（生物化学与分子生物学专业论文）六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究.pdf

西北大学硕士学位论文 六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究 中文摘要 六聚组氨酸( 6 h i s ) 是一种融合蛋白纯化和检测的常用标签，基于组氨酸与 n i 2 + 螯合作用，n i m a ( 次氨基三乙酸) 、n i i d a ( 亚氨基- - 7 , 酸) 树脂已被广泛 用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化。以羧甲基天冬氨酸( c m a s p ) 为螯合配基的 c 0 2 + 螯合物对六聚组氨酸融合蛋白纯化具有选择性高、金属离子不易脱落等特 点。此外，通过抗6 x h i s 抗体纯化六聚组氨酸融合蛋白的方法受到了很多关注。 本论文就六聚组氨酸融合蛋白的纯化开展了较为系统的研究，内容包括两个方 面：( 1 ) 合成了载有羧甲基天冬氨酸钻离子螫合物的树脂并建立了六聚组氨酸融 合蛋白的纯化方法。( 2 ) 制备了抗6 x h i s 多克隆抗体，并初步将其用于六聚组氨 酸融合蛋白的纯化。 以s e p h a r o s ec l - 6 b 为载体，环氧氯丙烷为活化剂，羧甲基天冬氨酸为螯合 配基制备载有c 0 2 + 的固定化金属螯合亲和层析介质( c 0 c m 舡p s e p h a r o s e ) ，将 其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。优化了2 0 0 l 细胞裂解液中六聚组氨 酸融合蛋白纯化所需介质用量，c o - c m - a s p s e p h a r o s c 与细胞裂解液的孵育时 间，介质清洗溶液及靶蛋白洗脱液昧唑浓度等条件。比较了c o c m 如p s e p h a r o s e 与商品化n i - n t a - a g a r o s e ( 0 i a g e n 公司) 两种螯合介质对融合蛋白的 纯化效果。开展了从5m l 细胞裂解液中纯化六聚组氨酸融合蛋白c d l 5 5 d 1 的 研究，并通过b r a d f o r d 法测定了c o - c m 如p s e p h a r o s e 对c d l 5 5 d 1 的纯化量。 结果表明：对2 0 0 ，l l 细胞裂解液纯化体系，c o - c m a s p - s e p h a r o s e ( 5 0 悬浮液) 的优选体积为6 0 l ，最佳孵育时间为3 0m i n ，洗脱液最佳咪唑浓度为2 0 0 m m o l l 。介质用量放大为1 5m l ( 5 0 悬浮液) 从5m l 细胞裂解液中纯化 c d l 5 5 d 1 可达4 6m g 。与商品化n i n t a a 罢芦- o 辩相比，载有c 0 2 + 的固定化金 属螯合亲和层析介质具有选择性好，清洗条件简单，得到的靶蛋白纯度高等优 点。 以碳二亚胺饵d c ) 介导，将6 x h i s 与载体匙孔血蓝蛋( k l h ) 偶联作为免疫 原免疫新西兰兔，所得抗血清经饱和硫酸铵沉淀，得到纯度高的抗6 x h i s 多克隆 抗体。将多抗通过共价作用固定于氨基末端磁性微粒表面，以磁性微粒为载体 西北大学硕士学位论文 通过免疫亲和原理对六聚组氨酸融合蛋白c d l 5 5 d 1 的纯化进行了初步研究，结 果表明抗6 x h i s 多克隆抗体可用于六聚组氨酸融合蛋白纯化，但效率较低。除去 多克隆抗体中针对载体蛋白的抗体是提高纯化效率的一个关键环节，为此，通 过免疫亲和法以表面固定k l h 的金磁微粒去除多克隆抗体中抗k l h 抗体，得到 了纯度更高的针对6 x h i s 的抗体，为下一步系统研究6 x h i s 融合蛋白纯化奠定基 础。 关键词：六聚组氨酸融合蛋白固定化金属螫合亲和层析钴离子 抗六聚组氨酸多克隆抗体免疫亲和纯化 西北大学硕士学位论文 t h es t u d yo f 6 h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i np u r i f i c a t i o n a b s t r a c t 6 x h i si sac o m m o nt a gi np u r i f i c a t i o na n dd e t e c t i o no ff u s i o np r o t e i n n i n t a ( n i t r i l o t r i a c c t i ca c i d ) a n dn i - i d a ( i m i n o d i a c e t i ca c i d ) c h e l a t i n gr e s i nh a v e b e e nu s e d t oi s o l a t e6 x h i s t a g g e df u s i o np r o t e i n sb a s e do nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh i s t i d i n et a g a n dn i “i nc h e l a t i n gr e s i n r e c e n t l y , c a r b o x y m e t h y l a t e da s