（生物化学与分子生物学专业论文）一个神经系统高表达蛋白bex1与其相互作用蛋白lmo2在转录调节中的功能研究.pdf

中国协和医科大学博士学位论文 摘要 基因的表达调控是发育的重要环节，转录水平的的调控又是特定基因表达调控的 中心环节，每一个基因的开启或关闭，以及表达量的多少，最终决定着细胞的命运。 转录调节是一个复杂的过程，转录因子在转录调控中发挥着重要作用，转录因子通过 与调控元件及其他蛋白的相互作用完成复杂的转录调控过程。近年来，含l i m 结构 域的蛋白在转录调控中的作用以及在发育中的作用正受到越来越多的关注。l i m 这一 名称来源于l i n l l ，i s l l 和m e c 3 的首字母缩写，这三个来源不同的蛋白都含有一种 介导蛋白相互作用的双锌指结构。l i m 家族蛋白有两大类：细胞浆定位的和细胞核定 位的。根据l i m 蛋白所含有的其他结构域，核定位的l i m 蛋白又分为三类，l i m h d ( 同源结构域l i m ) ，l i m 。k i n a s e ( 激酶结构域l i m ) ，和无其他明显的结构域的l m o ( l i mo n l y ) 。l m 0 2 即是l m o 中的一员。在以往的研究中发现这个蛋白与 g a t a l ，t a l l ，e 2 a , n l l l 等蛋白形成s c l 转录复合体，调节下游基因的表达。我们 应用酵母双杂交体系在人四月胎脑e d n a 文库中筛选b e x l 相互作用蛋白时，发现 l m 0 2 可以与b e x l 相互作用。人的b e x l 蛋白是b r a i n e x p r e s s e d x c h r o m o s o m el i n k e d p r o t e i n l 的缩写，它在脑和睾丸组织中高表达。b e x l 由1 2 5 个氨基酸构成，除c 端 的出核信号外，无其他的明显的已知的蛋白结构域。目前，对这个蛋白的功能的研究 很少。 据文献报道，l m 0 2 基因在神经系统是高表达于海马的，所以，明确b e x l 基因在 神经系统的表达部位对于分析二者相互作用的功能是有很重要的意义。本实验用原位 杂交技术详细的描述y d , 鼠b e x l 在中枢神经系统的表达分布，结果显示，b e x l 高 表达于小鼠的海马。同时，我们还应用了r t - p c r 技术证明：在人胎脑的海马中有b e x i 和l m 0 2 两基因的表达。 一个基因在某一生理过程中的表达变化情况往往可以对其功能有重要提示作用。 为了分析鼠b e x l 和鼠l m 0 2 在神经系统中的表达变化情况，我们设计了针对这两个基 因的特异的探针，对不同胚胎发育期的小鼠及成年小鼠的脑组织进行了n o r t h e m 杂交 实验，结果显示，鼠b e x l 和l m 0 2 在神经系统中发育过程中的变化趋势是一致的，都 ! 旦堡塑里型查堂竖主兰堡丝苎 是在胚胎期高表达，而在成年后急剧降低。鼠b e x l 的表达变化趋势和l m 0 2 相似，提 示，这两个基因可能在神经系统的发育过程中有协调关系。 为了验证l m 0 2 和人b e x l 的相互作用，我们首先应用激光共聚焦共定位技术， 研究了人b e x l 和l m 0 2 两蛋白的亚细胞定位以及两者的共定位情况。结果证实， 人b e x l 主要定位于细胞核，在胞浆有少量分布。l m 0 2 只定位于细胞核。共定位分 析表明，两者在细胞核的定位信号是互相重叠的。随后我们又应用了p u l l d o w n 技术 进一步验证了人b e x l 和l m 0 2 的相互作用是特异的。 为了分析人b e x l 和l m 0 2 相互作用的意义，我们利用神经母细胞瘤来源的细 胞株一m 1 7 的核抽提物对l m 0 2 和人b e x l 进行了凝胶电泳迁移率超迁移分析 ( e m s a ) ，从m 1 7 细胞核抽提物形成的l m 0 2 超迁移带说明在神经细胞中s c l 复 合体的存在，结果还证明：人b e x i 可以特异的参与到s c l 复和体中。为了进一步 阐明在神经系统中，人b e x l 参与l m 0 2 的s c l 复合体的功能意义，我们将l m 0 2 的一个作用元件即c - k i t 基因的启动区，构建到荧光素酶报告检测系统中，研究了人 b e x i 对l m 0 2 转录调节活性的影响。 在缺失l m 0 2 的细胞株g 一4 0 1 内，我们发现，b e x l 对报告基因的转录活性没有 影响。但是在m 1 7 细胞内，当我们用i r n a 技术对b e x l 进行k n o c kd o w n 后，发现 报告基因的转录活性有明显下降。这表明，b e x l 是通过l m 0 2 对c - k i t 基因的启动 区进行转录调节的。 为了进步分析人b e x l 蛋白对l m 0 2 蛋白的直接影响，我们还设计了 l m 0 2 一g a l 4 融合蛋白一报告系统，目前这一实验正在进行中。 本研究结果初步揭示了入b e x l 蛋白和l m 0 2 蛋自在调节基因转录过程中的作 用机制及相互关系，丰富了我们对l m 0 2 在神经系统中生物学功能的认识。 