（生物化学与分子生物学专业论文）caspase3细胞定位信号的检测与分析.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 n l s n e s n p c d n t p p c r l b e d t a 确s s d s r p m b p o d o i 讧 p b s p a g e b s a k d h r p a g e a p d n t p t e m e d h e p e s t e 英汉缩略语名词对照 n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l n u c l e a re x p o r ts i g n a l n u c l e a rp o r ec o m p l e x d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n l u r i a - b e r t a n im e d i u m e t h y l e n ed i a m i n e t e r t r a a c e t i ca c i d t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e b a s ep a i r o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p h o s p h a t i cb u f f e rs o l u t i o n p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s b o v i n es e r u ma l b u m i n k i l o d a l t o n s h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a m m o n i u mp e r s u l p h a t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e n n ，n ，n ，- t e r a m e t h yl e t h y l e n ed i a m i n e h y d r o x y e t h lp i p e r a z i n ee t h a n es u l f o n i c a c i t r i s h c la n de d t ab u f f e r t n ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r t n f r lt u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e e e p t o r l t b s嘶s b u f f e r e ds a l i n e 核定位信号 核输出信号 核孔复合体 脱氧核糖核苷三磷酸 聚合酶链式反应 l b 培养基 乙二胺四乙酸 三( 羟甲基) 氨基己烷 十二烷基磺酸钠 每分钟转速 碱基对 光密度ul i j 伏 开放读码框架 磷酸缓冲液 聚丙烯酰胺凝胶电泳 牛血清白蛋白 千道尔顿 辣根过氧化物酶 琼脂糖凝胶电泳 过硫酸铵 脱氧核糖核苷三磷酸 n n n n 一四甲基乙二胺 羟乙基哌嗪乙磺酸 t r i s 盐酸、e d t a 缓冲液 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子受体l t r i s 缓冲的生理盐水 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t t b s e b d d d e d f a d d d i s c a p a f l c a r d a a g f p t r a d d d a p i r c c l w g a t r i s b u f f e r e ds a l i n ec o n t a i n i n gt w e e n - 2 0 含t w e e n 一2 0t ris 缓冲的生 理盐水 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 d e a t hd o m a i n死亡域 d e a t he f f e c t o rd o m a i n死亡效应域 f a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i nf a s 一相关死亡域 d e a t h - i n d u c i n gs i g n a lc o m p l e x死亡诱导信号复合物 a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o rl凋亡蛋白酶激活因子l c a s p a s ea c t i v a t i o na n dr e c r u i t m e n td o m a i nc a s p a s e 活化与募集域 a m i n oa c i dr e s i d u e氨基酸残基 g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n绿色荧光蛋白 t n f r l a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i nt n f r1 相关死亡域 4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 一p h e n y l i n d o l e 4 ，6 一二脒基一2 一苯基吲哚 r a n n u c l e o t i d e e x c h a n g ef a c t o r l r a n 核苷交换因子1 w h e a tg e r ma g g l u t i n i n 麦胚凝集素 2 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c a s p a s e - 3 细胞定位信号的检测与分析 中文摘要 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是多细胞生物机体在生理或病理状态下细 胞发生的一种自发的程序化死亡过程，是发育及成熟个体中维持体内 平衡( h o m e o s t a s i s ) 的一种正常事件。