（生物化学与分子生物学专业论文）人δ蛋白基因启动子区64位c→t点突变对其转录调控影响的研究.pdf

中国协和医科大学硕士学位论文 人6 珠蛋白基因启动子区一6 4 位c t 螋对其整墨迥拧影响的研究 中文摘要 f i 人6 珠蛋白基因位于1 1 号染色体短臂b 基因簇中1 l rb 基因和9 基 因之间，其表达产物6 珠蛋白与q 珠蛋白的四聚体组成h b a ：( a 。6z ) ， 是成年人次要血红蛋白。6 基因与b 基因高度同源，但6 基因的表达却 只有b 基因的i 5 0 。6 基因表达水平低的原因还不十分清楚。目前认为 限制6 基因转录的主要原因是6 基因启动子区缺陷和6i v s i i 有负调控 序列。 6 基因与口基因启动子区的主要区别是6 基因的c a a t 样盒为c c a a c ， 而不是c c a a t ，并且不含有g c 盒。因此，6 基因启动子区c a a t 样盒的缺 陷和g c 盒的缺失，可能是6 基因低水平转录的重要原因之一。j ，7 我室瀚将人5 基因启动子区一6 4 位c 突变为t ，恢复正常的c a a t 样盒， 转染人h e l a 细胞，通过检测报告基因的表达，间接证实6 基因低水平表 达与启动子区c 从t 样盒缺陷有关。 我室还通过凝胶迁移率改变实验( e m s a ) 研究了人6 珠蛋白基因启动 子区一6 4 位c t 点突变对d n a 结合蛋白的影响，证明6 基因启动子区c a a t 样盒的缺陷是引起6 基因低水平表达的重要因素，缺陷的c a a t 样盒通过 影响反式因子c p i 和g a t a - i 的结合影响基因的表达。 本工作将人6 基因启动子区- 6 4 位c 突变为t 后，克隆于去除强启动 子c m v 的真核基因表达载体p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i sa 中，分别将含野生 型c a a t 样盒和突变型c a a t 样盒的人6 基因转染鼠红白血病( m e l ) 细胞， 经d m s o 诱导表达，利用半定量r t p c r 技术，测得6 基因启动子区- 6 4 位 c t 点突变后，含突变型c a a t 样盒的人6 基因的转录水平是含野生型 c a a t 样盒的2 1 9 0 _ _ + 0 5 4 7 倍。本研究在m r n a 水平直接证实6 基因启动 子区c a a t 样盒的缺陷是影响其转录的重要原因。 ! 璺塑塑垦型杰堂堡主兰堡堡兰 用真核基因表达载体中与人6 基因融合表达的c m y c 蛋白的单克隆 抗体进行w e s t e r nb l o t ，证实人6 基因在m e l 细胞中可有效表达，且含 突变型c a a t 样盒的人6 基因的表达水平高于含野生型c a a t 样盒的人6 基因的表达水平。 f 建立了分别含野生型c a a t 样盒和突变型c a a t 样盒并稳定表达人6 基 因的细胞株，为以后进一步研究6 基因表达调控准备了细胞模型。旷一 主里堡塑墨型查堂堡主兰堡堡奎 t h e t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o ns t u d y o fh u m a n 6 g l o b i ng e n ep r o m o t e r sp o i n t m u t a t i o n c ta ts i t e 一6 4 a b s t r a c t h u m a n 6g l o b i n g e n e i sl o c a t e db e t w e e n1 l r1 3a n d1 3g l o b i ng e n eo ft h e 1 3 g l o b i ng e n e c l u s t e ro nt h es h o r ta r mo fc h r o m o s o m e11 t h et e t r a m e ro f 1 2 1 a n d6g l o b i nc h a i n sf o r m sm i n o ra d u l th e m o g l o b i n ，h b a 2 ( a 2 62 ) t h e r ei s h i g hh o m o l o g y b e t w e e nt h eh u m a n 6a n d bg l o b i ng e n e h o w e v e r t h er a t i oo f 6a n dbg l o b i ng e n ee x p r e s s i o ni s1 5 0 t h em e c h a n i s mf o rt h el o wl e v e lo f 6 g l o b i ng e n ee x p r e s s i o n h a sn o tb e e n c o m p l e t e l y e l u c i d a t e d i tw a s s u g g e s t e d t h a tt h ed e f e c t i v e6g l o b i n g e n ep r o m o t e r a n d 6i