 与肿瘤具有十分密切的关系，s u r v i v i n 在肿瘤组织中高表达，而 在正常组织中不表达。s u r v i v i n 在细胞中的表达具有严格的细胞周期依赖性 g 2 m 期特异性表达，而g 1 期受抑制。因此s u r v i v i n 可使纺缍体错误组装的细胞 进入凋亡，阻止错误的有丝分裂。s u r v i v i n 及其抑制的c a s p 弱e 参与了细胞分化的 调控。它可能成为未来进行基因治疗癌症的突破口 1 5 】。 第三节h b x i p 基因及其表达产物h b x i p 蛋白 乙肝病毒x 蛋白结合蛋i 刍( h e p a t i t i sbx i n t e r a c t i n gp r o t e i n ，h b x i p ) 由于能够 与乙肝病毒x 蛋白( h b x ) 的c 末端结合而被发现。人的h b x i p 基因染色体定位 于“l p l 3 2 ”，其c d n a 编码一个9 1 个氨基酸组成的9 6 k d a 的小分子量蛋白。h b x i p 基因几乎表达于高等动物的各种组织中，但在肿瘤组织中高表达。应用生物软 件分析h b x i p 蛋白序列发现其含有一个假定的亮氨酸拉链模序，可形成一个双 亲螺旋的二级结构。h b x i p 氨基酸序列上1 2 位和3 6 位的t h r 是两个公认的磷酸化 作用位点，能分别被p k c 和c a s e i nk i n a s ei i 两个激酶所催化【1 6 1 。 到目前为止，有关h b x i p 功能作用的研究较少，现有的文献报道主要有： h b x i p o e 够特异地与乙肝病毒( h e p a t i t i sbv i r u s ，h b v ) 的h b x 蛋白的c 末端结 合，降低h b x 的活性，从而改变