（生物化学与分子生物学专业论文）13c代谢通量分析平台的建立和改良.pdf

摘要 摘要 近十年来，系统生物学的概念和理论得到了迅速的发展，系统生物学的研究 如火如荼地开展。系统生物学的核心是要整合各个层面，各个构成要素的知识。 这些层面当中，除开耳熟能详的基因组，转录组，蛋白质组和代谢组外，通量组 ( f l u x o m e ) 成为越来越重要一个组成部分。 对这个体系的研究产生了新的组学，即代谢通量组学( f l u x o m i c s ) 。其重点是 对目标体系内的代谢通量的速度的方向和取值进行测定。所获得的信息对刻画生 物系统的生理特性、评估遗传和环境对细胞的影响具有重要意义。 代谢通量组学的主要研究手段是代谢通量分析，它可以分为纯计量性代谢通 量分析和”c 代谢通量分析两类。其中1 3 c 代谢通量分析是近十多年来，国际上 新发展并仍然处于发展当中的技术。它除开具有纯计量性代谢通量分析的能力 外，还具有获取信息更多，适用范围更广的优点。它能获得代谢途径的交换通量， 并且不依赖于除稳态假设外的其他生理假设，因而适用各种试验条件。但是对于 1 3 c 代谢通量分析技术，国内还未见有博士论文专题研究。 本博士论文的内容主要分成二部分，一部分描述在中国科技大学建立1 3 c 代 谢通量分析平台的工作，另一部分是对通量分析平台中的1 3 c 质量同位素异构体 检测技术进行改进的工作。 第章详细介绍了1 3 c 代谢通量分析的基本理论。 代谢通量分析的基础是代谢通量拟稳态假设。在此假设基础上，可以建立各 个代谢物的物质平衡方程。1 3 c 代谢通量分析实验在培养底物里引入不完全的1 3 c 标记。1 3 c 会分布到所有代谢物中，而由于1 3 c 在代谢物中数量和位置的不同， 可以得到同一种物质的不同的1 3 c 同位素异构体和质量同位素异构体( 同位素异 构体的类特殊组合形式) 。从同位素异构体概念出发，通过原子转移矩阵和同 位素异构体转移矩阵，可以将物质平衡方程推广到同位素异构体守恒方程。通过 对中间代谢物建立同位素异构体守恒方程组，可以得到代谢通量和代谢物的同位 素异构体分布之间的确定但是隐式的关系。这个关系是个较为复杂的多元二次 方程组。当我们测量了同位素异构体分布的信息，依据此大规模的方程组和参数 i 摘要 优化的数值方法，可以反推出代谢通量。同时，通过构建理论的测量值空间，利 用m o n t ec a r l o 采样，仿照此求解过程，可以估计代谢通量的置信区间。 第二章的主要内容是1 3 c 通量分析平台的建立和实例研究。 第二章的第一部分详细介绍了1 3 c 代谢通量分析的检测技术。 首先，详细介绍了1 3 c 标记技术，这是进行1 3 c 代谢通量分析的基础。对于 估计最后的代谢通量而言，我们还需要获取两方面的信息。一方面是关于同位素 异构体比例的信息。通过核磁( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e , r ) 波谱，可以获得 特定的同位素异构体组合的比例信息。这包括j - r e s o v l e dh s q c 脉冲序列，它主 要用于测量单键相连接的1 3 c 异构体组合。通过质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y , m s ) ，可 以测量质量同位素异构体比例的信息。另一方面是关于代谢物流出代谢体系的量 值信息。一部分中间代谢物的流出量值通过细胞的生物质的质量和成分构成；还 有一部分中间代谢物的流出量值，通过测量这些中间代谢物在培养液中的残留浓 度来获取。最后介绍了参数优化的目标函数和置信区间估计的方法。 第二章的第二部分，以连续培养的大肠杆菌j m l 0 1 株的代谢通量分析为例 子，描述了连续培养下进行1 3 c 代谢通量分析的完整流程，也就是1 3 c 代谢通量 分析实验平台的建立和实现。 第三章阐述了对1 3 c 质量同位素异构体检测技术所作的改进。改进后的方法 可以提高质量同位素异构体比例的测量确度，从而提高1 3 c 代谢通量分析的准确 度。 第三章的第一部分首先粗略地介绍了质谱测量的原理和基本过程。然后按照 测量发生的顺序，介绍了质谱仪的基本的结构和功能单元。这些单元包括进样器， 离子源，质量分析仪和信号检测器。之后论文较为详细地描述了用于气质联用的 衍生化方法，特别是氨基酸的特丁基二甲基硅烷衍生化方法。最后，仔细地讨论 了用以解决重同位素引起的质量位移作用的数学框架修正举证。 第三章的第二部分首先详细介绍了用质谱进行1 3 c 质量同位素异构体检测的 基本假设，并对该假设进行了数学化的描述。利用该数学描述，对之前的各种提 高质谱测量确度的方法进行了分类和描述。之后则介绍了如何提高1 3 c 质量同位 i i 摘要 素异构体测量确度的方法。利用已知了同位素异构体比例的样品，作为标准样， 制作任意质谱仪的校准曲线，是一种最具有广泛性的提高测量精度的方法。我们 使用以甲醇作为碳源的嗜甲基菌m e t h y l o b a c t e r i u ms a l s u g i n i ss p ，将其在排除了 天然c 0 2 的环境下，以1 3 c 标记的甲醇作为唯一碳源来进行培养。产生的各种生 成物的同位素异构体比例可以用二项式公式来计算。我们引进一个新的量，它是 两个连续的质量同位素异构体( 1 3 c 原子数目相差1 ) 的比值，由此避开了对多维向 量进行校准的麻烦。而且，我们后验地测定每个产物的整个分子的平均1 3 c 比例， 从而使得生物同位素效应的对1 3 c 分布不均匀性的影响降至最低。 第三章的第三部分则是对第二部分理论的实验实现，包括实验程序，理论模 拟和结果讨论。