v si ia r e i n v o l v e di nl o wl e v e le x p r e s s i o no f 6g l o b i n g e n e c o m p a r i s o no fh u m a n 6a n dpg l o b i ng e n ep r o m o t e rs e q u e n c e ss h o w e d s t r i k i n g d i f f e r e n c e si nt h en u c l e a r p r o t e i n b i n d i n g s i t e s i n c l u d i n g t h e c a a t - l i k eb o xa n dg cb o xi nt h ep r o x i m a lr e g i o n i n 6g l o b i ng e n e ，t h e c a a t l i k eb o xa t 6 4 - 6 8i sc c a a c t h e r e f o r e t h ed e f e c t i v ec a a t - l i k e b o xa n dt h ea b s e n c eo fg cb o xi n 6g l o b i n g e n ep r o m o t e rr e g i o nm a y b et h e r e a s o n so ft h el o wl e v e lo f 6 g l o b i ng e n ee x p r e s s i o n o u rp r e v i o u sw o r ki n d i c a t e dt h a tt h e e x p r e s s i o nl e v e io f 6 c c a a c l u cr e p o r t e r g e n ei nh e l a c e l l si so n ef i f t ho f 6 c c a a t l u ca n dt h es t u d y o ft h ee f f e c to f p o i n tm u t a t i o nc t a t 一6 4o fh u m a n 6g l o b i ng e n eo ni t s b i n d i n gp r o t e i n sb ye l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ( e m s a ) e v i d e n t l y s u p p o r t st h eh y p o t h e s i st h a tt h ed e f e c t i v ec a a t l i k eb o x i nh u m a n6g l o b i n g e n ec o n t r i b u t e st h em a i nr e a s o no fi t sl o wl e v e le x p r e s s i o n t h ed e f e c t i v e c s 。a c t i n ge l e m e n tc a a t - l i k e b o x a f f e c t so nt h ee x p r e s s i o no f6g l o b i n g e n e b y i t sb i n d i n gw i t ht h et r a n s a c t i n gf a c t o r sc p 1a n dg a t a 一1 i nt h e s i s ，w ec l o n e dh u m a n6g l o b i ng e n ew i t ht h ew i l da n dm u t a n t t y p e 中国协和医科大学硕士学位论文 o fc a a t - l i k e b o x ( - 6 4 c t ) s e p a r a t e l y i n t o e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r p c d n a 3 1 f 一) m y c h i s a d i s c a r d i n g c m vw h i c hi s s t r o n gp r o m o t e l t r a n s f e c t e dm e l c e l l s ，i n d u c e db y d m s ot oe x p r e s s u s i n gs e m i - q u n a t i t a t i v e r t - p c r a n a l y s i s ，t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fh u m a n 6g l o b i ng e n ew i t hm u t a n tt y p ec a a t - l i k eb o xi st w o t i m e s ( 2 1 9 o 5 4 7 ) t h a to fw i