（物理化学专业论文）水飞蓟宾脂质体的制备及物理化学性质研究.pdf

囊：、“ 苏州大学学位论文使用授权声明 剐l l l l l i i i i iiiiii i i y 1 7 3 。似39 i 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属在年_ 月解密后适用本规定。 非涉密论文口 论文作者签名；王连冬 导师签名：曼固查 e l期：坐哆型 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究摘要 于两芰 脂质体是由磷脂和胆固醇等物质在水溶液中形成的球状小囊，是一种良好的 药物载体，因其具良好的生物相容性和安全性，在药物的输送等方面有其优越性。 本文以水飞蓟宾为药物模型，研究其脂质体的制备及物理化学性质，并通过对水 飞蓟宾在若干有机溶剂中的溶解度及其关联，为药物的溶解、输运性质提供基础 数据和理论参考。研究内容具体包括： 1 采用薄膜超声分散法制各水飞蓟宾脂质体，透析法分离脂质体和药物，用 紫外一可见一阶导数分光光度法，测定脂质体中的水飞蓟宾含量，计算包封率。以 包封率为衡量指标，选择影响包封率和粒径分布的三个主要因素：磷脂与胆固醇 的用量比；水飞蓟宾的用量；水合介质的种类。采用三因素四水平正交实验进行 处方优化。确定最优处方为：卵磷脂：胆固醇= 1 0 0 ：5 0 ，水飞蓟宾1 0 r a g ，水合介 质为0 0 1 m 磷酸盐缓冲溶液( p h = 6 8 6 ) ，其包封率为8 6 5 7 。 2 对水飞蓟宾脂质体物理化学性质：膜材红外光谱、膜材d s c 、脂质体t e m 、 脂质体粒径分布、药物体外释放进行了五个方面研究。结果表明：水飞蓟宾与磷脂 只是简单复合，并未发生化学方应；从膜材d s c 可看出胆固醇可抑制卵磷脂的相 变发生；t e m 显示脂质体形态为球状囊泡，粒径大小在6 4 2 9 2 5 0 0 0 n m 之间，平均 粒径为1 2 3 4 8 r i m ：分别用零级方程、一级方程、h i g u c h i 方程、n i e b e r g u l l 平方根方 程、h i x c o n - c r o w e l l 立方根方程、w e i b u u 方程等释放动力学方程拟合了药物释放数 据，释放符合一级动力学方程。 3 采用固液平衡法测定了水飞蓟宾在无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲基甲 酰胺等有机溶剂中的溶解度。分别用理想溶液模型、经验模型、a p e l b l a t 方程模型 和地方程模型对实验数据进行关联。经验模型和a p e l b l a t 方程模型关联的效果较好。 关键词：水飞蓟宾，脂质体，包封率，药物释放，溶解度 作者：王选东 指导老师：白同春 p r e p a r a t i o n a n dt h ep h y s i c a l c h e m i s t r yp r o p e r t i e so f s i l y b i nl i p o s m e a b s t r a c t l i p o s o m ei s as p h e r i c a lv e s i c l e ，w h i c hi sc o m p o s e do fp h o s p h o l i p i d ，c h o l e s t e r o l a n do t h e rs u b s t a n c e si n w a t e r l i p o s o m e i sa g o o dd r u g c a r d e rw i t hg o o d b i o c o m p a t i b i l i t ya n ds a f e t y t h e r ea r em a n ya d v a n t a g e sc o m p a r e dw i t ho t h e rd r u g d e l i v e r ys y s t e m s i nt h i sp a p e r , s i l y b i ni sc h o s e na sad r u gm o d e l t h et e c h n i q u eo ft h e p r e p a r a t i o no fl i p o s o m e ，t h ep h y s i c a l c h e m i s t r yp r o p e r t i e so fl i p o s o m e ，a n dt h e s o l u b i l i t yo fs i l y b i ni ns o m eo r g a n i cs o l v e n t sw e r es t u d i e d t h i ss t u d yi sa i m e dt o p r o v i d eb a s i cr e f e r e n c ed a t