2 中国协和医科大学博士学位论文 a b s t r a c t t h er e g u l a t i o no f g e n ee x p r e s s i o np l a y sak e yr o l ei nt h ep r o c e s so fd e v e l o p m e n t ， a m o n gw h i c h ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o ni st h ec e n t r a le v e n t t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o ni t s e l fi s av e r yc o m p l i c a t e dp r o c e s s ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o rs o m e h o wi st h em o s ti m p o r t a n t m o l e c u l e s t h ew h o l ep r o c e s sr e q u i r e sb o t ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s a n dd n a e l e m e n t s ，a n dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r s i nr e c e n ty e a r s ， t h ef u n c t i o n so fl i m f a m i l yp r o t e i n s ，e s p e c i a l l yi nd e v e l o p m e n t ，h a v ed r a w nm o r ea n d m o r ea t t e n t i o n t h e s e p r o t e i nf a m i l ym e m b e r s w h i c hs h a r eat a n d e md o u b l ez i n cf i n g e r s t r u c t u r e ，o b t a i n e di t sn a m ef r o mt h et h r e ef i r s t i d e n t i f i e dm e m b e r s l i n ll ，! s 1 1 ，a n d m e c 3 。i th a sb e e ns h o w nt h a tu md o m a i nw h i c hc o n t a i n st w oz i n cf i n g e r sc a l lm e d i a t e p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o nb u tn o t d n a - p r o t e i ni n t e r a c t i o n ，l i mp r o t e i n s c a nb e c l a s s i f i e dl i m - h d ，l i m k i n a s ea n do t h e r sa c c o r d i n gt oo t h e ra d d i t i o n a ld o m a i n ss u c ha s h o m e o d o m a i n ，k i n a s ed o m a i n l i mp r o t e i n sw i t h o u to t h e rd o m a i n sa r ec a l l e dl m o ( l i m o n l yp r o t e i n s ) t h e ya l s oc a n b ec l a s s i f i e da sn u c l e a rl o m sa n d c y t o p l a s m i cl o m s l m 0 2i so n e & n u c l e a rl m o s l m 0 2w a ss c r e e n e do u ti ny e a s t t w o h y b r i d i z a t i o na s s a yu s i n g ab a i tp r o t e i nb e x i ( b r a i ne x p r e s s e d ，x - c h r o m o s o m el i n k e dp r o t e i n1 ) ，i t sf u n c t i o n i s p o o r l yu n d e r s t o o d e x c e p tf o ri t si n v o l v e m e n ti nx - i n a c t i v a t i o n b e x li sas m a l lp r o t e i n ( 1 2 5 a a ) ，w i t ha l e u c i n e r i c hn e sl o c a t e di nt h ec - t e r m i n u s i th a sb e e ns h o w nt h a tl m 0 2i sl o c a t e ds p e c i f i c a l l yi nh i p p o c a m p u si nt