t h w i l d t y p e c a a t l i k eb o x o u rr e s u l t sh a v ec o n f i r m e dt h e h y p o t h e s i s t h a tt h ed e f e c t i v ec a a t l i k eb o xo fh u m a n 6 g l o b i ng e n e p r o m o t e rr e g i o n i so n eo ft h e m a j o rr e a s o n sw h i c ha c c o u n t s f o ri t sl o w e x p r e s s i o nl e v e l w e s t e r nb l o tm e t h o dw a su s e dt oi d e n t i f yh u m a n6g l o b i nw i t h a n t i - m y c a n t i b o d yw h i c hw a saf u s i o np r o t e i n ，t h er e s u l t ss h o wt h a th u m a n 6g l o b i n g e n ee x p r e s s i o nw i t hm u t a n tt y p ec a a t l i k eb o xi sh i g h e rt h a nt h a to fw i t h w i l d t y p ec a a t l i k e b o x w ee s t a b l i s h e dt w oc e l ll i n e s e x p r e s s i n gh u m a n 6g l o b i ns t a b l yu n d e r t h er e g u l a t i o no fw i l da n dm u t a n t t y p ec a a t - l i k eb o xr e s p e c t i v e l y , a n do f f e r c e i lm o d e l sf o rt h ef u t u r er e s e a r c hi n6g l o b i n g e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n 4 中国协和医科大学硕士学位论文 前言 人珠蛋白基因包括和b 两个基因簇。c c 珠蛋白基因簇位于1 6 号染色 体短臂，长约3 0 k b ，以5 一 z 一、l ， 1 一、l ，o 【z v a - 一c c 。一a - 一0 3 顺序排列，在发育过程中只有从胚胎到成人一个开关。p 珠蛋白基因簇位 于1 1 号染色体短臂，长约7 0 k b ，以5 一一g 7 一a 丫一v p 一6 一p 一 3 顺序排列，在发育过程中有从胚胎到胎儿和从胎儿到成人两个开关 1 ，2 ，3 ，4 。 6 珠蛋白基因位于1 1 号染色体短臂b 基因簇中1 l rb 基因和p 基因之 间，其表达产物6 珠蛋白与a 珠蛋白的四聚体组成h b a ：( a z5 ：) ，是成 年人次要血红蛋白。h b a ：与h b a 都均匀分布在各个红细胞中，生理功能如 氧亲和力、波耳效应、协同效应和对d p g 的反应等极其相似 5 ，但在个 体发育中，h b a 。的合成较h b a 滞后。正常成人h b a ：与h b a 的比值约为 1 1 5 0 6 。h b a ：与h b aa 链组成相同，非q 链组成不同。 6 基因与b 基因的编码产物6 链与b 链高度同源，均有1 4 6 个氨基 酸，n 端和c 端氨基酸组成相同，分别为缬氨酸和组氨酸，编码序列只有 1 0 个氨基酸不同，且多为中性氨基酸，只有b2 2 g l u 一62 2 a l a 、p1 1 6 h i s 一51 1 6 a r g 的改变使6 链正电荷比b 链多，造成h b a ：等电点比h b a 高， 在碱性电泳时向负极泳动快。 6 基因与b 基因同源性高，均有3 个外显子和2 个内含子，外显子编 码的氨基酸只有1 0 个不同。i v si 的同源性高达8 7 8 ；i v s i i 的同源性 仅4 0 5 0 7 。两者启动子区的差异也很大。5 基因启动子c a a t 样盒 缺陷，c c a a t 被c c a a c 取代，c c a a t 与t a t a 的距离变短，一7 7 位处有1 个 g a t a 结合位点，一8 6 一1 0 8 b p 间缺乏g c 盒 8 。所以，6 基因与b 基因 的差别主要在启动子区及i v s i i ( 图1 ) 。 _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 中国伽和医科大学硕i 学位论文 h u m a n 口l i k eg l o b i n g e n ep r o m o t e r s ”5- 一拍 产址螋l 毋出址一啷“洲 豆g 逝c 上丛l 幽盟习广_ ：斧趔l 。钳4 ，* _ - 五f _ 霄皇生一一音半熊_ _ o e l t 4 0 e9 37 6” 丛! 