af o rt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fs i l y b i nl i p o s o m e f o l l o w i n gc o t e n t sa r ei n c l u d e di nt h i sp a p e r 1 t h es i l y b i nl i p o s o m ew a sp r e p a r e db yat h i nf i l mu l t r a s o n i cd i s p e r s i o nm e t h o d t h el i p o s o m ea n dd r u gw a ss e p a r a t e db yad i a l y s i sm e t h o d t h es o l u b i l i t yo fs i l y b i n w a sm e a s u r e db yt h eu v - v i s i b l em e a s u r e m e n t t h ec o n t e n to fs i l y b i ni nl i p o s o m ea n d t h ee n t r a p m e n te f f i c i e n c yw e r ed e t e r m i n a t e df r o mi t s s o l u b i l i t yd a t a e n t r a p m e n t e f f i c i e n c yw a su s e dt oe v a l u a t et h ee f f i c i e n c eo fl i p o s o m e i ne x p e r i m e n t , t h r e ef a c t o r s i n f e c tt h ee n t r a p m e n te f f i c i e n c ya n dp a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o n ：t h er a t i oo fp h o s p h o l i p i d t oc h o l e s t e r o l ，t h ea m o u n to fs i l y b i ni nl i p o s o m e ，h y d r a t i o nm e d i at y p e s af o u r - l e v e l t h r e e - f a c t o r so r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt oo p t i m i z et h ep r e s c r i p t i o n t h e o p t i m u mp r e s c r i p t i o ni st h a tt h er a t i oo fe p c ：c h o l e s t e r o l = 10 0 ：5 0 ，s i l y b i nw a s10 r a g ， h y d r a t i o nm e d i u mw a s0 01m p b s h = 6 8 6 ) t h ee n t r a p m e n te f f i c i e n c yo f8 6 5 7 i s f o u n df o r t h eo p t i m u mp r e s c r i p t i o n 2 t h ep h y s i c a l c h e m i s t r yp r o p e r t i e so fs i l y b i nl i p o s o m ew e r es t u d i e db yf t - i r s p e c t r o s c o p y ，d s c ，t e ma n dt h ed r u gr e l e a s ee x p e r i m e n t s t h er e s u l t so ff t - i r s h o w e dt h a ts i l y b i ni ss i m p l ye n c l o s e di np h o s p h o l i p i dl i p o s o m e d s ce x p e r i m e n t s h o w st h a tc h o l e s t e r o lc o u l di n h i b i te p cf r o mp h a s et r a n s i t i o n t e ms h o w st h a ts i l y b i n l i p o s o m ei sas p h e r i c a lv e s i c l e t h ep a r t i c l es i z ew a sd i s t r i b u t e df r o m6 4 2 9t o2 5 0 0 0 姗，t h ea v e r a g es i z ew a s1 2 3 4 8 舳d r u gr e l e a s ee x p e r i m e n tw a sa n a l y s e db ys o m e _1_lj p r e p a r a t i o n a n d t h e p h y s i c a l - c h e m i s t r y p r o p e r t i e s o f s i 1 y 。