h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ( c n s ) - ns i t uh y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a tb e x li sa l s oh i g h l ye x p r e s s e di n h i p p o e a m p u s n o r t h e r nb l o t sa n a l y s i ss h o w e d e dt h a tt h e e x p r e s s i o np a t t e r n so fb e x la n dl m 0 2 o v e r l a p p e di nm o u s eb r a i nd e v e l o p m e n t b o t ho ft h e mh i g h l ye x p r e s s e di ne m b r y o ，w h i l e d e s c e n d e ds h a r p l ya f t e rb i r t h ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h e s et w og e n e s m i g h tf u n c t i o ni na 3 中国协和医科大学博士学位论文 c o m m o n w a y - b e x la n dl m 0 2c o l o c a l i z ei nn u c l e u sb yc o n f o c a l l o c a l i z a t i o ni m p l i c a t et h e s et w o p r o t e i n sm a yi n t e r a c t e a c ho t h e ra n dt h i si n t e r a c t i o nw a sf u r t h e rd e m o n s t r a t e db y p u l l d o w na s s a y e m s ah a sb e e nu s e di nt h i ss t u a yt oi n v e s t i g a t ew h e t h e rb e x li si n v o l v e di nt h ee v e n t o fb i n d i n gd n at o g e t h e rw i t l ll m 0 2 l m 0 2i so n eo fc o m p o n e n to fc o m p l e xs c l ( i n c l u d e s t a l l ，e 2 a ，n l i ，e t c ) i nh e m a t o p o i e t i c s t e mc e l i o u re m s ar e s u l t s i m p l i c a t e dt h a tb e x li s ac o m p o n e n to ft h es c l c o m p l e xa n di n t e r e s t i n g l y ，t h i sc o m p l e x a l s oe x i s t si nn e u r o b l a s t o m a - o r i g i n e dc e l l ( t h en u c l e a re x t r a c t sw e r ea c h i e v e df r o mm 1 7 c e l l ) t of u r t h e re x p l o r et h es i g n i f i c a n c eo ft h e i ri n t e r a c t i o n ，i nv i v ol u c i f e r a s ee x p e r i m e n t w a se m p l o y e dt ot e s tw h e t h e rb e x la n dl m 0 2 f u n c t i o n a l l yc o l l a b o r a t e c - k i ti sab r o a d l ye x p r e s s e dr e c e p t o ro fs t e r nc e l lf a c t o rf m a s tc e l lg r o w t hf a c t o r ) i t p o s s e s s e sat y r o s i n ek i n a s ea c t i v i t ya n d i ti sa v e r yi m p o r t a r t ti nd e v e l o p m e n t 。