p a r t a t e ( c m - a s p ) b o u n d w i t hc o “h a sb e e np r o v e dt oe x h i b i th i g hs e l e c t i v i t ya n dl e s sm e t a ll e a k a g ed u r i n g t h ep u r i f i c a t i o no f6 x h 砖t a g g e df u s i o np r o t e i n s f o r t h e r m o r e ，t h ep u r i f i c a t i o no f 6 x h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i n su s i n ga n t i - 6 x h i sa n t i b o d yh a sa t t r a c t e dt h ei n t e r e s t so f s c i e n t i s t si nt h i sf i e l d h e r e i n , t h ep u r i f i c a t i o nm e t h o d so f6 x h i s t a g g e df u s i o n p r o t e i n sb a s e do nc m - a s pc h e l a t i n gm e d i u ml o a d e dw i t hc 0 2 a n d t h ea n t i 6 x h i s a n t i b o d ya r ed e s c r i b e di nd e t a i l u s i n gs e p h a r o s ec l - 6 ba ss u p p o r t 3 - c h i o r w l ，2 - e p o x y p m p a n ea sa c t i v a t e d a g e n t , c a r b o x y m e t h y l a t e da s p a r t a | e ( c m - a s p ) a sc h e l a t i n gl i g a n d , ac h e l a t ea f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i cm e d i u mb a s e do nc 0 2 + ( c o - c m - a s p - s e p h a r o s e ) w a sp r e p a r e da n d u s e dt op u r i f y6 x h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i n s t h ea m o u n to fc o - c m 脚s e p h a r o s 。 r e a c t e dw i t h2 0 0p lo fl y s a t e ，t h ei n c u b a t i o nt i m e , w a s hc o n d i t i o na n dt h ei m i d a z o l e c o n c e n t r a t i o ni nt h ee l u t i o nb u f f e rw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o wt h a t6 0g lo f c o - c m 硝印一s e p h a r o s e ( 5 0 s u s p e n s i o n ) w a ss u i t a b l ef o rt h ep r o t e i np u r i f i c a t i o n f r o m2 0 0g lo fl y s a t e ，t h eo p t i m a li n c u b a t i o nt i m eo fm e d i u ma n dl y s a t ew a s3 0m i n , a n dt h eo p t i m a li m i d a z o l ec o n c e n t r a t i o ni nt h ee l u t i n gb u f f e rw a s2 0 0m m o l l i na b i gs c a l ee x p e r i m e n t , 4 6m go ff u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e df r o m5m l o fl y s a t e u s i n g1 5m l o fc o - c m - a s p s e p h a r o s e ( 5 0 s u s p e n s i o n ) c o m p a r e dw i t hn i n t a - a g a r o 辩( p r o d u c to fq i a g e n ) , t h ec o - c m a s p s e p h a r o s em e d i u me x h i b i t sh i g h e r s e l e c t i v i t ya n dt h ep r o t e i np o s s e s s e sh i g h e rp u r i t y 