篮e 6 c 珏6 6 1 一一 ! 燃一- 一8 e t f i g u r e1 t h es t r u c t u r eo f h u m a nd l i k eg l o b i ng e n e p r o m o t e r s 目前，6 基因低水平表达的原因还不十分清楚。6 珠蛋白与d 珠蛋 白翻译速率大致相同，h b a 与h b a ，的稳定性相似，故翻译和翻译后水 平的调控可能不是造成它们表达悬殊的原因。6 基因m r n a 的半衰期 比b 基因m r n a 半衰期的1 3 还短，故6 基因m r n a 的不稳定性可能 是它低水平表达的原因之- - 9 。另外，p r a u d f o o t 发现位于同一基因簇上 的6 基因转录速率远远低于、y 与1 3 基因的转录速率 1 0 ，h u m p h r i e s 发现6 基因在猴肾细胞中的转录速率较1 3 基因低5 0 倍 1 1 】，故6 基因转 录水平比p 基因转录水平低可能是一个重要原因。目前认为限制6 基因 转录的主要原因是6 基因启动子区缺陷和6i v si i 区有负调控序列。 首先，6 基因启动子区是限制其转录的原因之一。h u m p h r i e s 构建的 人b 和6 杂合基因，当5 端为b 基因，3 端为6 基因时，杂合基因的转 录与正常b 基因相似。而当5 端为6 基因，3 端为b 基因时，杂合基因 的转录与正常6 基因相似。l e p o r e 基因与反l e p o r e 基因的表达进一步说 明这个观点。l e p o r e 基因是部分6 基因和部分b 基因共计约7 k b 长片段 缺失后形成的6b 杂合基因，其表达比正常b 基因低，比正常6 基因高。 比d 基因低是因为它不含d 基因启动子，比6 基因高是因为它含有b 基 因i v s i i 1 2 。反l e p o r e 基因( 即m i y a d a 基因) 是1 36 杂合基因，表 达量仅为正常b 基因的5 1 0 。比b 基因低是因为它含有6 基因i v s i i ，比6 基因高是因为它含有8 基因启动子f 1 3 。 其次，6i v si i 是限制其转录的又一因素。l e p o r e 基因与反l e p o r e 基因的表达也同时说明了此观点。k o s c h e 等将6 珠蛋白基因内含子与0 基因内含子互换，结果发现当1 3i v si 被6i v si 取代时，嵌合基因的表 达与正常1 3 基因相同；而当bi v si i 被6i v si i 取代时，嵌合基因的表达 明显降低，只有正常的5 4 1 0 1 4 。h bp a r c h m a n 的非q 珠蛋白基因包 6 圭里堡塑垦登奎兰堡圭兰垡笙奎 括6 基因启动子、9 基因i v si 和6 基因i v s i i ，它的合成速率与正常6 珠蛋白肽链相同。5i v s i i 可能影响6 珠蛋白基因转录的起始、终止、剪 接速率或前体m r n a 的稳定性。 真核基因启动子是基因转录起始位点( + 1 ) 及其5 上游近端约1 0 0 2 0 0 b p 内的一组有独立功能的d n a 序列，每个元件约7 2 0 b p 长，决定 r n a 聚合酶i i 转录起始位点和转录频率。整个启动子由核心启动子( c o r e p r o m o t e r ) 和启动子近侧序列元件( p s e ，p r o m o t e rp r o x i m a ls e q u e n c e e l e m e n t s ) 两部分组成。核心启动子包括起始子( i n i t i a t o r ) 及t a t a 盒，其作用是确定转录起始位点并产生基础水平的转录。p s e 包括c a a t 样盒( c c a a t ) 和g c 盒( c a c c c ) 等，能通过特异转录因子调节转录起始 的频率，提高转录效率。 从图1 可以看出，b 基因启动子区有保守的c a a t 样盒( c c a a t ) 和2 个g c 盒( c a c c c ) ，而6 基因的c a a t 样盒为c c a a c ，并且不含g c 盒。因 此，6 基因启动子区c a a t 样盒的缺陷和g c 盒的缺失可能是其低水平转 录的原因。 我室张劲秋等将人6 珠蛋白基因启动子区一6 4 位c t 点突变后恢复 正常的c a a t 样盒( c c a a t ) ，分别将突变型和野生型人6 珠蛋白基因启动 子区克隆到以虫荧光素酶( l u c 或l u c i f e r a s e ) 为报告基因的表达载体 中，转染人h e l a 细胞，通过分析报告基因的表达检测恢复后的c c a a t 样 盒对6 基因启动子区功能的影响 1 5 。结果显示，突变组荧光素酶的发 光强度为野生组的5 4 0 1 6 8 倍，二者呈显著性差异( p o 0 1 ) ，证明 将人6 基因启动子区- 6 4 位c c a a c 突变为c c a a t 可增强启动子功能。 