经过校准后的结果，其绝对误差都小于0 9 m 0 1 ，比未校准的结 果有明显进步。而且，若采用理想的实验步骤，则误差可预计下降到0 4 m 0 1 以 下。 在n cm f a 平台上，我们分析研究了大肠肝菌中心代谢通量在超氧化应激 情况下的变化情况。这部分内容是由芮斌同学和我共同完成的，请参看芮斌同学 的博士论文。 此外，我们还进行了“不同剂量的氧化剂引起代谢系统不同强度反应”的研 究，正在成文中。 关键词：n c 代谢通量分析，代谢组学，系统生物学，质量同位素异构体测 量，生物合成样品，校准曲线，质谱。 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h ec o n c e p ta n dt h e o r yo fs y s t e m sb i o l o g yh a v eb e e nu n d e r g o i n g am a j o rd e v e l o p m e n ti na c c o r d a n c ew i t hi t sw i d ea p p l i c a t i o ni nv a r i o u sa r e a s t h e c o r eo ft h i sn e w l ye s t a b l i s h e dd i s c i p l i n ei st h ei n f o r m a t i o ni n t e g r a t i o na c r o s sd i f f e r e n t “o m e s ”a m o n gt h e s eo m e s ，t h ef l u x o m eh a sp l a y e da l li n c r e a s i n g l yi m p o r t a n tr o l ei n l i n k i n go m e so fd i f f e r e n tl e v e l i n v e s t i g a t i o n o ff l u x o m e g i v e s b i r t ht ot h ef l u x o m i c sw h i c ha i m sa t q u a n t i t a t i v e l ya n a l y z i n gt h e d i r e c t i o na n dq u a n t i t yo fm e t a b o l i c f l u x i n s i g h t s a c q u i r e df r o mf l u x o m i c sw o u l db eo fs i g n i f i c a n tb i o l o g i c a li m p o r t a n c ef o rd e p i c t i n g t h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i co fc e l la sw e l la sa s s e s s i n gt h ei n f l u e n c eo ft h eg e n e t i c a n de n v i r o n m e n t a lm a n i p u l a t i o n so nc e l l t h ep r i m a r yt e c h n i q u ef o rf l u x o m i c si sm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，w h i c hc o n s i s t s o fs t o i c h i o m e t r ym e t a b o l i cf l u xa n a l y s i sa n d1 3 cm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ( 1 3 cm f a ) 1 3 cm f ah a sb e e nt h er e s e a r c hh o t s p o to fm e t a b o l i ce n g i n e e r i n gi n t e r n a t i o n a l l yd u e t oi t sa c c u r a c ya n da p p l i c a b i l i t y h o w e v e r , t h e r ei sn od o m e s t i cd o c t o r a t et h e s i s c o n c e r n i n ga b o u t1 3 cm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s t h i sp h dt h e s i sc o n s i s t so ft w op a r t s t h ef i r s tp a r td e t a i l st h ef u n d a m e n t a l p r i n c i p l eo f1 3 cm f aa n dt h ei m p l e m e n t a t i o no fi t se x p e r i m e n t a lp l a t f o r m t h e s e c o n dp a r td e s c r i b e sam e t h o dt oi m p r o v et h em e a s u r e m e n ta c c u r a c yo f1 3 cm a s s i s