6 x h i sw a sc o n j u g a t e dw i t hk l h ( k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n ) u s i n ge d c ( 1 e t h y l - 3 ( 3 - d i m e t h y l l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o c h i o r i d e ) 髂ac l o g s l i n k e ra n d t h ec o n j u g a t i o nw a su s e da si m m u n o g e nt oi m m u n i z er a b b i t s ，a n t i s e r u mr a i s e dw a s i i i 西北大学硕士学位论文 p u r i f i e db yt h ep r e c i p i t a t i o n w i t hs a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t e t h ea n t i 6 x h i s p o l y c l o n a la n t i b o d yw a si m m o b i l i z e do nt h e s u r f a c eo fm a g n e t i c p a r t i c l e sv i a c o v a n t l yi n t e r a c t i o na n du s e dt op u r i f y6 x h i s t a g g e df u s i o np r o t e i nc d l 5 5 d 1b a s e d o ni m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ea n t i 6 x h i sp o l y c o n a l a n t i b o d yc a l lb eu s e dt op 吲f y6 x h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i n h o w e v e r , t h em e t h o d n e e df u r t h e ro p t i m i z a t i o n o n eo ft h ei n f l u e n c i n gf a c t o r si st h el a r g ea m o u n to fa n t i - k l h a n t i b o d ye x i s t i n gi na n t i 6 x h i sp o l y c l o n a la n t i b o d y t h e r e f o r e ，u s i n gg o l d m a g c o a t e dw i t hk l h , t h ea n t i - k l ha n t i b o d yw a sr e m o v e df r o mt h ep u l y c l o n a la n t i b o d y , t h ea n t i 一6 x h i sa n t i b o d yi ns u p e m a t a n ta f t e rm a g n e t i cs e p a r a t i o nw i l lb eu s e di nt h e 6 x h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i np u r i f i c a t i o ni nt h en e x ts t e p s k e yw o r d s ：6 x h i s - t a g g e df u s i o np r o t e i n ；i m m o b i l i z e dm e t a l - c h e l a t e da f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ；c 0 2 + ；a n t i - 6 x h i sp o l y c l o n a la n t i b o d y ；l m m u n o a f f m i t y p u r i f i c a t i o n i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课 题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名徽指导教师签名： w 年加哆日 加刁 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：鸣1 垧囟 p 1 年6 月哆日 西北大学硕士学位论文 缩略语表 英文缩写英文全称 6 x h i s 6 x h i s t i d i n c g s tg l u t a t h i o n cs - t r a n s f e r a s e s p a s t a p h y l o c o c a lp r o t e i na g f pg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n m b p