t a n g 等也将人6 珠蛋白基因启动子区一6 4 位c t 点突变恢复正常的 c a a t 样盒( c c a a t ) ，与l u c 报告基因融合后分别转染k 5 6 2 和m e l 细胞，l u c 活性突变型较野生型分别增加5 6 倍及2 4 倍( p o 0 5 ) ，转染h e l a 细胞， l u c 活性突变型与野生型无明显改变。于一8 5 位恢复e k l f 的结合位点 c a c c c ，l u c 活性在k 5 6 2 及m e l 细胞中分别增加2 6 8 倍及6 5 倍( 尸 0 0 5 ) 。于一9 5 位恢复e k l f 的结合位点，l u c 活性也显著增加 1 6 。在 h a e c 中6 基因一8 5 和一9 5 位分别恢复c a c c c ，l u c 活性较野生型分别增加 2 5 4 倍( p o 0 5 ) 和3 8 倍( p b u f f e r2 “l ，d n a 限制性内切酶 1 4 u u gd n a ，加水定容至2 0 9 l ，置于3 7 。c 7 嘴2 3 h ，前半小时内 可每1 0 分钟左右混匀1 次。 d n a 粘端补平 2 0 于e p p e n d o r f 管中依次加入d n a0 2 5 1 1 9 ，2 m md n t p s2 t 1 1 ，任意一 种酶切缓冲液( 1 0 ) 2 “1 ，加水至1 9 m l ，最后加入1 5 单位k l e n o w 酶，混匀后室温下反应1 5 分钟。待补齐反应结束后，于6 5 。c 水浴2 0 分钟使k l e n o w 酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或一2 0 。c 保存 备用。 1 2 细胞培养 2 1 m e l 培养于d m e m 培养液中，每l o o m ld m e m 完全培养液中加入l o m l 胎牛血清，1 0 0 单位青霉素，1 0 0 微克链霉素。培养条件为3 7 ， 5 c o ：。每个6 0 r a m 平皿加5 m l 培养液，每个l o o m m 平皿或l o o m l 培 养瓶中加入l o m l 培养液。 1 3g 4 1 8 溶液配制及使用浓度的确定 2 1 按照g 4 1 8 使用说明上提供的活性成分比例折算出含1 0 0 g 4 1 8 活性 的重量，加入适量的去离子无菌水，在无菌条件下配制成活性浓度 为l o o m g m lg 4 1 8 储存液。分装后于一2 0 。c 保存。预先测定m e l 细胞 g 4 1 8 使用浓度，在1 0 1 4 天内将细胞全部杀死的最低g 4 1 8 量作为选 择剂量。g 4 1 8 的使用浓度为2 m g m l 。选择培养时，换新鲜培养基 后，再加入适量的g 4 1 8 贮存液。 1 4 细胞传代及冻存 2 1 m e l 细胞为悬浮或半贴壁细胞，细胞长满后，去培养液，加入新鲜 的完全培养液，反复吹打成单细胞悬液后，按所需比例传至新的培 养瓶，m e l 细胞冻存方法为9 0 0 p lm e l 细胞悬液中加入l o o g ld m s o ， 置于一7 0 。c 过夜，次日放置液氮中保存。 1 5 细胞复苏 2 1 从液氮中取出冻存细胞，置4 2 。c 水浴中剧烈振摇使细胞快速融化， 离心后吸出冻存液，用新鲜的完全培养液悬浮后，传至培养瓶( 皿) l r 中国协和医科大学硕士学位论文 中培养。待细胞长满后传代。 1 6 重组质粒转染m e l 细胞 用g i b c o b r l 公司的l i p o f e c r a m i n e t m 试剂通过脂质体法转染m e l 细胞。 用无血清、无抗生素的d m e m 培养基洗涤细胞1 次。将悬浮于0 8 m l 无血清培养基的2 3x1 0 6 个细胞种于3 5 m m 组织培养板或6 孔板的一 个孔中。在1 2 一7 5 一m 无菌管中准备下面两种溶液：溶液a ：每次转 染，将l 3 p gd n a 稀释于1 0 0 肛i 无血清培养基中。溶液b ：每次转染， 将2 2 5 u ll i p o f e c t 咀i n e t m 稀释于1 0 0 1 无血清培养基中。将溶液a 、 b 轻轻混匀，室温孵育1 5 4 5 m i n ，使d n a 一脂质体复合物形成。溶液 可能呈现雾状，不影响转染效果。将复合物加至细胞悬液中混匀，3 7 o cc 0 2 培养箱中孵育2 2 4 h ( g i b c o b r l 公司推荐5 h ) 后，向每孔中 加4 m l 含血清的完全培养基。3 7 c 0 ：培养箱中孵育2 4 h 后换新鲜完 全培养基。 1 7 细胞克隆技术( 有限稀释法) 2 1 取对数生长期的细胞，用吸管吹打，制成单个细胞悬液，细胞计数。 将细胞悬液连续倍比稀释，将稀释好的细胞悬液分别接种于9 6 孔板 中，每孔加液o i m l ，放入培养箱内培养。次日，在显微镜下观察培 养板各孔细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0 i m l 培 养液，继续培养。培养期间，视培养液p h 值的变化更换培养液。细胞 培养一周左右，孔中即形成较大克隆。待克隆长至孔底面积的1 3 1 2 时，将克隆细胞转种于2 4 孔培养板扩大培养。 