b i n l i p o s m 。e a b s t r a c t_ 一一 _ _ 。_ - 。_ 。_ _ 。_ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ - _ - 。_ _ _ 。_ - _ 。_ _ - _ _ _ 。_ i _ - _ _ _ - _ _ - ，_ _ _ - _ i - _ - _ _ - i _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - - - _ _ - - _ _ 。- _ _ _ _ - _ 一一 k i n e t i ce q u a t i o n s f o re x a m p l et h e z e r o o r d e re q u a t i o n ，t h ef i r s t - o r d e re q u a t i o n ，t h e h i g u c h ie q u a t i o n ，t h en i e b e r g u l ls q u a r er o o te q u a t i o n , t h eh i x c o n - c r o w e l lc u b er o o t e q u a t i o na n dt h ew e i b u l le q u a t i o n t h er e s u l t so fd a t af i ti n d i c a t et h a tt h ef i r s t o r d e r e q u a t i o na g r e e sw i t he x p e r i m e n t a lb e s t 3 t h es o l u b i l i t yo fs i l y b i ni ns e v e r a lo r g a n i cs o l v e n t ss u c h 嬲e t h a n o l ，a c e t o n e ， e t h y la c e t a t ea n dd i m e t h y l f o r m a m i d ew a sm e a s u r e db yt h es o l i d 1 i q u i de q u i l i b r i u m m e t h o d i d e a ls o l u t i o nm o d e l ，e m p i r i c a lm o d e l ，a p e l b l a tm o d e la n dl hm o d e l w e r e u s e d t oc o r r e l a t et h ee x p e r i m e n t a ld a t a t h ee m p i r i c a lm o d e la n d a p e l b l a tm o d e lc o r r e l a t et h e s o l u b i l i t yd a t ab e t t e r k e y w o r d s ：s i l y b i n , l i p o s o m e ，e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y , d r u gr e l e a s e ，s o l u b i l i t y i i i w r i t t e nb y ：w a n gx u a n d o n g s u p e r v i s e db y ：b a it o n g c h u n ；1 目录 第一章文献综述 1 1 脂质体的研究概况1 1 2 水飞蓟宾脂质体的研究状况1 0 1 3 体外释放模型及其应用1 2 1 4 本课题研究的内容和意义1 4 1 5 参考文献一1 5 第二章水飞蓟宾脂质体的制备 2 1 引言2 1 2 2 实验仪器和试剂2 1 2 3 实验方法2 1 2 3 1 制备方法2 1 2 3 2 溶剂的筛选2 2 2 3 3 水飞蓟宾脂质体的含量测定2 2 2 3 4 包封率的测定方法2 3 2 3 5 正交试验设计”2 4 2 3 6 处方验证”2 5 2 4 结果与讨论2 5 2 5 本章小结3 4 2 6 参考文献3 4 第三章水飞蓟宾脂质体的物理化学性质研究 3 1 引言”3 6 3 2 实验仪器和试剂3 