m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n c b d c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n s s b p s t r e p t a v i d i n - b i n d i n gp e p t i d e 玎) ai m i n o d i a c e t i ca c i d n t an i t r i l o t r i a c e t i ca c i d t e d t r i s ( c a r b o x y m e t h y l ) e t h y l e n e d i a m i n e c m - a s pc a r b o x y m e t h y l a t e da s p a r t a t e i p t g i s o p r o p y l - b d - t h i o g a l a c t o s i d c s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s e m s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e k l h k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n m e s 2 - ( n - m o r p h o l i n o ) e t h a n es u l f o n i c a c i d h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e t m b t c t r a m e t h y l b e n z i d i n e c f a c o m p l e t ef r e u n d 7 sa d j u v a n t i f a i n c o m p l e t ef r e u n d sa d j u v a n t s a ss a t u r a t e da m m o n i u m s u l p h a t e a m p a m p i c i l l i n c a m c h l o r a m p h e n i c o l i m a cl m m o b i l i z e dm e t a l c h c l a t e da f ! f i l l i t v c h r o m a t o g r a p h y e d c h c i 1 - e t h y l - 3 - ( 3 d i m c t h y l l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e 中文名称 六聚组氨酸 谷胱甘肽巯基转移酶 葡萄球菌蛋白a 绿色荧光蛋白 麦芽糖结合蛋白 纤维素结合结构域 链亲和素结合肽 亚氨基二乙酸 次氨基三乙酸 三羧甲基乙二胺 羧甲基天冬氨酸 异丙基- b d - 硫代半乳糖苷 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 扫描电子显微镜 匙孔血蓝蛋白 牛血清白蛋白 2 ( n - 吗啉代) 乙磺酸 辣根过氧化物酶 四甲基联苯胺 完全弗氏佐剂 不完全弗氏佐剂 饱和硫酸铵 氨苄青霉素 氯霉素 固定化金属螯合亲和层析 1 ( 3 二甲氨基丙基) 3 亚胺 盐酸盐 两北大学硕士学位论文 k 刖罱 近年来，随着蛋白质组学研究的发展，基因工程重组蛋白的分离纯化技术 显得尤为重要，快速、特异地将目标蛋白从复杂样品中纯化就要求选择合适的 的蛋白纯化方法。 融合标签技术是2 0 世纪末兴起的一种基于报告基因的重组d n a 技术， 融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便，并很快得到了应 用。目前常用的蛋白纯化标签是g s t ( 谷胱甘肽巯基转移酶) ，6 x h i s ( 六聚 组氨酸) 和表位标签( 如f l a g 是专为蛋白纯化和检测设计的八肽，h a 是流 感病毒血凝素表位等) ，其中6 x h i s 最为常用，带有6 x h i s 标签的融合蛋白可 利用固定化金属螯合亲和层析和免疫亲和法进行纯化。 p o r a t h 于1 9 7 5 年首次提出固定化金属螯合亲和层析( i m a c ) 的概念i ，该方 法基于蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基与固定化金属离子的相 互作用而对蛋白质进行分离纯化。其中，组氨酸是与金属离子作用较强的氨基 酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在i m a c 中有效保留，故人为设计的多聚组氨酸 便成为最常用的蛋白质纯化标签【2 j 。由于多聚组氨酸的使用，蛋白质在金属螯 合亲和介质表面的选择及特异性增强，以此达到目标蛋白的纯化。固定化金属 螯合亲和层析介质的制备常采用亚氨基二乙酸( i d a ) 、次氨基三乙酸( n t a ) 、三 羧甲基7 - - 胺( t e d ) 、7 , - - 胺( e d a ) ，三亚乙基磷酰胺m p a ) 等【”1 螯合配基。 上述螯合配基制备的亲和介质用于融合蛋白纯化，有时会存在金属离子脱落、 选择性低、蛋白结合能力弱等缺点。