o t o p o m e ra n a l y s i s c h a p t e rli l l u s t r a t e st h ef u n d a m e n t a lp f i n c i p l eo f1 3 cm f a t h ef i r s tp a r to fc h a p t e r1d e s c r i b e st h ef u n d a m e n t a lp r i n c i p l eo f1 3 cm f a 1 3 c m f ai n t r o d u c e sp a r t i a l1 3 cl a b e l i n gi nc u l t i v a t i o ns u b s t r a t e 1 3 cw i l ld i s t r i b u t ea m o n g i n t e r m e d i a t e sa n dm e t a b o l i t e sa n dr e s u l t si nd i f f e r e n ti s o t o p o m e rd i s t r i b u t i o n s t a r t i n g f r o mt h e c o n c e p to fi s o t o p o m e r , t h em a s sb a l a n c er e l a t i o n s h i pc o u l db ee x t e n d e da s i s o t o p o m e r sb a l a n c er e l a t i o n s h i pw h i c hr e l a t e st h em e t a b o l i cf l u xw i t ht h ei s o t o p o m e r i v a b s t r a c t d i s t r i b u t i o no fi n t e r m e d i a t e sa n dm e t a b o l i t e s i s o t o p o m e r sb a l a n c er e l a t i o n s h i pi sa c o m p l i c a t e ds q u a r ee q u a t i o no fm u l t i p l ev a r i a b l e s b a s e do nt h e s ee q u a t i o n s ，t h e m e t a b o l i cf l u xq u a n t i t yc o u l db ed e d u c e df r o mt h em e a s u r e di s o t o p o m e ri n f o r m a t i o n t h r o u g he v o l u t i o na l g o r i t h mb a s e dp a r a m e t e ro p t i m i z a t i o n a f t e r w a r d s ，w ec o u l d c o n s t r u c tt h et h e o r e t i c a lm e a s u r e m e n ts p a c ea n dq u a n t i f yt h ec o n f i d e n c ei n t e r v a lo f e s t i m a t e df l u xv a l u eb ym o n t ec a r l os a m p l i n g c h a p t e r2f o c u s e so nt h ei n t r o d u c t i o na n di m p l e m e n t a t i o no fe x p e r i m e n t a l t e c h n i q u ef o r 1 3 cm f a t h ef i r s tp a r to fc h a p t e r2d e s c r i b e se x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e sw h i c ha r en e c e s s a r y f o r1 3 cm f a t h e1 3 cl a b e l i n gt e c h n i q u ei st h eb a s i sf o r1 3 cm f a t oe s t i m a t et h ei n t r a c e l l u l a r m e t a b o l i cf l u xv a l u e ，i n f o r m a t i o no fi s o t o p o m e rd i s t r i b u t i o na sw e l la st h e i n f o r m a t i o no ft h em e t a b o l i t e se f f l u xm u s tb eo b t a i n e d t h ei n f o r m a t i o no fs p e c i f i c i s o t o p o m e r sc a nb ea c q u i r e dt h r o u g hn m r m e a s u r e m e n t s j - r e s o l v e dh s q cc o u l db e u s e dt oa n a l y z et h ei s o t o p o m e r sc o n t a i