它的发生受到机体的严密调控。 凋亡途径分为外源性与内源性两种，前者由胞外凋亡信号如肿瘤 坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r , t n f ) 、f a s 配体( f a sl i g a n d ) 分别与 细胞膜表面的凋亡受体t n f r l 和f a s 结合，促使这两种受体三聚化， 三聚体的t n f r l 或f a s 通过自身的死亡域结构( d e a t hd o m a i n ，d d ) 和接头蛋白f a d d 中的d d 结构域相互作用，在胞浆中募集f a d d ， 形成f a s l f a s f a d d 或t n f t n f r l f a d d ，即死亡诱导信号复合物 ( d e a t h - i n d u c i n gs i g n a lc o m p l e x ，d i s c ) 。d i s c 中的f a d d 又通过其死 亡效应域( d e a t he f f e c t o rd o m a i n ，d e d ) 与c a s p a s e 8 前体的d e d 相互 作用，募集c a s p a s e 8 前体，且自身激活，然后活化下游的c a s p a s e 一3 ， 导致细胞的凋亡。内源性凋亡则是由于离子照射、化疗药物、线粒体 损伤等诱发，由b c l 一2 家族中促凋亡因子使细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) 从线粒体释放入胞浆，与a p a f l 、a t p d a t p 结合成复合物，称凋亡体 ( a p o p t o s o m e ) ，凋亡体中的a p a f l 通过其胱天蛋白酶募集域( c a s p a s e r e c r u i t m e n td o m a i n ，c a r d ) 与胱天蛋白酶- - 9 ( c a s p a s e 。9 ) 前体的c a r d 相互作用，从而募集c a s e p a s e 9 并自我激活，活化下游的胱天蛋白酶 重庆医科大学硕士研究生学位论文 - - 3 ( c a s p a s e 3 ) ，导致细胞的凋亡。内、外源途径自c a s p a s e - 3 以下完 全相同。 c a s p a s e 3 是调节细胞凋亡的关键蛋白质，为内外源途径所共有。 凋亡过程中，胞质定位的c a s p a s e 3 被酶解激活，进入细胞核中执行 功能。这一定位变化的分子机制至今仍不清楚。细胞核膜上的核孔复 合物( n u c l e a rp o r ec o m p l e x ，n p c ) 是核质问运输的通道，大分子物质 如蛋白质出入胞核需要核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l , n l s ) 和核输出信号( n u c l e a re x p o r ts i g n a l ，n e s ) 。分析c a s p a s e 一3 分子中是否 所含n l s 和n e s 可为深入了解其移位机制提供重要的线索。 我们构建了一系列c a s p a s e 3 不同缩短突变体，与g f p 融合表达， 观察它们在细胞中的定位，以鉴定c a s p a s e 一3 分子中所含的核输出信 号n e s ( n u c l e a re x p o r ts i g n a l ) 幂l 核定位信号n l s ( n u c l e a rl o c a l i z a t i o n s i g n a l ) 。结果发现，c a s p a s e 3 分子中不存在明显的n l s ，但存在一 个n e s ，该n e s 位于c a s p a s e 3 小亚基的c 端，包括2 2 0 , - 一2 4 5 氨基 酸残基。 关键词胱天蛋白酶一3 ，核输出信号，核定位信号 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 i d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i s0 fs u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o ns i g n a lo fc a s p a s e 一3 a b s t r a c t a p o p t o s i si sas p o n t a n e o u sp r o c e s so fp r o g r a m m e d c e l ld e a t hi nt h e p h y s i o l o g i c a l o rp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n ，a l s oan o r m a le v e n ti nb o d y d e v e l o p m e n t a n dm a i n t e n a n c eo f t i s s u eh o m e o s t a s i s ，a n do c c u r su n d e rt h e t i g h tc o n t r o lo ft h eb o d y t