6 3 3 实验方法3 6 3 3 1 红外吸收光谱的测定3 6 3 3 2d s c 测定3 6 3 3 3 脂质体溶液t e m 的测定3 6 3 - 3 4 粒径分布3 7 3 3 5 脂质体的体外释放一3 7 3 4 结果与讨论3 7 3 5 本章小结“4 7 3 6 参考文献4 7 第四章水飞蓟宾在若干有机溶剂中的溶解度 4 1 引言4 9 4 2 实验仪器和试剂”4 9 4 3 实验方法”4 9 4 4 结果与讨论5 0 4 5 本章小结5 7 4 6 参考文献5 7 结论5 8 致谢5 9 水飞蓟宾脂质体的制备及物理化学性质研究 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬综怂 1 1 脂质体的研究概况 脂质体( 1 i p o s o m e ) 最初是在1 9 6 5 年，由英国学者b 锄g h a m 和s t a n d i s h 将磷脂分 散在水中进行电镜观察时发现的，它由一个或多个被水或缓冲溶液层隔开的脂质 双层泡囊所构成【1 1 。 2 0 世纪6 0 年代末，r a h m a n 等人首先将脂质体作为药物载体应用。19 71 年 骶g o r i a d i s 等首次将脂质体用于生物活性物质的转运【2 1 。1 9 8 8 年第一个脂质体包封 的药物在美国进入临床试验。1 9 9 5 年第一个抗癌药物脂质体一阿柔比星脂质体获得 美国食品与药品管理局( f d a ) 批准。如今，已成为很多科学领域一种非常有用的 研究工具，在数学、理论物理、生物物理、化学、胶体科学、生物化学、生物学 等学科中普遍应用【3 1 。 1 1 1 脂质体的组成 制备脂质体最常用的脂类是磷脂，由一个亲水性头部和两个疏水性尾部组成， 属于两亲分子。天然磷脂包括磷脂酰胆碱( p c ) 、磷脂酰乙醇胺( p e ) 、磷脂酰丝氨酸 ( p s ) 、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇( p i ) 等；合成磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱( d p p c ) 、 二硬脂酰磷脂酰胆碱( d s p c ) 、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺( d p p e ) 、二棕榈酰磷脂酰丝 氨酸( d p p s ) 、二棕榈酰磷脂酰甘油( d p p g ) ：二油酰磷脂酰胆碱( d o p c ) 和二油酰磷 脂酰甘油( d o p g ) 。 构成脂质体的另一种物质是胆固醇，由甾体部分和一条长的侧链组成，亦 属于两亲分子。其本身并不形成双分子层结构，但它能以较高的比例参与到磷脂 膜中，它在膜中主要起着调节磷脂双分子膜“流动性 的作用。当低于相变温度 时，胆固醇可使膜减少有序排列，增加流动性；高于相变温度时，胆固醇可增加 膜的有序排列从而减少膜的流动性。 1 1 2 脂质体的分类 脂质体的大小约可从直径2 5 - 1 0 0 0 n m ，甚至更大。它们可由单层双分子膜组 成，也可由多层双分子膜组成。不同大小的脂质体常需采用不同的制备方法，而 第一章文献综述水飞蓟宾脂质体的制备及物理化学性质研究 不同的用途常要求特定大小的脂质体。目前，常按大小和结构将脂质体分类h 1 。( 1 ) 小单层脂质体( s o y ) ，这是具有脂质双分子层的最小单位，其大小根据介质的离子 强度和膜的脂质组成不同而不同，一般在生理盐水中，单纯由蛋卵磷脂组成的脂 质体直径约1 5 r i m ，由d p p c 组成的约2 5 n m 。( 2 ) 中等大小单层脂质体( i u v ) ，指的 是直径在1 0 0 - 1 0 0 0 n m 之间的单层脂质体。( 3 ) 大单层脂质体( l u v ) ，指直径大于 1 0 0 0 n m 的由单层磷脂双分子层膜组成的脂质体。( 4 ) 多层脂质体( m l v ) 这些脂质体 大小范围较宽，一般从1 0 0 - - 一1 0 0 0 n m 不等，组成m l v 的磷脂双分子层有五层或更 多，层数较少的有时也称少层脂质体( o l i g o l a m e l l a rl i p o s o m e s ) 。( 5 ) 多囊脂质体 ( m v l ) 由许多非同心的囊泡构成，每个囊泡包裹着被装载的药物。典型粒径范 围为5 - - 5 0 1 a m ，远大于传统脂质体。 1 1 3 脂质体的作用特点 脂质体被认为是一种具有多种功能的定向药物载体。脂质体有如下作用特点。 ( 1 ) 缓释性 药物被包在脂质体内，在组织中的扩散速度降低，在血液中释放减慢，从而 延长药物发挥作用的时间。 ( 2 ) 靶向性 通过改变脂质体的给药方式、给药部位和粒径来调整其靶向，或者在脂质体 上连接某种识别分子，通过其与靶细胞的特异性结合来实现专一靶向性。抵达靶 部位后脂质体释放药物，提高了药物在靶部位的治疗浓度，因而俗称“药物导 弹。 ( 3 ) 长效性 在脂质体双分子层的保护下，药物可以避免氧化、降解或被人体内的酸或酶 破坏，从而可以保证或延长药物的稳定性。 ( 4 ) 低毒性 脂质体药物的膜材与哺乳动物细胞相似，由磷脂等组成，对机体不是异物， 不会引起局部组织损伤，不诱发超敏反应，而能多次长期使用，对人体无毒害。 ( 5 ) 与细胞的亲和性 由于其特殊的类细胞膜结构，脂质体细胞有较大的亲和力，且能增加药物对 细胞的通透性，从而提高了药物在患病部位的浓度和作用，起到增强疗效的作用。 2 水飞蓟宾脂质体的制备及物理化学性质研究 第一章文献综述 ( 6 ) 药物组织分布可控性 在制备过程中，可通过改变表面的性质。如粒径大小、表面电荷等，提高脂 质体药物对靶区的选择性和定向性，控制药物的组织分布，从而降低毒性，减少 副作用。 ( 7 ) 给药途径多样性 脂质体不仅可静脉给药【5 1 ，也可用作肌肉、皮下、粘膜、肺部、眼部、鼻腔、 皮肤给药及基因转染等6 ，7 ，引。其中基因疗法为人类的治疗提供了一种新的选择，基 因治疗已成为目前医学生物学领域中最重要的研究课题之一。还可以将脂质体做 成涂膜剂、膏剂、口服液等，因此药物改为脂质体剂型后可开发出更为广泛的给 药途径。 ( 8 ) 提高被包封药物的稳定性 将一些不稳定或易氧化的药物包封在脂质体中，药物因受到脂质体双层膜的 保护，可显著提高稳定性。同时，脂质体也增加药物在体内的稳定性，因为药物 进入靶区前被包在脂质体内，使药物免受机体酶和免疫系统的分解；当进人靶区 后，脂质体和细胞相互作用或被细胞内体摄取，经溶酶体的作用，脂质体解体并 释放出药物。 1 1 4 形成机理 脂质体形成的原理是根据能量最低原理，磷脂分子具有两亲性，当分散在水 中后，亲油性脂肪酸链聚集形成双分子层，内部为亲油性，外部为亲水性，双分 子层只有以球状分子存在时，体系能量才能保持最低，因此形成球形囊泡。d d l 商c 【9 ，1 0 】提出了两种主要机理：双层片段自我闭合、芽出的形成机理。i s r a e l a c h v i l e 【1 1 1 提出临界堆积参数p 的概念，用来说明分子形状对自组装体形状的影响。p 的概念 如公式：尸：上，其中v 是表面活性剂疏水部分的体积；舢是分子的头部面积， 彳。三c l c 是疏水链的最大伸展长度。由于卵磷脂的临界堆积参数p 为l 2 1 ，其有序组合 体形状是囊泡。自组装体理论分别从能量稳定、分子结构和熵增理论三个方面阐 述了脂质体形成的机理【1 2 1 。还可以通过热分析方法【1 3 , 1 4 】，对脂质体的形成机理进 行研究。 第一章文献综述 水飞蓟宾脂质体的制备及物理化学性质研究 1 1 5 制备方法 1 1 5 1 被动载药法 即先将药物溶于水相或油相中，然后按所选择的脂质体制备方法制成含药脂 质体。共同特点：在药物包封过程中脂质体内外水相药物浓度一致，决定其包封 因素为药物与磷脂膜作用力、膜材组成、脂质体内水相体积、脂质体数目、分子 量及药脂比等。此法适用于对脂溶性、与磷脂膜亲和力高的药物。 1 1 5 2 薄膜分散法( t h i n - 丘hd i s p e r s i o n ) 最早由b a m g h a m 提出【1 1 ，系将磷脂磷脂等膜材溶于适量的三氯甲烷或其他有机 溶剂( 脂溶性药物可加在有机溶剂中) ，然后在减压旋转下除去溶剂，使脂质在 器壁上形成薄膜，加入含有水溶性药物的缓冲溶液，进行分散。主要用于制备多 室或大单室脂质体，超声后以单室脂质体为主。此法是最原始而又迄今为止最基 本和应用范围最广泛的方法。如制备注射用克拉霉素n 钔、姜黄素脂质体n 阳和黄芩 苷脂质体【1 7 】等。 1 1 5 3 逆相蒸发法( r e v e r s e - p h a s ee v a p o r a t i o n ) 该法最初由s o z k a 和p a p a h a d j o p o u l o s 于1 9 7 8 年提出1 1 8 】，将磷脂等膜材溶于有 机溶剂，如三氯甲烷、乙醚等，加入待包封药物的水溶液( 水溶液：有机溶剂= l ： 3 1 ：6 ) 进行短时超声，直至形成稳定的w o 乳剂。然后减压蒸馏除去有机溶 剂，达到胶态后，滴加缓冲溶液，旋转帮助器壁上的凝胶脱落，然后在减压蒸馏 下继续蒸发，制得水溶性混悬液，除去未包封的药物，即得大单脂质体。此法包 封率高，且可以形成大的单层球( l u v ) 【1 9 1 ，颗粒较为均匀、稳定，制备方法简 单。如t o s h i y u k in a g a t a 等【2 0 】通过逆相蒸发法制备脂质体将烟草花叶病毒传递到植 物原生质体中；张景京力，张志荣等【2 1 1 通过逆相蒸发法制备紫杉醇脂质体。 1 1 5 4 溶剂注入法( s o l v e n ti n j e c t i o n ) ( 1 ) 乙醚注入法( e t h e ri n j e c t i o nm e t h o d ) d e a m e r 和a a n g h a m 于1 9 7 6 年介绍了一种将脂质的乙醚( 或乙醚甲醇混合物) 溶液注入到热水中制备l u v s 的方法【2 2 】，如图所示。