1 8m e l 细胞总r n a 的提取 用g i b c o 公司的t r i z o l 试剂提取细胞总r n a 。按试剂盒使用说明操 作：离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加l m lt r i z o l ( 每1 0 6 1 0 7 细胞) ，用i m l 加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液， 不粘稠时为止。随后加入2 0 0 p l 氯仿，剧烈振荡1 5 秒钟，室温放置 5 分钟，然后，4 c ，l 1 0 0 0 9 离心5 分钟，将水相转移至一e p p e n d o r f 管中，加入5 0 0 p l 异丙醇后混匀。1 1 0 0 0 9 离心1 5 分钟，倾出异丙 醇。用7 5 乙醇洗涤沉淀一次，置冰上，让残余乙醇挥发殆尽。r n a 童里塑塑墨型查兰堡圭堂垡堡塞 沉淀溶于2 0 u ld e p c 处理过的水中，取适量稀释后读0 d z e o n m ，计算 r n a 浓度。另取部分用电泳检测r n a 质量。 1 9m e l 细胞基因组d n a 的提取 用g i b c o 公司的t r i z o l 试剂提取细胞基因组d n a 。按试剂盒使用说 明操作：离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加l m lt r i z o l ( 每 1 0 6 1 0 7 细胞) ，用l m l 加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一 溶液，不粘稠时为止。随后加入2 0 0 肛1 氯仿，剧烈振荡1 5 秒钟，室 温放置5 分钟，然后，4 。c ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，将水相转移至 一e p p e n d o r f 管中，加入0 3 m l 无水乙醇，颠倒混匀，室温放置2 3 分钟，4 。c ， 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃酚一乙醇上清，用0 1 m 柠檬 酸钠( 溶于1 0 乙醇中) 洗涤d n a 沉淀2 次，每次洗涤于室温放置 3 0 分钟并间断混匀，4 c ，2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，然后，用1 5 2 m 1 7 5 乙醇重悬d n a 沉淀，室温放置1 0 2 0 分钟并间断混匀，4 。c ，2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，打开管盖，空气中干燥d n a 沉淀5 1 0 分钟，然后将 其溶于8 m mn a o h 中，使d n a 的浓度为0 2 o 3 u g u 1 。 2 0m e l 细胞蛋白质的提取 用g i b c o 公司的t r i z o l 试剂提取细胞总蛋白质。按试剂盒使用说明 操作：离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加l m lt r i z o l ( 每1 0 6 1 0 7 细胞) ，用l m l 加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液， 不粘稠时为止。随后加入2 0 0 “1 氯仿，剧烈振荡1 5 秒钟，室温放置 5 分钟，然后，4 。c ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，将水相转移至一e p p e n d o r f 管中，加入0 3 m l 无水乙醇，颠倒混匀，室温放置2 3 分钟，4 c ， 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，将约0 8 m l 酚一乙醇上清转至另一新 e p p e n d o r f 管中，加入1 5 m l 异丙醇，室温放置1 0 分钟，4 。c ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清，用o 3 m 盐酸胍洗涤蛋白质沉淀3 次，每次 加入2 m l0 3 m 盐酸胍，室温放置2 0 分钟，4 c ，7 5 0 0 r p m 离心5 分 钟，然后，用2 m l 无水乙醇重悬蛋白质沉淀，室温放置2 0 分钟，4 ，7 5 0 0 r p m 离心5 分钟，真空干燥蛋白质沉淀，于5 0 将其溶于 t s d s 中，4 。c ，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，将上清转至另一新e p p e n d o r f 管中，蛋白样品可于一5 一2 0 保存。 2 0 里堡塑墨型查鲎婴主堂堡笙苎 2 1 半定量r t p c r 2 0 2 1 1 逆转录 取总r n a5 9 9 ，随机引物六聚体i g l ，v o o c 力n 热5 分钟后，迅速置于 冰浴中，然后加入a m v3 0 u n i t s ，5 b u f f e r5 p l ，d n t p ( 1 0 m m ) 2 5 p l ， r n a s i n4 0 u n i t s ，d e p ch 。