h ea p o p t o t i cp a t h w a yi sc l a s s i f i e da se x t r i n s i c a n di n t r i n s i cp a t h w a y s t h ee x t r i n s i cp a t h w a yi si n i t i a t e db yl i g a t i o no fa t r a n s m e m b r a n ed e a t hr e c e p t o rw i t ht h e i rl i g a n d s ，f o ri n s t a n c e ，l i g a t i o n b e t w e e nf a sa n df a s l ；t n fa n dt n f r l u p o nl i g a t i o n ，t h ef a so rt n f r l f o r m sm i c r o a g g r e g a t e sa tt h ec e l ls u r f a c e ，t h e nr e c r u i t i n gt h ea d a p t o r p r o t e i nf a d d sb y v i r t u eo fi n t e r a c t i o nw i t ht h e i rd e a t hd o m a i n s ( d d s ) ， c o n s t r u c t i n gt h ef a s l f a s f a d d o rt n f t n f r l 一f a d d 。b o t ha r en a m e d a sd e 砒i n d u c i n gs i g n a lc o m p l e x e s ( d i s c ) i ti sw i t h i nt h i sd i s ct h a tt h e i n i t i a t o rc a s p a s e 一8i sr e c u i t e db yh o m o p h i l i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e i rd e a t h e f f e c t o rd o m a i n s ( d e d s ) ，a n da c t i v a t e d t h e nt h ea c t i v a t i o no fe x e c u t i o n e r c a s p a s e 3i sc a r r i e do u tb ya c t i v a t e dc a s p a s e 一8 ，l e a d i n gt oc e l la p o p t o s i s t h ei n t r i n s i cp a t h w a yi su s e dt oc l i m i n a t ec e l l si nr e s p o n s et oi o n i z i n g r a d i a t i o n ，c h e m o t h e r a p e u t i cd r u g sa n dm i t o c h o n d r i a ld a m a g e f o l l o w i n g t h ed e a t ht r i g g e r , c y t o c h r o m eci sr e l e a s e df r o mm i t o c h o n d r i ab y 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 p r o a p o p t o t i cf a c t o r so fb c l - 2f a m i l y , a n db i n d st oa p a f la n da t p d a t p c y t c a p a f l - a t p d a t pc o m p l e xi sn a m e d a p o p t o s o m e ，w h o s ec e n t r a l c o m p o n e n ti sa p a f lw h i c hr e c r u i t sc a s p a s e 一9v i ai t sc a s p a s er e c r u i t m e n t d o m a i n ( c a r d ) t h e nt h er e c u i t e dc a s p a s e 一9 sa c t i v a t e st h e n s e l v e s ，t h i si s f o l l o w e db yt h es a m ee x e c u t i o n e rc a s p a s ea c t i v a t i o na st h ee x t r i n s i c p a t h w a y c a s p a s e 一3i ss h a r e db yt h et w op a t h w a y sa n dak e yr e g u l a t i n gp r o t e i n i nc e l la p o p t o s i s d u r i n ga p o p t o s i s ，c a s p a s e - 3i sc l e a v e da n da c t i v a t e db y t h ep r o t e a s e s ，a n de n t e r si n t ot h en u c l e u s ，r e s u l t i n gi na p o p t o t i cb i o c h e m i c a l a n dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e s h o w e v e r , t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f n u c l e a r - e n t e r i n go fa c t i v ec a s p a s e - 3 i ss t i l lu n k n o w n i n t e r c h a n g eo f m a t e r i a l sb e t w e e nt h ec y t o p l a s ma n dt h en u c l e u so c c u rt h r o u g hd e d i c a t e d t r a n s p o r tc h a n n e l sc r o s s i n g t h en u c l e a r e n v e l o p e ，t h e n u c l e a r p o r e c o m p l e x e s ( n p c s ) m a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i nt r a n s p o r t i n gt h r o u g h n p cn e e dn u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ( n l s ) o rn u c l e a re x p o r ts i g n a l ( n e s ) i d e n t i f i c a t i o no fs u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ns i g n a li nt h ec a s p a s e 一3m o l e c u l ei s i m p o r t a n tt ou n d e r s t a n dt h ep r o c e s s i nt h i ss t u d y , w ec o n s t r u c t e dv a r i o u st r u n c a t e da n df u s e dw i t hg f p c a s p a s e 一3m u t a n t s ，o b s e r v e dt h ec e l l u l a rl o c a t i o no ft h e s em u t a n t s ，a n d d e t e r m i n e dt h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ss i g n a li nt h e s em u t a n tc a s p a s e - 3 m o l e c u l e s t h er e s u l t ss h o wt h a t c a s p a s e 一3 l a c k so b v i o u sn u c l e a r l o c a l i z a t i o ns i g n a l ( y e s ) ，b u tb e a r sa no b v i o u sn u c l e a re x p o r ts i g n a l ( n e s ) ， 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 w h i c hi sl o c a t e da tt h ec - t e r m i n u so ft h ec a s p a s e - 3s m a l ls u b u n i ti n c l u d i n g r e s i d u e s2 2 0 - 2 4 5 k e yw o r d s c a s p a s e 一3 ，n e s ，n l s 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c a s p a s e - 3 细胞定位信号的检测与分析 前言 自2 0 世纪7 0 年代提出细胞凋亡这一概念后，人们对细胞凋亡的认识逐渐深 入，对细胞凋亡发生分子机理的了解越来越深入，这一过程远非原来想象的那样 简单，而是具有非常复杂的调控机制。截止目前已在凋亡信号转导途径、细胞凋 亡的生化反应以及细胞凋亡的基因调控机制等方面都取得了显著的进展i 它们包 括：了解了细胞凋亡进程中重要的执行者( e x e c u t i o n e r ) c a s p a s e s ( c y c t e i n e a s p a r t i c a c i d s p e c i f i cp r o t e a s e ) ；线粒体与细胞凋亡进程密切相关；获得了若干 重要的细胞凋亡调控基因。 细胞内外的许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡，如相应配体结合死亡受体 如f a s 、t n f r ；紫外线照射和电离辐射、抗癌药物、生长因子缺乏、过度表达某 些特定的癌基因和抑癌基因等。尽管这些信号以及随后的反应途径多种多样，但 现已公认细胞凋亡后期的共同途径是c a s p a s e s 的激活。 c a s p a s e s 是一类进化上保守的、特异切割靶蛋白天冬氨酸残基羧基构成的肽 键的半胱氨酸蛋白酶。功能上，活化的c a s p a s e s 可以酶解细胞调节、细胞信号转 导、d n a 修复、组织平衡、细胞存活等过程中的重要蛋白，从而使细胞表现出凋 亡特有的形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，d n a 降解，以及随 后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。c a s p a s e s 在氨基酸序列、结构和底物特 异性上具有一致性。