它是将与水不相混溶的乙醚 溶液通过一注射针头缓慢地注入水相介质，在一定温度下乙醚被蒸发除去，得到 粒径较大的脂质体。由于溶剂的缓慢蒸发使界面的脂质单分子层最终形成双分子 4 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 第一章文献综述 层，双分子层再重叠形成封闭的脂质体。这种方法比较温和，包封率高，且被氧 化的可能性小；但速度较慢，不适合大量制备。如制备阿奇霉素脂质体1 2 3 1 。 瓣 图1 1 ：乙醚注入法制备l u v 示意图 f i g l - 1 ：p r e p a r a t i o no fl u vl i p o s o m eb ye t h e ri n je c t i o nm e t h o d ( 2 ) 乙醇注入法( e t h a n o li n j e c t i o nm e t h o d ) b a t z r i 和k o r n 于1 9 7 3 年通过所谓的乙醇注入法，制备单室脂质体，其可以避免 超声和高压【2 4 1 。含磷脂的乙醇溶液，通过细针迅速注入到大量的盐水或其他水溶 液介质中。注入力量通常足以实现完全混合，使乙醇瞬间稀释在水中，磷脂分子 在中介质均匀分散。其主要缺点【2 5 】：1 该方法只限于制备较稀的s u v s 混悬液。2 如果被包封材料溶解在水相，包封率极低，由于乙醇与水会形成共沸混合物，在 真空下蒸馏很难除尽乙醇。如制备红景天纳米脂质体【2 6 】；司帕沙星脂质体【2 7 】；穿 琥宁脂质体【2 羽。 溶液 h 2 0 图1 2 ：乙醇注入法示意图 f i g1 - 2 ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f e t h a n o li n j e c t i o nm e t h o d 5 第一章文献综述水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 1 1 5 5 冷冻干燥法( f r e e z ed r y i n g ) 冷冻干燥法分为常规冷冻干燥法【2 9 1 、重建冻干法【3 们、冻结融解法3 种【3 l 】。 常规冷冻干燥法系利用类脂高度分散在水溶液或磷酸盐缓冲溶液中，加入支 持剂进行冷冻干燥，然后再用含药水性介质分散，形成脂质体。 重建冻干法是先制备空白的脂质膜或小单层脂质体，加入将被包封的水溶性 药物、磷酸盐缓冲溶液和冻干支持剂，超声或振荡使其重新水化、融合，获得较 高包封率的脂质体，然后一起冻干。 冻融法制备脂质体是先采用超声法制备未包封药物的小单层脂质体，冷冻前 将待包封的药物加入，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使脂质体膜破裂， 形成冰晶片层与破碎的脂膜共存状态，在缓慢融化时，暴露出的脂膜互相融合重 新形成脂质体。经再次短时间( 1 5 一3 0 s ) 超声，几乎不会降低包裹容积。 1 1 5 6 前体脂质体法( p r o l i p o s o m e ) 1 9 8 6 年，英国学者p a y n e 等提出了前体脂质体( p r o l i p o s o m e s ) 这一概念d 2 ，3 3 1 ， 将脂质体膜材和药物的混合溶液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表 面，形成可自由流动的粉体状制剂。由于尚未形成脂质双分子层结构，因此称为 前体脂质体，使用前加水或缓冲液水化即形成脂质体混悬液。随后，又出现了液 状前体脂质体。 图1 3 ：前体脂质体的制备装置 f i 9 1 - 3 ：d e v i c eo f p r o l i p o s o m ep r e p a r t i o n 1 1 5 7 钙诱导融合法( c a l c i u m - i n d u c e df u s i o n ) 该方法是利用由酸性磷脂组成的小单层脂质体，在钙离子存在下发生缔合后 融合的作用形成大单层脂质体。例如在磷脂酰丝氨酸所形成的小单层脂质体中加 6 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 第一章文献综述 入钙离子，使之相互融合，加入e d t a 经螯合除去钙离子，即产生大单层脂质体， 直径在2 0 0 - 一1 0 0 0 n m 之间。该法的包封率依赖于所用脂质的浓度。其特点是形成 的单层脂质体容积大，条件缓和，可包封d n a 、r n a 等生物高分子。 1 1 5 8 表面活性剂处理法( d e t e r g e n th a n d l i n g ) 脂质薄膜、多层脂质体或单层脂质体与胆酸盐、脱氧胆酸盐等表面活性剂混 合，通过离心法或凝胶过滤或透析法等除去表面活性剂，当表面活性剂逐渐除去 时，磷脂质就形成单层脂质体结构，这种方法可以获得比较均匀的小单层脂质体 ( 直径约3 0 - 1 8 0 n m ) 。 