为改进纯化效果，国外研究者以羧甲基化 天冬氨酸( c m o a s p ) 、羧甲基化二氨基苯磺酰苯胺( c m d a s a ) 等新型螫合配基来 制备i m a c 介质，得到对蛋白结合能力强、选择性高、金属离子不易脱落的 i m a c 介质 6 - s l 。目前，国内多用i d a 、n t a 等螯合配基合成i m a c 介质并将其用 于多聚组氨酸融合蛋白的纯化i 3 1 ，而用羧甲基化天冬氨酸作为螯合配基来制 备金属螯合亲和层析介质及其应用研究未见报道。 免疫亲和纯化是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的技术，它具有高 效、高收率、浓缩效应等优点。在众多蛋白质纯化技术中，免疫亲和纯化是十 分关键的技术。标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化 西北大学硕士学位论文 【1 4 ，嘲。多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，但有两种类型的多克隆抗体可 用于免疫亲和纯化，即针对合成肽( 如6 x h i s 、f l a g 标签等) 或某种抗原的 特定区域产生的抗体。在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点 局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。目前已有商品化的特异性针 对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。 本研究以s e p h a r o s ec l - 6 b 为载体，环氧氯丙烷为活化剂，羧甲基化天冬氨 酸( c m - a s p )螯合配基制备载有c 0 2 + 的金属螫合亲和层析介质c o c m a s p - s e p h a r o s e 。将c o - c m - 缸p _ s e p h a r o s e 对六聚组氨酸融合蛋白的纯化进行了较为系 统的研究。 以6 x h i s 为半抗原，k l h 为载体蛋白合成6 x h i s - k l h 复合物，以6 x h i s k l h 为免疫原制备抗6 x t i i s 的多克隆抗体。将抗6 x h i s 多克隆抗体通过共价作用固定 在氨基末端磁性微粒表面，开展了6 m s 融合蛋白纯化研究；同时利用固定有 k l h 的金磁微粒去除多克隆抗体中抗载体蛋白k i j - i 的抗体，为下一步系统研究 6 x h i s 融合蛋白纯化奠定基础。 西北大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 融合标签技术 融合标签技术是2 0 世纪末兴起的一种基于报告基因的重组d n a 技术，其主 要过程是利用重组d n a 技术在靶蛋白编码基因的3 端或5 ，端融合某种标签的 编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质i l e - 2 0 ，表达的重组蛋白质可以通 过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签技术 的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。近几年，随着新的融合标签系统 的开发，其功能逐渐多样化，除用于蛋白质纯化外，还用于蛋白质定位和检测 等。 1 1 融合标签的种类 融合标签根据其分子量大小可分为两大类；大的蛋白质分子( 或蛋白质结 构域及其衍生物) 和小的多肽片段。大的蛋白质标签有g s t ( 谷胱甘肽巯基转 移酶) 、s p a ( 葡萄球菌蛋白a ) 和g f i ( 绿色荧光蛋白) 等，它的使用会增加 目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。小的 多肤标签有6 h i s ( 六聚组氨酸) 、h a ( 流感病毒血凝素表位) 、c - m y c ( 人p m y c 蛋白表位) 、f l a g ( 专为蛋白纯化和检测设计的八肽) 等，多数情况下， 由于多肽标签相对较小，对融合蛋白质结构影响小，不需要从融合蛋白质中切 除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。迄今为止，已有文献较为详尽地报 道了各种融合标签【2 1 2 2 1 ，其大小从几个氨基酸到蛋白质不等，相互作用类型包 括酶与底物，细菌受体与血清蛋白，六聚组氨酸与金属离子，抗原与抗体等 ，表1 1 列出了目前报道较多的标签融合系统。 1 2融合标签技术的应用 1 2 1 用于蛋白的纯化 融合标签技术用于重组蛋白质纯化己为大量实验所证实 2 , , - 2 s l 。理论上，根 据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互 作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。目前已有许 多不同的标签可供利用。它们利用了标签与固相配体问的相互作用，从而可从 4 西北大学硕士学位论文 复杂的提取物中对标签融合蛋白进行选择性的结合和洗脱。目前常用的蛋白纯 化标签是g s t ，h i s 和表位标签。 最常用的标签是多聚组氨酸，即h i s 标签。