n i n gd i r e c t l yc o n n e c t e dc a r b o n - c a r b o nb o n d t h em a s si s o t o p o m e rd i s t r i b u t i o nc o u l db eq u a n t i f i e db ym sm e a s u r e m e n t t h e m e t a b o l i t e se f f l u xi st h eo t h e rk i n do fi n f o r m a t i o nn e c e s s a r yf o r1 3 cm f a e f f l u x v a l u eo fs o m ec e r t a i nm e t a b o l i t e sc o u l db ed e t e r m i n e db ya n a l y s i so ft h ea c c u m u l a t e d a m o u n ta n dt h ec e l l u l a rc o m p o s i t i o no fb i o m a s s b e s i d e s ，q u a n t i t a t i v e l ya n a l y z i n gt h e r e s i d u a lc o n c e n t r a t i o nc o u l dd e t e r m i n ee f f l u xv a l u eo fo t h e ri n t e r m e d i a t e sa n d m e t a b o l i t e s a tt h el a s t s t a g e ，t h eo b j e c t i v i t y f o r p a r a m e t e ro p t i m i z a t i o na n d c o n f i d e n c ei n t e r v a le s t i m a t i o nm e t h o da r ep r e s e n t e d t h es e c o n dp a r to fc h a p t e r2i se x h a u s t i v ee x p e r i m e n t a lp r o t o c o lo f1 3 cm f ai n c o n t i n u o u sc u l t i v a t i o n t h a ti st h ef i r s ti m p l e m e n t a t i o no f1 3 cm f a p l a t f o r mi n i i s t c c h a p t e r2d e s c r i b e st h es e c o n dp a r to fo u rw o r kt h a ti st h ei m p r o v e m e n to f m e a s u r e m e n ta c c u r a c yo f1 3 cm a s si s o t o p o m e ra n a l y s i sh e n c et h ef l u xa c c u r a c yo f 1 3 cm f a v a b s t r a c t t h ef i r s tp a r to fc h a p t e r2i n t r o d u c e sc o n c i s e l yt h ep r i n c i p l ea n dp r o c e s so fm s m e a s u r e m e n t t h e nt h eb a s i cs t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lu n i t so fm si n s t r u m e n ta r e d i s c u s s e d t h e s eu n i t si n c l u d e s s a m p l e si n t r o d u c t i o n ，i o n i z a t i o ns o u r c e ，m a s s s e p a r a t i o na n ds i g n a ld e t e c t i o n a d d i t i o n a l l y , t h ed e r i v a t i z a t i o nm e t h o d s ，e s p e c i a l l y t h et m b d m s d e r i v a t i z a t i o nf o rg c m s ，a r ei l l u s t r a t e d d e t a i l e d l y t h e n a m a t h e m a t i c a lf r a m e w o r k ，c o r r e c t i o nm a t r i x ，i sd e s c r i b e dt oa d d r e s st h em a s ss h i f t e f f e c ti n t r o d u c e db yh e a v yi s o t o p e si nn o n s k e l e t o nc a r b o n t h es e c o n dp a r to fc h a p t e r2f i r s t l yd e s c r i b e si np a r t i c u l a rt h eb a s i ca s