l m 0 2c a n b i n dt oi t sp r o m o t e rr e g i o n o u rr e s u l ti n d i c a t e dt h a to v e r e x p r e s s i o no fb e x li na l ll m 0 2 d e p l e t i o nc e l l ( g 一4 0 1 ) h a sn oe f f e c tt oa c t i v a t ec - k i tp r o m o t e r ，w h e r ei nm 1 7 ，t h ev i c e y e r s a m 1 7e x p r e s s e sa l lt h ep r o t e i n so fs c l ，a sw e l la sb e x l b yi r n a t e c h n o l o g y ，w e f o u n do u td e l e t i o no f b e x li nm 1 7c e l lh a sas i g n i f i c a n te f f e c to nt h ee x p r e s s i o no f r e p o r t g e n e t h ee f f e c to f r e m o v i n gb e x l i ss i m i l a rt ot h a to f o v e r e x p r e s s i o no f l m 0 2 t a k e n t o g e t h e r ，t h e s er e s u l t sb r i n g u st h ec o n c l u s i o nt h a tb e x li sa t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r t h a ts p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nh i p p o c a m p u s 。b e x le x e r ti t se f f e c tt h r o u g hi n t e r a c t i o nw i t h l m 0 2 ，a n dm a yr e g u l a q t el m 0 2 sf u n c t i o ni na g i v e n c i r c u m s t a n c e 4 中国协和医科大学博士学位论文 前言 基因组被称为是“生命的蓝图”。我们人体中的每一个细胞都有这本蓝图，然而 我们的细胞却是在功能和形态上千差万别的。造成这一现象的原因是，蓝图的实现在 于基因的表达，而每一个基因的表达都受到了严密、精确的调控。基因的表达调控是 一个多层次的非常复杂的过程，对于一个具体的基因来说，转录水平的调控是其中一 个很重要的环节。 以人脑为代表的中枢神经系统极为复杂，其所表达的基因数目就反映了这一点。 人脑表达了人基因组中已知基因的5 0 以上，所以，人脑的细胞受到了极为复杂的转 录调控。 一个具体基因的开启或关闭，以及表达量的多少，是由转录因子和转录调节因子 以及这些因子的应答元件决定的。在这一过程中，既有因子和元件的相互作用，也有 因子与因子间的相互作用。这些相互作用是在转录水平精密调控基因表达的基础。近 年来，人们在研究中发现了很多转录因子蛋白家族，如h o x 蛋白家族，m y c 蛋白家 族，s t a t 蛋白家族，b h l h 蛋白超家族，k e l c h 蛋白超家族，等等，它们都通过与 其他的蛋白相互作用来完成精密的转录调节过程。 近年来，含u m 结构域的蛋自在转录调控中的作用以及在神经发育中的作用正 受到越来越多的关注。 l i m 这一名称来源于l i n l l ，i s l l 和m e t 3 的首字母缩写，这三个来源不同的蛋 白都含有一种介导蛋白相互作用的双锌指结构。l i m 家族蛋白有两大类：细胞浆定位 的和细胞核定位的。根据l i m 蛋白所含有的其他结构域，核定位的l i m 蛋白又分为 三类，u m _ h d ( 同源结构域l i m ) ，l i m - k i n a s e ( 激酶结构域l i m ) ，和无其他明显的 结构域的l m o ( l i m o n l y ) 。l m 0 2 即是l m o 中的一员。人的l m 0 2 蛋白由1 4 7 个 氨基酸组成，含有两个l i m 结构域。在对果蝇的研究中，发现果蝇的l m 0 2 蛋白在 神经系统的发育和体节的发育中发挥重要功能。其作用方式主要是作为一个重要的竞 争因子，通过其l i m 结构域与l i m - h d 类的蛋白竞争l i m 结构域结合蛋白，从而影 响转录。 ! 里垫塑墨型查堂堂主堂垡兰苎 人的l m 0 2 基因最早是在研究急性淋巴型白血病的致病机理时发现的。在正常情 况下，l m 0 2 基因在造血系统只表达于干细胞，但是，当异常的染色质易位导致l m 0 2 基因持续的高表达时，使干细胞分化失败，从而导致细胞的异常增殖。 l m 0 2 蛋白发挥功能的分子机制主要是通过和e 2 a ，g a t a 1 ，t a l l 等b h l h 类 的d n a 结合蛋白以及n l i i 等其他蛋白相互作用，形成转录调节复合体( s c l 复合 体) 调节基因的转录。这个转录调节复合体的调控序列有两种模式，一种是g a t a 盒 + e 盒，另一种是两个e 盒。目前已经发现的l m 0 2 作用元件存在于c - k r 基因的启动 区5 0 0 b p 的范围内，含有4 个e 盒。这些发现对进一步研究l m 0 2 及其相互作用蛋 白的功能提供了依据。 人的l m 0 2 基因表达于造血组织，中枢神经系统，肺，肾，肝脏和脾脏。l m 0 2 基因在中枢神经系统的表达仅限于海马组织。