单链c a s p a s e s 酶原包含三个结构域：n 端原域( p r o d o m a i n ) 、 大亚基结构域( 2 0 k d ) 和小亚基结构域( 1 0 k d ) 。c a s p a s e s 酶原的激活需要进行 切割，产生的大小亚基形成异源二聚体，两个异源二聚体进而形成具有两个独立 活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。完成这个切割的可以是c a s p a s e s ，也可 以是其它的蛋白酶如g r a n z y m eb 。活化的最后导致细胞凋亡。虽然仍有许多地方 需要进一步研究，但在已经查明的4 0 个左右c a s p a s e s 的底物中，已经证实有些 底物水解和最后的细胞凋亡直接相关。可以说c a s p a s e s 的作用在细胞凋亡过程中 处于中心地位。 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c a s p a s e s 分为起始c a s p a s e s ( i n i t i a t o rc a s p s e s ) 和执行c a s p a s e s ( e x e c u t i o n e r c a s p a s e s ) 。两者结构上基本相似，但前者的n 端原域较后者的长。功能上前者可 以激活后者以启动凋亡效应，使细胞最终凋亡。 c a s p a s e 3 是执行c a s p a s e ，是内外源性凋亡途径共同激活的第一个效应执行 c a s p a s e ，在细胞凋亡的形态学变化和生化变化中起重要作用，如染色质凝集、d n a 片段化、凋亡小体的形成等 1 ，2 】，因此c a s p a s e 3 受到重视并被深入研究。 c a s p a s e 3 酶原在2 8 和1 7 5 位被起始者c a s p a s e s 切割成大小两个亚基，该两亚基 与另外一被切割的大小亚基共同组成异源四聚体，这就是c a s p a s e 3 的活化形式。 虽然c a s p a s e 3 前体存在于胞质中，但是发挥其凋亡效应在胞核内【3 】。有证据证 实c a s p a s e 3 的底物大多数存在于胞核中【4 9 】，这表明活化的c a s p a s e 3 必须进入 胞核中才能酶解其底物，执行凋亡效应。因此c a s p a s e 3 在凋亡诱导活化后应该 从胞质转入胞核中，而有文献证实这种跨核膜转运是主动运输并非被动扩散 1 0 、 1 1 。 大分子物质( 4 0 k d ) 如蛋白质出入胞核需要核定位信号( n l s ) 或核输出 信号( n e s ) ，而一些穿梭蛋白既有n l s 又有n e s 。n l s 和n e s 是另一种形式的 信号肽，与导肽的区别在于：由含水的核孔复合物通道来鉴别；信号是蛋白 质的结构的一部分，入核或出核后并不被切除，可重复使用 1 2 、1 3 。 目前文献报道认为c a s p a s e 3 没有典型的n l s 信号，也未见有报道关于其 n e s 相关的实验与文献【1 0 、1 1 】，故本文从构建一系列含c a s p a s e 3 不同区段的缩 短突变体，与g f p 融合表达，根据其在细胞内的具体位置，逐步确定其是否含 有n e s ( 由于是截短突变体，故可同时验证文献所报道的关于n l s 的结论) 。 首先利用n e t n e s 软件( h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s n e t n e s 一1 1 ) 1 4 、1 5 】对c a s p a s e 一3 的氨基酸序列进行分析，结果发现它含有5 个可能的n e s 信号序列，而其中分值最高的，即n e s 可能性最高的信号序列n e s 4 位于小亚 基后半段。( 图1 ) 然后以c a s p a s e 3 前体的大小亚基为划分基础，结合上述n e s 信号所处位置， 设计一系列截短片段，插入g f p 载体中构建融合表达载体，克隆并转染合适的细 胞株观察荧光报告蛋白g f p 的胞内定位情况，以确定其所n e s 信号( 可能有多 个) 及具体位置；待得到初步阳性结果后可以进步缩短目标片段直至得到完整 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 的n e s 信号区段。 本文从c a s p a s e 一3 的n l s 和n e s 信号着手，以期将来能够进步了解 c a s p a s e 一3 活化后进入细胞核机制，这将为完整地理解c a s p a s e 一3 的执行凋亡效应 的过程奠定基础，也将为理解其他类似的c a s p a s e s 的结构和功能提供启示。 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分：含六个c a s p a s e - 3 截短突变体的载体构建 与细胞转染 1 实验材料 1 1 菌株、工具酶与试剂 p e g f p c 2 购自c l o n t e c h ，高保真p y r o b e s t 酶、d n t p 、限制性内切酶等购自 t a k a r a 公司，酵母提取物和胰化蛋白胨购自o x o i d 公司，细胞培养基购自g i b c o 公司，g e le x t r a c t i o nk i t 购自a x y g e n 公司，质粒d n a 小量抽提试剂盒购自 a x y g e n 和p r o m e g a 公司，i p t g 购自s i g m a 公司，w e s t e m b l o t 的一抗购自s i g m a 公司，二抗和显色试剂购自p i e r c e 公司。其余试剂均为分析纯。 