02 5 p l ，充分混匀后，3 7 。c 保温1 小时， 9 5 加热灭活2 分钟。 2 1 2p c r 反应体系为逆转录产物c d n al o p l ，d e l t a 基因上、下游引物各i p l ， 8 一a c t i n 上、下游引物各l l ，2 5 m m o l ld n t p4 l ，1 0 b u f f e r5 “l ， i 0 x m g c l 25 p 1 ，t a q d n a 聚合酶1 肛l ，h 2 02 1 p l 。反应条件为：9 5 。c2 m i n ， 9 4 。c 变性3 0 s ，5 5 退火3 0 s ，7 2 延伸i m i n ，2 8 个循环，7 2 延伸 i 0m i n 。 2 1 3 半定量 1 5 琼脂糖凝胶电泳r t p c r 的结果，凝胶图像扫描仪进行灰度扫 描，以d - a c t i n 为内参照，测得6 基因c d n a 和b a c t i n 的相对含 量。 2 2 基因组d n a p c r 2 0 反应体系为基因组d n a5 p 1 ，d e l t a 基因上、下游引物各1 u l ， 2 5 m m o l ld n t p2 u 1 ，1 0 b u f f e r5 p l ，i 0 m g c l 25 p l ，t a qd n a 聚合酶l g l ，h 2 03 1 。反应条件为：9 5 c2 m i n ，9 4 。c 变性3 0 s ，5 5 退火3 0 s ，7 2 延伸i m i n ，3 0 个循环，7 2 延伸l o m i n 。 2 3 蛋白质的s d s p a g e 2 0 按实验材料部分配制1 5 分离胶和5 成层胶，待分离胶凝固后上层灌 入成层胶，完全凝固后拔出梳子，在加样孔内加入处理好的样品，电 泳条件为恒流2 0 m a ，待溴酚蓝指示剂距离凝胶末端i c m 左右停止电泳。 样品处理为加入适量上样缓冲液，煮沸5 m i n 。 2 4w e s t e r nb l o t 2 0 蛋白样品经s d s - - p a g e 电泳( 稳流2 0 m a ，约3 h ) 后，将胶取下，放入 转移缓冲液中；滤纸和硝酸纤维素膜分别剪成适当大小，泡于转移缓 冲液中；转膜夹板平放，从一侧开始先后铺上海绵垫层、三层滤纸、 中国协和医科大学硕士学位论文 电泳后的聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜( 左下角做一记号) 、三层滤 纸、海绵垫层，每次都要赶尽气泡：夹好转膜夹板，放入转膜电泳槽 中，将与硝酸纤维素膜接触的滤纸一侧靠向阳极，4 稳压2 0 v ，电泳 过夜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将蛋白质标准物条带剪下，放 入氨基黑染液染色3 0 6 0 秒，然后用1 0 9 6h a c 脱色；硝酸纤维素膜其 它部分放入含t b s t 的平皿中，摇床上洗3 次，每次1 0 m i n ；将膜放 入含5 脱脂奶粉的t b s 中，于3 7 。c 封闭1 h ，用t b s t 洗3 次，每次 1 0 分钟；加入l o m l 用t b s t 按1 ：5 0 0 0 稀释的c - m y c 单抗溶液，室 温摇床孵育2 h ，t b s t 洗3 次，每次1 0 分钟；再将硝酸纤维素膜转入 l o m l 用t b s tl ：5 0 0 稀释的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠第二抗体溶 液中，室温摇床孵育2 h ，再用t b s t 洗3 次，每次1 0 分钟：然后将 硝酸纤维素膜转入1 0 m l 底物反应液( 碱性磷酸酶n b t b c i p 溶液) 中， 室温摇床轻轻摇动2 m i n 左右，待显色清楚后倒掉底物反应溶液，用水 洗一次，然后转入反应终止液中。 中国协和医科大学硕士学位论文 结果 一、构建启动子区- 6 4 位分别含野生型c a a t 样盒和突变型c a a t 样盒人6 基因的真核基因表达载体 1 重组质粒p c d n a 3 卜d e l t a ( w ) 和p c d n a 3 卜d e l t a ( m ) 的构建 首先分别对质粒p u c l 9 一d e l t a ( w ) 和p u c l 9 一d e l t a ( m ) 的启动子区进 行测序，确证了人6 基因启动子区一6 4 位分别含有野生型c a a t 样盒和 突变型c a a t 样盒( 图1 ，2 ) 。 口l m “3 7 7 ”器：；器m , t j 3 2 f 帅1g ：i 4 4 r t m ：2 , 7 7 v q w l 1 0 n $，kelo嚣譬譬o 铺蠡黜。