s u m p t i o n f o r1 3 cm a s si s o t o p o m e ra n a l y s i sb ym sm e a s u r e m e n t t h e nw er e s t a t et h i s a s s u m p t i o ni nam a t h e m a t i c a lf r a m e w o r k b a s e du p o nt h i sm a t h e m a t i c a lf r a m e ，w e c a ne a s i l y c l a s s i f y a n dd e p i c tt h ep r e v i o u sm e t h o d so fi m p r o v i n gt h em s m e a s u r e m e n ta c c u r a c y t h e s em e t h o d su t i l i z el i n e a r e x t r a p o l a t i o n ，n o n l i n e a r r e l a t i o n s h i po rt h e o r e t i c a lc o r r e c t i o n t h e s em e t h o d si n d e e dp r o d u c ea c c u r a t er e s u l t s t h a ns i m p l em e a s u r e m e n t h o w e v e r , t h e yh a v eas h a r e ds h o r t c o m i n gt h a tt h e ya l e i n s t r u m e n ts p e c i f i c t h es e c o n dp a r td e s c r i b e sh o wt oi n c r e a s et h ea c c u r a c yo fm a s si o t o p o m e r a n a l y s i st h r o u g hc a l i b r a t i o n c u r v e sc o n s t r u c t e du s i n gb i o l o g i c a l l y s y n t h e s i z e d c o m p o u n d s u s i n gt h ec o m p o u n d s 、i mk n o w ni s o t o p o m e rd i s t r i b u t i o n a st h e s t a n d a r ds a m p l eo n ec o u l dp l o tc a l i b r a t i o nc u r v ef o ra n yi n s t r u m e n t t h u s ，t h e c o r r e c t i o nm e t h o dr e l y i n go nc a l i b r a t i o nc u r v ew o u l db eag e n e r a lm e t h o dt h a ti s u n i v e r s a l l ya p p l i c a b l et om sm e a s u r e m e n t s t h eb a c t e r i u ms t r a i nm e t h y l o b a c t e r i u m s a l s u g i n i ss p n o v i sc u l t i v a t e dw i t hp a r t i a l l y1 3 cl a b e l e dm e t h a n o la st h eo n l yc a r b o n s o u r c et op r o d u c e1 3 ce n r i c h e dc o m p o u n d s t h er e s u l t i n gp r o d u c ti s o t o p o m e r so b e y b i n o m i a ld i s t r i b u t i o n w ei n t r o d u c e san e wv a r i a b l et or e p l a c et h em a s si s o t o p o m e r d i s t r i b u t i o na so p t i m i z a t i o no b j e c t i v i t yi no r d e rt oc i r c u m v e n tt h ec a l i b r a t i o nf o rm i d m o r e o v e r , p o s t e r i o rm e a s u r e m e n t o fa v e r a g e1 3 ca b u n d a n c em i n i m i z e dt h e i n t e r f e r e n c eo fi n t r a m o l e c u l a ri n h o m o g e n e i t yo f1 3 ci s o t o p ea b u n d a n c e sc a u s e db y b i o l o g i c a li s o t o p ef r a c t i o n a t i o 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l i