该标签由6 - 1 0 个连续组氨酸组 成，置于蛋白的氨基或羧基末端。h i s 标签与其它标签相比有很多明显优势： 对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力【冽；与金属离子的结合不受变 性剂( 尿素、胍) 的影响；温和多样的洗脱条件0 0 0 2 5 0m m o l l 咪唑，低 p h ，1 0m m o l le d t a ) 。目前已有各种商品化介质( n i n t a - a g a r o s e 。n i - i d a - a g a r o s e ) 提供。另外，抗h i s 标签的单抗或多抗也被应用于h i s 融合蛋白的纯化。 g s t 标签是用来从细菌表达系统中纯化蛋白较为成功的标签之一。在该系 统中，g s t 与被标记的蛋白进行融合p 川，融合后的蛋白可在许多表达系统中表 达。g s t 和谷胱甘肽紧密结合，融合蛋白可通过谷胱甘肽固相柱纯化，洗脱未 结合的蛋白后，结合蛋白可用含游离的谷胱甘肽缓冲液进行洗脱。该系统中被 融合的目标蛋白常可正确的折叠成为有功能的区域，故十分有用。该系统的另 一个优势是可快速、温和地纯化，配体谷胱甘肽的成本较低。 表位标签( h a 、c - m y c 和f l a g 等) 也已广泛用于融合蛋白的纯化研究。目 前已有商品化针对表位标签的单克隆抗体。为使标签在纯化中发挥良好的作 用，在纯化过程中应尽量避免使用剧烈的条件使抗体和标签之间解离，剧烈的 条件可使抗原发生不可逆变性，目标蛋白的回收率低。用游离多肽竞争洗脱法 洗脱结合在固相抗体上的标签融合蛋白，是优选的方法。目前，h a ，微管蛋白 标签【3 1 3 2 、k t 3 标签( s v 4 0 大1 抗原的羧基末端) 3 3 j 和f l a g 等已成功的用多肽 洗脱方法进行了蛋白纯化。 1 2 2 用于蛋白质固定和检测 阐明蛋白质之间的相互作用，描绘出蛋白质相互作用的网络图谱是蛋白质 组学研究的重要内容。用于研究蛋白质之间相互作用已有很多成熟的技术平 台，如生物芯片以及基于表面等离子体共振原理的b i a c o r e 系统。这些技术的关 键步骤是将某种生物分子( 蛋白质、核酸等) 固定在固相基质上。利用融合标 签与其配基之问的相互作用可较好地将蛋白固定在固相载体表面。融合标签通 常是一些小的短肽分子或蛋白质，这些标签在目标蛋白质与固相基质之间起到 了一种间隔臂( s p a c e ra r m ) 的作用，极大程度地减少了目标蛋白质与固相基质直 5 西北大学硕士学位论文 接接触的机会，同时由于融合标签通常位于融合蛋白质的n 端或c 端，从而可使 其活性中心充分展露，形成一种均质配基表面，而这种均质表面的形成对于生 物芯片以及基于b l a c o r e 系统的实验成功非常关键m3 5 1 。不同融合标签系统的使 用将为蛋白质的定向固定提供多种多样的选择。 用于蛋白检测的标签种类较多，其中荧光标签和表位标签最为常用，前者 可在活细胞中进行检测，后者可用于细胞染色、免疫沉淀以及免疫印记中蛋白 检测。荧光蛋白标签可对融合蛋白在活细胞中适时检测，在研究蛋白定位及其 动态变化时具有特别重要的意义【甄3 7 1 。最近开发出更多活性较强的标签以及发 出不同颜色的各种荧光标签，极大地扩大了荧光蛋白标签的使用范围i 搠。采用 抗g f p 抗体可将该标签用于细胞染色、免疫沉淀以及免疫印记技术中，但是， 与分子质量较小的表位标签相比，分子质量较大的标签，可能更容易对目标蛋 白的调节和功能产生影响。 表1 1 常用的融合标签系统 t a b l e1 - 1c o m m o n l yu s e df u s e dt a gs y s l e m 标签类型配基标签功能 6 x h i sn p - n t a 、c o z * - c m a s p 蛋白纯化及固定 p o l y - a r g 阳离子交换树脂蛋白纯化、固定及检测 f l a g a n t i f ia g 单抗 蛋白纯化及检测 c - m y c a n t i - c - m y c 单抗 蛋白纯化及检测 h a a n t i - h a 单抗蛋白纯化及检测 s r n a s e a 酶的s 片段蛋白纯化、固定及检测 钙调蛋白结合肽钙调蛋白蛋白纯化及检测 壳聚糖蛋自结构域壳聚藉蛋白纯化 谷胱甘肽巯基转移酶谷胱甘肽蛋白纯化，提高蛋白产量 麦芽糖结合蛋白( m b p ) 交联淀粉蛋白纯化，提高蛋白产量和可溶 b q - 葡萄球菌蛋白a ( s p a ) i g g 蛋白纯化及检测 链亲和素结合肽( s b p )链亲和素 蛋白纯化及检测 纤维素结合结构域纤维素蛋白纯化 6 西北大学硕士学位论文 1 2 3 融合标签技术在其他领域的应用 融合标签可提高重组蛋白的产量，由于外源蛋白质对于宿主菌的异质性， 当外源蛋白质在宿主菌内表达时，宿主菌会调动各种机制来阻止外源蛋白质过 量表达，导致的直接后果就是我们所需要的目标蛋白质表达量降低。近几年的 研究发现，当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的 产量1 3 9 4 ”。 融合标签还可增强重组蛋白质的可溶性，外源蛋白质在宿主茵内表达时大 多以包涵体形式存在f 4 2 j ，致使很难获得大量有活性的天然蛋白质。为了防止 包涵体形成，一般可以采用低温诱导表达蛋白质，但这种方法并非对所有蛋白 质都有效。研究发现，一些高度可溶的蛋白质在与其它蛋白质融合后会促进融 合蛋白质以可溶形式表达，如m b p 等1 4 3 4 4 。