器裂：= 慨譬瓣漂麓 f i g u r e1 s e q u e n c ea n a l y s i so fp u c l 9 一d e l t ap r o m o t e r ( i n c l u d i n gw il dt y p ec c a a c ) 2 3 中国协和医科大学硕士学位论文 。祭p 嚣产“嚣“怒p 鼍秽紫絮归。署。鼍祭“等嚅严8 ”絮1 m 6 删“h 4 帅舢舢州1 w w n m 脚协m 黼m 椭m “帅枇m 帆枞舢f 以州 佻 妇啪州俐恤n 啪憎f i f o v 山 w 岫呐咄呦岫蝴删m 0 0 c 蒯 r 艄嘴警孵麟珊一紫1 b 恤吲k a m 测b 憎1 0 1 1 吖v h 侧b 删跏删n n m 七傲恤n j “嚣。鬻嚣”器”曙p 鼍嚣”7 留“。豁”鼍笋”案p 。嚣“鼍p “号：a 1 执m 稿虮a 甜一b ，k d “) 。i “w 勘m k 蛾。m k ，。j f i g u r e2 s e q u e n c ea n a l y s i so fp u c l 9 一d e l t ap r o m o t e r ( i n c l u d i n gm u t a n tt y p ec c a a t ) 设计两端分别含有x b a l 和h i n d i i i 酶切位点的p c r 引物： p1 ：5 c a a a a a t c t c t a g a g t c g c c t 3 p 2 ：5 c a a g c t t a t g g t a c t t g t g a g c c 3 用p c r 方法分别从质粒p u c l 9 一d e l t a ( w ) 和p u c l 9 一d e l t a ( m ) 中扩 增从一2 8 0 位至终止子前的人6 基因( 1 8 3 2 b p ) ，得到启动子区- 6 4 位分别 含有野生型c a a t 样盒和突变型c a a t 样盒的人6 基因( 图3 ) 。 2 4 生里垃塑堕型盔堂堡主兰堡垒皇 f i g u r e3 t h er e s u l to fh u m a n 6g l o b i ng e n ew i t hw i l dt y p ec c a a c a n dm u t a n tt y p ec c a a tr e s p e c t i v e l y m 1 ：九d n a h i n d l i im a r k e r m 2 ：p b r 3 2 2 b s t n im a r k e w ：h u m a n8g l o b i ng e n ew i t hw i i dt y p ec c a a c m ：h u m a n6g l o b i ng e n ew i t hm u t a n tt y p ec c a a t 将野生型和突变型p c r 产物分别克隆于p g e m - t 载体中，经蓝白斑筛 选得n i g h 性克隆p g e m t d e l t a ( w ) 和p g e m t d e l t a ( m ) 。 用x b ai 和h i n d i l l 分别酶切p g e m t d e l t a ( w ) 和p g e m t d e l t a ( m ) ， 得到两端分别含有x b ai 和h i n d l i i 酶切位点的野生型8 基因和突变型8 基 因。 用x b ai 和h i n d l i i 酶切真核基因表达载体p c d n a 3 1 ( 一) m y c h i sa ( 以 下简称为p c d n a 3 1 ) ，得到两端分别含有x b ai 和h i n d i i i 酶切位点的线性 化载体p c d n a 3 1 。 用t 4d n a 连接酶分别连接野生型8 基因与载体p c d n a 3 1 及突变型8 基因与载体p c d n a 3 1 ，得到重组质粒p c d n a 3 卜d e l t a ( w ) 和 p c d n a 3 1 一d e l t a ( m ) 。 分别用n d ei ，x b ai 和h i n d i i i ，e e o ri ，b a m hi 和e c o ri 酶切鉴定 上述重组质粒，所得d n a 片段与预期结果一致( 图4 ，5 ) 。 酶切结果为：b a m hi 和e c o ri ：6 2 7 7 b p 和9 6 5 b p x b ai 和h i n d i i i ：5 4 2 l b p 和1 8 2 1 b p n d ei ：5 1 6 5 b p 和2 0 7 7 b p e c o ri ：线性载体7 2 4 2 b p f i g u r e4 r e s t r i c t i o nm a po fr e c o m b i n a n tp l a s m i d p c d n a 3 1 一d e l t a ( w ) a n dp c d n a 3 1 一d e l t a ( m ) m ：入d n a h i n d i i im a r k e r l ：p l a s m i dp c d n a 3 1 一d e l t a ( w ) b a m h i + e c o r i 2 ：p l a s m i dp c d