p l e a s er e f e rt or u ib i n sp h dt h e s i sf o rd e t a i l e dd e s c r i p t i o n b e s i d e s ，w eh a dp e r f o r m e da ni n v e s t i g a t i o nt i t l e d “s e r i a lm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s r e v e a l e dad o s e - d e p e n d e n tr e s p o n s eo fe c o l im e t a b o l i s mt oo x i d a t i v es t r e s s ” k e y w o r d s ：1 3 cm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，s y s t e m sb i o l o g y ，m a s si s o t o p o m e r a n a l y s i s ，b i o s y n t h e t i cc o m p o u n d s ，c a l i b r a t i o nc u r v e ，m a s ss p e c t r o m e t r y v u 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：签字日期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开口保密( 年) 作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 第1 章c 代谢通量分析介绍 第一章1 3 c 代谢通量分析技术的原理综述 1 系统生物学新分支代谢通量组学 1 1 系统生物学，代谢组学，代谢通量组学 1 9 5 3 年沃森和克里克建立了d n a 双螺旋结构模型，生命科学研究开始进入 分子生物学时代分子生物学采取的是还原论的方法，它的基本模式：首先将一 个复杂的事物依据某种原则分成多个小的组成部分，然后进一步将这些组成部分 分成更小的子组成部分，直到能对这些更小的组成部分进行严格而又透彻的分 析，然后在对这些组成部分认识的基础上来了解整个系统。分子生物学使认识复 杂的生命网络成为可能，而对这些复杂过程有了一定认识后却发现分子生物学的 还原论方法面对如此复杂的问题有很大的局限性这种以单个基因，单个代谢途 径或单个生命现象为对象进行的研究不可能为我们提供足够的资料以达成对生 命整体的认识。同时，由于视野的限制，这种还原论的研究还可能被一些假象所 迷惑，使人形成一些错误的认识。 生物学的发展需要新的范式加以推动，系统生物学呼之欲出。系统生物学是 采用系统科学的方法，将生物是作为整体系统来定量研究。它借助多学科交叉的 新技术方法，研究功能生命系统中所有组成成分的系统行为，相互联系以及动力 学特性，进而揭示生命系统控制与设计的基本规律。系统生物学将不仅使我们全 息地了解复杂生命系统中所有成分以及它们之间的动态关系，还可以预测如果这 个系统一旦受到了刺激和外界的干扰，系统未来的行为是什么( n i e l s e na n dj e w e t t ， 2 0 0 8 ) 。 系统生物学的研究内容主要从以下不同的层面展开：l 理解系统的结构。如 基因调控及生化网络，以及实体构造；2 理解系统的行为。定性，定量地分析系 统动力学，并具备创建理论或模型的能力，可用来进行预测；3 理解如何控制系 统。研究系统控制细胞状态的机制：4 理解如何设计系统。根据明确了的理论， 设计，改进和重建生物系以系统和整体为研究目标的系统生物学表现出如下的特 点：l 从整体水平开展研究。系统生物学将生物系统的所有元素( 如基因m r n a 第1 章1 3 c 代谢通量分析介绍 蛋白质蛋白质相互作用等) 一起研究，研究这些元素之间在响应生物或者基因结 构扰动时的关系。这样就可以将不同层次上的信息整合在一起，最终可以在任何 给定的条件下描述生物系统的行为。将来我们可以通过生物修饰或者药物设计出 具有全新性质的生物系统。2 注重对信息方法的利用。系统生物学利用面向信 号和系统的方法研究细胞内，细胞与细胞之间的动态过程。3 采用建模分析的方 法，在实际应用过程中的意义通常是数学建模和模拟。 而系统生物学得以发展的基础前提是海量的组学数据。这些组学数据中，除 开耳熟能详的基因组，转录组，蛋白质组和表型组外，代谢组( m e t a b o l o m e ) 和代 谢通量组( f l u x o m e ) 成为越来越重要的组成部分( s a u e r , 2 0 0 6 ) 。 与代谢组相对应的是代谢组学( m e t a b o n o m i e s ) ，其重点是对目标体系内的所 有代谢物进行定性和定量，所关注的是整个代谢物组的变化( w a n g e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 而与代谢通量组学相对应的是代谢通量分析( m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，m f a ) ，而 相比于基因组，转录组，蛋白组等信息，代谢通量数据有着自身的优势( w i e c h e r t ， 2 0 0 1 ) 。因为代谢通量分布直接刻画了生物体生理状态，是遗传、代谢调控和环 境等因素综合作用的结果，而其它组学只是分别从各自的角度描述了生命系统 ( z a m b o n ia n ds a u e r , 2 0 0 9 ) 。