1 2 仪器设备 电泳仪d y y - i 北京六一仪器厂 高速冷冻离心机o p t i m a l 8 0x p 美国b e c k m a n 公司 台式高速离心机 德国e p p e n d o r f 公司 超净工作台中国苏净公司 荧光显微镜德国z e i s s 公司 微量加样枪 德国e p p e n d o r f 公司 p c r 仪 德国e p p e n d o r f 公司 恒温空气浴摇床中国哈东联公司 c 0 2 培养箱美国n u a i r e 公司 d n a 电泳凝胶扫描成像系统美国u v p 公司 荧光显微镜图像采集分析软件德国z e i s s 公司， 紫外分光光度计日本日立公司 1 3 实验所用到的试剂及其配制 1 l b ( 液) ：1 t r y p t o n e ，o 5 y e a s te x t r a c t ，1 n a c i ，p h 7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 l b ( 固) ：1 t r y p t o n e ，0 5 y e a s te x t r a c t ，1 n a c i ，p h 7 0 ，1 5 a g a r ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 3 t eb u f f e r ：lo m m o l l ir i s 。h c i ，lm m o l le d t a ( p h 8 0 ) 4 d m e m 培养基配制：一袋d m e m ( h ) 粉末培养基融入1 0 0 0 m l 超纯水中， 另加2 2 0 0 0 9 n a h c 0 3 、4 0 0 0 0u n i t 庆大霉素，以1 mh c l 调节p h 至7 2 7 4 。过 滤除菌。 5 1 0 d m e m 培养基配制：按1 0 比例加入b s a 于d m e m 中。 6 0 2 5 胰酶0 0 4 e d t a 溶液： t r y p s i n ( d i f c ol ：2 5 0 ) 2 5 0 0 9 n a c i 7 0 0 0 9 g l u c o s e 1 0 0 0 9 i r i s 3 0 0 0 9 e d t a 0 4 0 0 0 9 k c l 0 3 7 0 0 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 0 3 0 0 0 9 k h 2 p 0 4 0 2 4 0 0 9 酚红000109 庞太霉苤垒q q q q 堕 以1 mh c i 调节p h 至7 2 7 4 并用超纯水定容至1 l h 2 0 7 5 p b s 缓冲液： 2 实验方法 n a c l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 k c l 4 0 0 0 0 9 7 1 6 0 9 1 0 0 0 0 9 ! 邕至q 垒 ! ：q q q q g 用超纯水定容至l l 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 1 c a s p a s e 一3 的c 3 l 、c 3 s 、c 3 l f 、c 3 l l 、c 3 s f 、c 3 s l 六个 片段的扩增与质粒构建 1 12 1 1 片段扩增 c a s p a s e 一3 利用r t - p c r 从h e l a 细胞c d n a 中扩增获得，e c o r v s a l i 酶切连 入p e g f p c 2 载体，本实验室长期保存该模板。c 3 l 、c 3 s 、c 3 l f 、c 3 l l 、c 3 s f 、 c 3 s l 六个截短片段即以此为模板扩增，以后其他截短片段亦以此为模板。 ( 1 ) 引物： c 3 lf ：5 t c c g m 丁亿a t g g a g a a c a c t g aa aa c t c3 c 3 s r ：5 a r c g 陀g 么c a c c t c a g t c t g t c t c a 气t3 f ：5 a t t g j 似眦a t g a g t g g t g t t g a t g a = r g a c a t3 r ：5 a a g g 7 g 4 c r c a g t g a l a a a a a t a g a g t t c t t3 c 3 l ff ：5 t c c g a i 眦a t g g a g a a c a c t g a a a a c t c3 r ：5 a t c g 刀c ? g 4c r c a a a c a t c a c g c a t caa 丌c c a c3 c 3 l lf ：5 g t g g a a 丁陀a t g c g t g a t g t t t c t a a a g3 r ：5 a t c g 刀c g 么c a c c t c a g t c t g t c t c a a r3 c 3 s ff ：5 a 订g a a 册a t g a g t g g t g t t g a t g a t g a c a t3 r ：5 c t g g 死矧c c t a g g c a c a a a g c g a c t g g a r g a3 c 3 s lf ：5 a t c g 似册a t g t g t g c c a t g c t g a a a c a g l a3 r ：5 a a g g 力：g 爿c t c a g t g a t a a a a p 汀a g a g t t c t t3 ( 2 ) 5 0pl 反应体系： d d h 2 0 1 0 x p c rb u f f e r d n t p p i ( 5 0 um o l d ) p 2 ( 5 0 um o l 1 ) t e m p l a t e p f u 聚合酶 ( 3 ) 反应条件： 3 7 5 | ll 5ul 5ul o 5| ll 0 5ul 0 5ul 1i ll 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 9 4 预变性5m i n ；9 4 。