l n v i t r o g e n 公司在2 0 0 4 年开发了 一种新型的增强可溶性表达的多肽标签( s e t - t a g ) ，该标签是通过静电排斥来防 止新生多肽相互聚集f 4 5 l 。 1 3 展望 亲和标签在蛋白质纯化过程中有重要作用，可以帮助稳定蛋白质和提高蛋 白溶解性。亲和层析得到蛋白质纯度可达9 0 - 9 9 纯化系统的选择取决于蛋白 质性质及下游应用。随着相关技术的发展，越来越多的融合标签系统不断被发 现，极大地丰富了融合标签的功能。不同融合标签系统有其共性，同时也有各 自的优势和缺点。融合标签系统的选择受到很多因素制约，如融合标签系统的 纯化条件、融合蛋白质自身的性质( p l ，细胞定位等) 、纯化基质及缓冲液成 本、融合标签的可去除性等。综合考虑融合标签的各种制约因素，尚没有一种 标签可以满足所有应用的需要。因而，两种甚至多种不同融合标签的组合使用 将成为未来融合标签技术的发展趋势。 2 金属螫合亲和层析技术 2 1 金属螯合亲和层析技术的发展 1 9 4 8 年，h e a r o n 发现水溶液中组氨酸和半胱氨酸可与c u 2 + ，z l l 2 + 形成稳定 的复合物m 。研究还发现，固定在凝胶上的会属离子c u z + 或z n 2 + 可与蛋白质表 7 西北大学硕士学位论文 面裸露有咪唑基或巯基的氨基酸残基结合。因此，含有金属离子c u 2 + 或z n 2 + 的 凝胶可用来选择性吸附表面含有组氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白质。 1 9 6 1 年，h e l l f e r i c h 提出以固定于载体的金属离子来分离小分子的概念，称 为配基交换层析( 1 i g 锄de x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，l e 耐4 7 4 8 】。 1 9 7 5 年，p o r o t h 首次提出“固定化金属螯合亲和层析( i m m o b i l i z e dm e t a l c h e l a t e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) ”的概念【1 1 ，首次成功地在琼脂糖凝胶上偶联 了螯合配基亚氨基- - l 酸( i d a ) 。i d a 与金属离子如c l l 2 + 螯合后，可与蛋白质结 合，不同组成的蛋白质与金属离子结合力不同，据此将蛋白质进行分离。最常 用的金属离子包括c u 2 + ，n i 2 , ，z b 2 + 和c 0 2 + 等过渡态金属离子。不同蛋白质分子内 的组氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等残基种类、数量、位置和空间构象不同，因 而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。 1 9 8 7 年，h o c h u l i 等在目标蛋白质末端接上六聚组氨酸多肽得到纯化的重组 蛋白质【4 ，4 9 j 。此后六个组氨酸标签广泛应用于重组蛋白质的纯化。近年来，原 核生物表达的重组蛋白质已有5 0 以上都是通过末端接有六聚组氨酸多肽而被 纯化出来【删。 目前，固定化金属螫合亲和层析技术己成为蛋白质，特别是基因重组蛋白 和多肽分离纯化最有效的工具之一。 2 2 金属螯合亲和层析作用原理 固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和 力不同对蛋白质进行分离。金属螯合亲和介质与蛋白质的作用如图1 - 1 所示。 过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩 余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质 表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的供电原子( 如组氨 酸残基的n 原子、半胱氨酸残基的s 原子) 将取代与金属离子结合的水分子 或阴离子，与金属离子形成复合物，从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。 氨基酸中的甜氨基和a 羧基，以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原 子都能参与螯合反应，由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间 8 西北大学硕士学位论文 构象不同，因而与金属配基的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化 1 5 1 1 。 蘑= 髻 耋孕嘤噶矗吁髫 图1 - 1 金属螯合亲和介质与蛋白质的作用 f 睡1 1i n t e r a c t i o no fm e t a lc h e l a t ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h i cm e d i u m a n dh i s t i n ei np r o t e i n 生物分子与金属离子间的结合强度与它们的轨道重叠程度有关，结合作用 可分为三种1 5 2 - 5 4 ： ( 1 ) 静电吸引：修饰后的基质带有净负电荷，它可吸附分离表面氨基酸残基 带正电荷的蛋白质。 ( 2 ) 配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等残基上有昧唑 基、吲哚基、巯基等，其氮原子、硫原子上未共用电子对与固定化金属离子形 成配位键。 ( 3 ) 共价键结合：固定化金属离子与蛋白质表面含硫基团作用形成共价键。 蛋白质与金属离子亲和力不同可用p e a r s o n 的软硬酸碱理论来解释【5 5 ) 。该理 论认为两个原子相互作用成键时，其中一个原子作为路易斯酸，另一个作为路 易斯碱。根据软硬酸碱理论，金属离子如k + 、c a 2 + 、m 矿、f e 3 + 属于硬酸；单 价金属离子如a g + 、c u + 归类为软酸；过渡态金属离子如c u 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 、n i 2 + 属于中间酸。相应的，与金属离子结合的配基如氨基酸或蛋白质可分为三类 碱，其中含氧原子( 如羧基) ，脂肪族的氮原子( 如天冬氨酸和谷氨酸) 和磷 原子( 如磷酸化的氨基酸) 的配基属于硬碱；含硫原予( 如半胱氨酸) 的配基 9 。吣 l厶声 椤 一 c c l 湮 西北大学硕士学位论文 属于软碱；含芳香族氮原子( 如组氨酸、色氨酸) 的配基属于中间碱。中闯酸 c u “、c 0 2 + 、z n 2 + 、n i 2 + 可与含芳香族氮原子( 如组氨酸、色氨酸) 的中间碱以 及半胱氨酸结合。由于蛋白质表面裸露氨基酸中半胱氨酸极少，因此组氨酸残 基是与过渡态金属离子结合的主要基团陋蚓。 六聚组氨酸融合蛋白在金属螯合亲和层析介质表面结合和解离流程如下： ( 1 ) 将螯合配基以共价结合的方式固定在固相载体上。 ( 2 ) 加入含有金属离子如c 0 2 、n i 2 + 的溶液，金属离子会与螯合配基形成配 位键而固定在固相载体上。 ( 3 ) 加入含有六聚组氨酸融合蛋白的溶液或发酵液，使六聚组氨酸融合蛋白 与金属离子间以配位键方式结合在固相载体上，而与金属离子没有作用力的蛋 白被分离出去。 ( 4 洗脱结合在固相载体上的六聚组氨酸融合蛋白。对金属螯合亲和层析 介质上所结合的六聚组氨酸融合蛋白常用p h 值( p h4 巧) 或含咪唑的溶液进 行洗脱，低p h 可减弱蛋白和金属离子的相互作用，使六聚组氨酸融合蛋白得 以洗脱，而咪唑是竞争性取代剂，可置换结合在介质上的六聚组氨酸融合蛋 白，较低的p h 和咪唑互相配合可更好地使六聚组氨酸融合蛋白被洗脱协l 。 2 3 金属螯合亲和层析介质的制备 2 3 1 载体的选择 理想的载体( 基质、固定相) 应具有下面的条件： 具有亲水性，高分子量的生物活性物质蛋白质在一些高疏水材料如聚苯 乙烯表面易变性失活。为防止蛋白变性，一般采用天然多糖作为载体，因其具 有亲水性，生物相容性好，能为蛋白质提供温和的接触环境，同时还有内部扩 散阻力小，吸附容量大等特点。载体具备连接螫合配基的相关官能团。同时 有较高的理化稳定性，对p h 、离子强度变化不敏感，不会造成吸附剂的流失等 特点。非特异性吸附很少。硅胶类无机载体由于含有大量的硅羟基，非特异 吸附很强，很少直接作为蛋自质吸附材料使用。有良好的机械强度，能适应 一些常用的分离设备如色谱柱、扩张柱床( 也称膨胀床) 等对吸附剂强度的要 求。 1 0 西北大学硕上学位论文 载体材料的性能是决定吸附剂吸附效果和应用范围的关键。琼脂糖凝胶是 最常用的载体材料，纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基甲基丙烯 酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂及上述物质的衍生物和共聚物 的应用也有报道吲，此外，大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石等无机材科吲也被应 用。近年来，又出现了以超滤膜或微滤膜为载体的固定化金属螯合亲和膜 s 蹦o l 。和以磁性材料为载体的固定化金属螫合亲和磁珠f 6 1 侧。 c 洲 n = h o h n t a h n - 一c h 。一c h 。一n - c c 岫h 2 c o 。o 。： c 0 0 h i h m c h c h 2 c 0 0 h c h 2 c o o h c m a s p 图1 - 2 常用螯合配基的化学结构 f i g 1 - 2t i l es t x u c t u r eo f c h e l a t i n gl i g a n d 2 3 2 螯合配基的选择 金属螯合配基的选择至关重要。若不能将金属离子牢固结合到聚合物载体 上，容易产生金属离子泄漏、分配选择性差等问题。在选择螯合配基时，综合 考虑两个因素：螯合配基的配位原子数和金属离子的配位数。在螯合配基分子 中应至少具备两个配位原子，配位原子数越多，形成的螯合物越稳定。 对于c u 2 + n i “，z n 2 + , c o “等过渡态金属离子，常用的螯合配基有亚氨基二 乙酸( i d a ) 、三羧甲基7 - - 胺( t e d ) 、次氨基- - - 7 酸( n t a ) 及羧甲基化天冬氨酸 ( c m - a s p ) 2 - 4 1 ，结构见图1 2 。该类试剂的共同点是：分子结构中都含有可提供 孤对电子的n ，0 原子，每个分子中可作为配位原子的数目至少有3 个；与金属离 子作用时，生