将通量组信息与其它组学信息( 基因组，转录组，蛋 白组等) 相结合对细胞进行全面分析已经成为目前和今后研究的一个重要方向。 而m f a 是定量分析稳态条件下微生物代谢系统最有效的方法，适合用来精确地 确定代谢网络中的通量分布，分析系统的代谢能力，评估基因和环境对细胞的影 响等。它以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模 与系统整合为目标的系统生物学的重要研究领域，反映的是外界刺激或遗传修饰 的细胞或组织的代谢系统应答变化。这些信息对刻画生物系统的生理特性、评估 遗传和环境对细胞的影响具有重要意义。 1 2 代谢通量分析及其在代谢工程中的重要意义 不仅仅是系统生物学的发展离不开流量组学。而且，代谢工程的兴起和发展 对作为其基础的流量组学也提出了越来越多的要求。 代谢工程是- f - 用分子生物学原理系统分析细胞代谢途络，并通过d n a 重 组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学 科。1 9 9 1 年，b a i l e y 用代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 的术语来描述利用d n a 2 第1 章”c 代谢通量分析介绍 重组技术对细胞的酶反应，物质运输以及调控，能进行遗传操作，进而改良细胞 生物活性的工程( b a i l e y , 1 9 9 1 ) 。这被认为是代谢工程向门系统学科发展的转折 点。此后，也开始了对代谢工程的广泛地研究。代谢工程的一个崭新观点是关注 代谢途径的组合而非单一的反应。因此它必须考察完整的生化反应网络，重视途 径和目标产物的热力学可行性，代谢通量及其控制。 对于新兴的代谢工程而言，代谢通量分析是一个基础，并且广泛有用的工具。 它正处于一个蓬勃发展的时期，将为未来的代谢组学，以及其与其他组学融合形 成的系统生物学的发展提供重要的支持。 细胞体内各代谢途径通量的定量化表征是细胞生理学和代谢工程的重要目 标尤其是生物活性物质的大规模发酵生产过程中，对实现底物高效转化为目标产 物具有指导意义。 代谢通量分析作为一种专门对代谢途径流量进行测定分析的方法。在测定胞 外物质的基础上，通过细胞内各种生化反应的化学计量可以计算出胞内各物质的 流量分。相比之下细胞物质外流通量是通过对细胞底物摄取率及产物分泌率的测 定而获得的。代谢通量分析最终任务是绘制完整的代谢过程流量图，该图包括由 各相关反应组成的完整代谢途径及各代谢物在稳定态时的流量精细分布。 代谢通量分析除了能定量地描述各个代谢反应外，还有以下几个作用： ( 1 ) 在细菌培养过程中使用特定的突变株或直接改变操作条件往往会导致 节点处物流量分配发生变化，通过分析比较这种变化可以确定该节点的刚柔属 性。通常刚性节点的分支流量不会发生较大的改变，而柔性节点分支流量会随着 环境或细胞性状改变进行相应调节。因此准确界定代谢网络中的刚性节点和柔性 节点对途径操作的设计有非常重要的作用。 ( 2 ) 选择途径的辨别 生化反应的化学计量是细胞代谢通量分析的基础，而精确的化学计量又需要 对相关生化反应详细背景知识的了解。然而在许多微生物细胞中，生化反应的分 子机制并不是非常清楚。代谢通量分析能够帮助人们辨别哪些途径对产生目标产 物最优，哪些选择则在物料平衡状态下是不可实现的。从而保证靶途径确定的准 确性和有效性。 ( 3 ) 非测量性胞外物质流量的计算 有时可测定的胞外流量数相对于需通过计算才能获得的胞内流量数是非常 小在这种情况下根据先前实验结果建立起来的流量分割率可以直接计算非测量 第1 章1 3 c 代谢通量分析介绍 性物质的流量。例如，目标产物相对于副产物的生成速率即可通过化学计量及已 测定的代谢通量推算而得。 系统研究代谢通量及其控制机制有三大基本步骤： 第一，建立一种能尽可能多地观察途径并测定其流量的方法。为了做到这一 点，通常从测定细胞外代谢物的浓度入手进行简单的物料平衡。这里必须强调的 是一个代谢途径的代谢通量并不等于该途径中一个或多个酶的活性。事实上酶法 分析并不能提供途径真正的代谢通量信息，除非相应的酶在体外分析条件下存在 并具有活性。在代谢分析中酶法分析经常会错误地显示相似数量级的代谢流，导 致产生不正确的结论。 第二，在生化代谢网络中施加一个已知的扰动以确定在系统松散之后达到 新的稳态时的途径代谢通量。常采用的扰动方式包括启动子的诱导、底物补加脉 冲、特定碳源消除或物理因素变化等。虽然任何有效的扰动对代谢通量的作用都 是可以接受的，但扰动应该定位于紧邻途径节点的酶分子上。一种扰动往往能提 供多个节点上的信息，这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是 至关重要的。 第三，系统分析代谢通量扰动的结果。如果某个代谢通量的扰动对其下游代 谢通量未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是 刚性的，与之相反的情况则称为柔性。在刚性节点处，试图通过改变上游酶活性 来影响下游代谢通量的做法是徒劳的。 2 计量代谢通量分析研究进展综述 代谢通量分析主要可分为两大类：基于计量平衡的m f a 和基于1 3 c 标记实 验( 1 3 c a r b o nl a b e l i n ge x p e r i m e n t ，1 3 c l e ) f 1 9m f a 。前者以通量平衡分析( f l u x b a l a n c ea n a l y s i s ，f b a ) 为代表