c 变性3 0 s e c ，5 3 退火3 0 s e e ，7 2 延伸3 0 s e c ，共3 0 个循环；7 2 * ( 2 总延伸1 0m i n ：反应结束后取产物在1 的琼脂糖凝胶中电泳。 ( 4 ) 鉴定扩增出与预期相应大小的d n a 片段后，用g e le x t r a c t i o nk i t 按说 明书操作，纯化回收p c r 产物以待酶切连接。 1 22 1 2 质粒构建 ( 1 ) 双酶切载体p e g f p c 2 和六个片段 载体p e g f p - c 2 片段( 6 个) d d h 2 01 7 6 9 l l 10 x b u f f e r2m2 山 d n a0 2g i ( 0 8 一l p g ) 1 6 8 山( 1 t g ) e c o r l 0 6 山( 1 5 u r t l ) 0 6 山( 1 5 u 仙1 ) s a l l 0 6 山( 1 5 u 4 t 1 ) 0 6l x l ( 1 5 u 9 1 ) 2 0 1 体系3 7 水浴4 h ( 2 ) 酶切片段电泳及回收 将酶切产物在1 的琼脂糖凝胶中电泳，用g e le x t r a c t i o nk i t 按说明书操作， 纯化回收酶切产物。 ( 3 ) 连接反应 连接体系( 6 个)对照体系( 1 个) d d h 2 05 1 a l1 3 1 s l 1 0 x b u 彘r 2 p 1 2 1 b v e c t o rd n a 3 p 1 ( 5 0 n g )3 i l l ( 1 i _ t g ) i n s e r td n a 8 山( 1 0 0 n g ) | p e g 4 0 0 0 2 a2 a l 1 4d n a l i g a s e2 1 s l ( 1 u 9 1 )2 “l ( 1 u l - t 1 ) 2 2 “1 体系2 2 水浴1 h ( 4 ) c a c l 2 法制备大肠杆菌d h 5q 感受态细胞 1 器皿和溶液的准备：配制5 0 0 m ll b ，1 2 0 1 5 m i n ；配制1 mc a c l 23 0 m l ， 过滤除菌；2 个2 5 0 m l 低温高速用离心瓶( 内装去离子水) 1 2 0 1 5 r a i n ；2 8 0 m l 去离子水1 2 0 1 5 m i n ；1 0 m l 移液管至少4 支1 2 0 1 5 m i n 。 2 感受态细胞的制备：取1 支约2 0 0ul 的d h 5q 细菌倒入5 0 0 m ll b 中，3 7 2 5 0 r p m 振摇约4 5 h ，培养至o d 6 0 0 = 0 6 0 7 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 将5 0 0 m ll b 置于冰中，1 0 m i m 分装入2 个2 5 0 m l 离心瓶中，4 c6 0 0 0 r p m1 0 m i n 置于冰上 弃上清，各加入5 0 m l0 1 m ( 由1 m 稀释而来) 的c a c l 2 ，吹吸重悬完全后置 于冰上 i 4 c6 0 0 0 r p m1 0 m i n 置于冰上 弃上清，倒置控干l m i n ，置于冰上 加入2 0 m l0 1 m ( 由l m 稀释而来) 的c a c l 2 ，吹吸重悬完全 加入3 5 m l 灭菌甘油使甘油浓度达1 5 ，吹吸重悬完全 于冰上分装至1 5 m l 离心管中，2 0 0u1 管，液氮速冻后存于一8 0 c 3 连接产物转化感受态细胞 将感受态细胞d h 5q 从一8 0 c 取出，室温中快速融化，冰浴；将2 2 ul 连接 产物加入其中，轻拍混匀。 冰浴3 0 m i n 4 2 。c 热休克9 0 秒，立即放入冰浴中，5 m i n 加入8 0 0ull b ，2 0 0 r p m ，4 0 m i n 取5 0 1 0 0i l1 菌液涂布于含卡那霉素( 1 2 5 u m 1 ) 的l b 平板 1 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 7 孵育过夜 i 挑取阳性菌落于5 m l 含卡那霉素( 1 2 5 u m 1 ) 的l b 液中，2 5 0 r p m ，至 o d 6 0 0 = 0 5 4 p c r 鉴定重组菌 l opl 反应体系，其中l u l 为菌液。先配好相应的m i x t u r e 溶液，如下：将 每1 0ul 反应体系中d d h 2 0 、1 0 p c r b u f f e r 、d n t p 、p 1 、p 2 所占的量乘以待鉴 定重组菌个数即得。然后进入p c r 循环，产物电泳鉴定，取其中阳性者送北京诺 赛基因生物研究有限公司测序，并保存菌株。 2 2 含c a s p a s e - 3 的c 3 l 、c 3 s 、c 3 l f 、c 3 l l 、c 3 s f 、c 3 s l 六 个截短片段的质粒行细胞转染 2 2 1h e l a 传代细胞的准备 传代：3 7 c 快速解冻h e l a 细胞，转入无菌间，1 0 0 0 r p m4 m i r a 弃上清，加 l m l 含1 0 d 牛血清d m e m 培养基，轻吹重悬，转入1 2 孔板培养，可适量补加 培养液于各孔中，3 7 、5 c 0 2 培养箱过夜；次日去培养基加入l m i 孑lp b s ， 洗去残余培养基然后弃去，加0 5 m l 胰酶于其中，3 7 c 、5 c 0 25 m i n ，加l m l 含1 0 d x 牛血清d m e m 培养基终止反应，转至1 5 m l 离心管1 0 0 0 r p m4 m i n ，弃 上清加2 m l 培养基重悬，转入1 2 孔板中，2 0 0l al 孔，另加3 5i i l l 培养基孔。 细胞在转染前4 8h 传代，待细胞密度达5 0 6 0 满底时即可进行转染。 2 2 2 d n a 沉淀