1 1 5 9 二次乳化法( d o u b l ee m u l s i o n ) 本法先将少量的缓冲液与多量的含磷脂的有机溶剂进行第一次乳化，形成w o 型反相胶团。减压除去一部分溶剂或完全不除去溶剂，然后加入较大量的缓 冲液进行第二次乳化，形成w o w 的复乳系统。该系统的乳滴具有多个内水 相液滴，各个水相液滴被有机溶剂一水界面上的磷脂单分子层分隔，单分子层的疏 水面向着分隔的有机溶剂。当减压蒸发除去有机溶剂时，即形成中等大小的脂质 体。 1 1 6 主动载药法 利用脂质体内外水相跨膜的离子或化合物梯度，使外水相药物自发地向脂质 体内部聚集。 1 1 6 1p h 梯度法 即在操作过程中，首先以较低或较高的p h 缓冲液水化磷脂，制备脂质体 ( 所得脂质体内外水相的p h 值一致) ，随后用较高或较低的p h 缓冲液调节或置 换上述的脂质体外水相至所需p h 值，从而造成脂质体内外水相的p h 值差，产生 p h 梯度。一般常用p h 4 0 的0 3 m o l l 柠檬酸缓冲液水化磷脂，制备脂质体 3 4 , 3 5 婀。 1 1 6 2 硫酸铵梯度法 用该法制备脂质体的过程【3 7 ，3 8 1 ： ( 1 ) 空白脂质体的制备：以( n h 4 ) 2 s 0 4 溶液( 2 5 0 m m o l l ) 为水化介质，采用 薄膜法或逆相蒸发法制备空白脂质体( 脂质体内水相为2 5 0 m m o l l ) 。 ( 2 ) 将上述脂质体装入透析袋中，以大量的不含( n h 4 ) 2 s 0 4 的溶液作为介质进 行透析，建立硫酸铵梯度，即得空白脂质体。 7 第一章文献综述水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 ( 3 ) 加入药物溶液，6 0 。c ( 或所选定的温度) 孵育5 3 0 分钟，即得含药脂质 体。 1 1 6 3 醋酸钙梯度法 各取卵磷脂、胆固醇、维生素e 及维a 酸适量，溶于4 0 m l 乙醚中，置于梨形 漏斗中，缓缓滴入溶有l m l 吐温一8 0 的1 2 0 m m o l l 醋酸钙溶液( p h = 7 3 ) 中，一直 搅拌3 0 m i n 后，超声2 0 m i n 至成黄色均匀乳状液【3 9 】，于4 0 。c 水浴旋转蒸发至乙醚 挥发完全，倒入透析袋中，用1 2 0 m m o u l 硫酸钠溶液( p h = 5 9 ) 1 l 透析2 4 h ，取出用 硫酸钠溶液调节体积至l o o m l ，再于5 5 水浴孵化2 0 m i n 。所得黄色乳状液通过高 压均质机( 压力：1 2 0 0 0 b a r , 缝宽：l n m ) 3 次，充氮气保存，即得。适用于两亲性药物， 其油水分配系数受介质p h 值和离子强度影响较大。 1 1 7 新型脂质体 1 1 7 1 长循环脂质体( 1 0 n gc i r c d a t i n gl i p o s o m e s ) 又称空间稳定脂质体，利用脂质膜中掺入表面活性剂或对类脂进行修饰等手 段，延长脂质体在血液中的稳定时间，从而延长其包封药物的作用时j a - - j 4 0 , 4 1 1 。神 经节苷酯( g m l ) 、磷脂酰肌醇( p i ) 、聚乙二醇( p e g ) 、聚丙烯酰胺( p p a ) 、 聚乙烯毗咯烷酮( p v p ) 等在脂质体表面高度修饰，交错重叠覆盖在脂质体表面， 形成致密的构象云。这种立体保护作用取决于聚合物的柔性，位阻保护脂质体不 被血液中的调理素识别、摄取，从而使脂质体清除速率减慢，血液中驻留时间延 长。 1 1 7 2 热敏脂质体( t h e r m o s e n s i t i v el i p o s o m e s ) 是指利用升温手段使局部温度高于脂质体的相变温度，脂质膜由“凝胶态” 转到液晶态结构，磷脂的酰基链的紊乱度和活动度增加，膜的流动性增加，导致 包封药物的释放速率也增大，以达到控制释放、靶向治疗的目的心4 3 1 。热敏脂质 体的特点是在受热时，可将包封药物释放至无内吞作用的靶细胞，这种热释放取 决于脂质体的t c 热敏免疫脂质体是在热敏脂质体膜上用交联法接上抗体而成，也 可同时完成抗体结合和水性溶质的包封。 1 1 7 3p h 敏感脂质体( p h - s e n s i t i v el i p o s o m e s ) 动物和人体肿瘤间质液的p h ( p h 范围为5 0 - 6 5 ) 比周围正常组织生理p h ( 约 7 4 ) 低，当脂质体进入肿瘤部位时，由于p h 的降低导致脂肪酸羧基的质子化成六 8 l_-l，l 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 第一章文献综述 方晶相的非相层结构 4 4 , 4 5 】，从而使膜融合，达到细胞内靶向和控制药物释放的目 的。 1 1 7 4 光敏脂质体( p h o t o s e n s i t i v el i p o s o m e s ) t 4 6 , 4 7 , 4 8 光敏脂质体是将光敏物质的药物包裹在脂质体内用来进行光学治疗。当在一 定波长的光照射时，脂质体膜与囊泡物质间或脂质体之间发生融合作用而释放药 物。制备了含胡萝卜素或全反视黄醇的光敏脂质体，光照后可发生不可逆光反应， 从而影响膜的流动性，增加其通透性。 1 1 7 5 免疫脂质体( i m m u n o l i p o s o m e s ) 又称为掺入抗体形成被抗体修饰的具有免疫活性的脂质体称为免疫脂质体。 免疫脂质体的靶向治疗技术是通过将载药脂质体与单克隆抗体或基因抗体供 价结合成免疫脂质体 4 9 , 5 0 ，借助抗体与靶细胞表面抗原或受体结合的作用，经 接触释放、吸附、吞噬、吞饮及融合等方式，释放出包封的药物，来特异性的 杀伤靶细胞，而达到治疗的目的的技术。 1 1 7 6 多糖被覆脂质体 将糖脂链的一部分用棕榈酰或具有适当间隔基的胆甾醇基取代得到糖类衍生 物，再与含药物脂质体混合，在适当的条件下孵育，即得到参入糖脂的脂质体【5 l 】。 多糖被复脂质体糖基物质有：唾液糖蛋白、n - 十八酰二氢乳糖脑苷神经节苷岩 藻糖，半乳糖、甘露( 聚) 糖衍生物、右旋糖苷、支链淀糖、出芽短梗孢糖( c h p ) 世 号宁o 1 1 7 7 阳离子脂质体( c a t i o n i cl i p o s o m e ) 阳离子脂质体又称为阳性脂质体、正电荷脂质体。主要被用做基因转染的载 体，作为基因转染载体具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点，因而 在基因治疗方面有独特应用，特别适用与蛋白质、多肽和寡核苷酸类物质、脱氧 核糖核酸( d n a ) 、核糖核酸( r n a ) 等的转染，并有可能成为今后基因治疗领 域内最有希望的基因转染载体【5 2 1 。 1 1 7 8 其他： 还包括这些新型脂质体如声振波敏感脂质体、聚合膜脂质体5 3 、磁性脂质体【5 4 】 、受体介导脂质体酬等。 1 1 8 脂质体应用的问题和前景 9 第一章文献综述 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 脂质体作为药物载体的应用虽然具备了许多优点和特点。但就目前来看，也 还存在一定的局限性，因为从脂质体的整个发展过程看，它起初是作为生物膜模 型，而后进入药学领域，因此是涉及相关学科基础理论较多的一项新技术，由于 脂质体的表面特性如大小、双层膜流动性、表面电荷等与体内行为有着密切的关 系，给制备技术特别是工业化生产带来了一定的难度。而且脂质体在体内主要集 中于肝、脾、肾等网状内皮细胞丰富的器官，如欲对其它组织器官进行治疗，则 其靶向性不明显，期望将来配体专一靶向性脂质体的研究解决此问题。另外，脂 质体对某些药物，尤其是某些水溶性药物包封率较低，并且药物极易从脂质体中 渗漏，因此稳定性差亦是脂质体商品化过程急待解决的问题【5 6 1 。 鉴于脂质体具有高度的生物相容性、能改变包封药物的药动参数、提高靶向 性、减少毒副作用等特点，随着脂质体研究工作的不断深入，不同理论互相渗透， 互相补充，脂质体作为药物载体所转运的药物种类和范围将不断扩大，脂质体必 将会在诸多领域得到广泛的应用。 1 2 水飞蓟宾脂质体的研究状况 1 2 1 水飞蓟宾- 磷脂复合物 磷脂中磷原子上羟基中的氧原子有较强的得电子的倾向，氮原子有较强的失 电子的倾向，因此，在一定条件下，可与一定结构的药物生成复合物。 水飞蓟宾是一种不溶于水，脂溶性也很差的有机化合物，磷脂是具有一个亲 水性头部和两条疏水长链的两亲分子，两者在一定条件下结合形成复合物。张光 军【5 7 , 5 8 , 5 9 等合成了水飞蓟宾一卵磷脂复合物，并通过核磁共振和红外等方法判定该 复合物是一种分子型复合物，水飞蓟宾及卵磷脂的自身化学性质在体内不会改变。 该复合物提高了水飞蓟宾的脂溶性，故推测完全可以提高其血药浓度和生物利用 度，从理论上讲，对于其药理作用的实现必将有很大的提高。 1 2 2 水飞蓟宾脂质体 1 2 2 1 薄膜分散法制备水飞蓟宾脂质体 余江南【6 0 1 等以s l b 为模型药，首次尝试用薄膜分散法制备了水飞蓟宾脂质体 ( s i l y b i nl i p o s o m e s ) ，建立了一阶导数分光光度法，用于水飞蓟宾脂质体包封率及水 飞蓟宾含量测定1 6 1 1 。张磊【6 2 】等采用薄膜法制备水飞蓟宾脂质体，并对其粒径、表面 电位、包封率等稳定性指标进行观察。所得脂质体粒径小而均匀：在室温条件下密 l o ，1 1 1 i 水飞蓟宾脂质体的制各及物理化学性质研究 第一章文献综述 封放置9 d 及4 c 下保存1 0 个月，其外观性状、粒径、表面电位、包封率等无显著性 改变。 1 2 2 2 前体脂质体法制备水飞蓟宾脂质体 肖衍宇等通过薄膜载体沉积法制备水飞蓟宾前体脂质体【6 3 , 6