但是，目前这个基因在海马组织的功能 还没有更新的研究。据最近的研究表明，海马组织的细胞有再生能力。 我们对于l m 0 2 的关注是在我们研究另外个基因功能的过程中开始的。这个 基因称为b e x l ，人b e x l 基因编码一个1 2 5 个氨基酸的小蛋白。1 9 9 9 年b r o w n 在筛 选小鼠单性生殖胚胎和正常胚胎发育过程中差异表达的基因时，分离得到了这个新基 因。它在小鼠单性生殖的胚泡中表达明显增高。该基因被定位于染色体的x q 2 2 ，由 于它在脑中有很高的表达，因此被命名为脑中表达的，x 连锁基因，即b e x l ，但实 际上对于b e x l 在脑中的功能了解很少。后来，我们的合作单位“上海联合基因集团” 的实验室在筛选人胎脑e d n a 文库中的新基因时获得了人b e x l 的e d n a 。 我们对人b e x l 蛋白进行了较详尽的生物信息学分析，获知其编码的蛋白没有信 号肽，没有任何现在已知的结构域，只是在其c 端具有一个富含亮氨酸的出核信号。 通过亲疏水性分析，未见明显的疏水区段，不具有膜蛋白的特征。通过p - s o r t 软件 分析其细胞亚定位，表明b e x l 最可能是定位于核内。上述分析结果表明，这个蛋白 可能是一个可存在于细胞核的小分子，它的功能可能是介导分子间的相互作用。据此 推测，b e x l 蛋白可能和基因的表达调控有关。 在本室的研究中发现，b e x l 是一个高表达于海马的基因，在我们进行酵母双杂 交人四月胎脑e d n a 文库的筛选实验中，我们褥到了一个克隆，其e d n a 序列编码 的蛋白为l m 0 2 。我们的实验即是以这两者相互作用的发现为线索，探索两者在转录 ! 里塑塑堕型奎茎塑圭堂垡堡苎 调节中的分子机理，以及两者在神经细胞中的功能。我们的实验，可能为揭示海马组 织能够再生的机理提供一些线索。 中国协和医科大学博士学位论文 a 实验材料 材料与方法 1 实验动物 b l c 小鼠，昆明小鼠，新西兰大白兔购自医科院药检所动物中心。 2 菌株 1 ) 大肠杆菌 e c o l id h 5a f 一每8 0 d l a c z a m l 5r e c a le n d a l 用于质粒的扩增与 g y r a 9 6t h i 一1h s d r l 7 ( r k - m k + )转化 s u p e 4 4r e l a ld e o r a ! ! ! 竖坠：型旦旦! ! 生 e c o l i h s d sg a l ( c l t s 8 5 7 i n d ls a r n 7 n i n 5 用于重组蛋白质的 旦兰：! ! ! 里星1 2 1 竺型! ：! 塑壹鲨 2 ) 酵母菌株 a d e 2 - 1 0 1 ，t r p l 一9 0 1 ，l e u 2 3 ，11 2 ，g a l 4 ，统2 实验 g a l 8 0 ，c y h r 2 ， l y s 2 ：g a l l u a s h i s 3 t a t a h i s 3 ， u r a j ：g a i u a s - g a l l t a t a - l a c z s f y 5 2 6 m a t a ，t r p l 9 0 l ，l e _ i 】2 3 ，1 1 2 ，u r a 3 5 2 用于酵母聂磊葛_ h i s 3 2 0 0 ，g a l 4 a ，g a l s 0 a ，验证 l y s 2 ：g a l l u a s g a l l t a t a h i s 3 ，m e l l g a l 2 u a s g a l 2 t a t a a d e 2 ， u r a 3 ：m e l l u a s - m e l l t a t a - l a c z 大肠杆菌菌株由本实验室提供，酵母菌株y 1 9 0 ，a h l 0 9 购自c 1 0 n t e c hl a b o r a t o r i e si n c 3 质粒载体 p g e m te a s y ：用于p c r 产物的克隆。 p g e x 一4 t - 1 ：用于原核细胞中基因表迭。 p a s 2 1 ：含o a l 4 d n a 结合结构域( b d ) 编码序列，用于酵母双杂交系统2 实验。 中国协和医科大学博士学位论文 p a c t 2 ：含g a l 4 转录激活结构域( a d ) 编码序列，用于酵母双杂交系统2 实验。 其中，p a s 2 1 ，和p a c t 2 及酵母双杂交文库购自c l o n t e c hl a b o r a t o r i e si n c p g e m - t e a s y 购自p r o m e g a 公司。其它由本室提供。 所用载体的结构简图如下 1s 1 4 2 0 2 6 3 7 4 3 4 3 4 9 5 2 6 4 7 0 7 7 7 7 。 8 8 9 0 9 7 1 0 9 1 1 8 1 2 7 1 4 1 中国协和医科大学博士学位论文 i 1 柙 c 0 66 t a l t gc a at a c 唾丝盯e c 6 g 8 g a a t r t c t t a t 6 析t a t g 酐t t t t 盯1 耵t 世觚触g t t m m a t 觚b t 6 ，辨粼娥 t a t a c a a a t i - f t a a a g t | b a c t c t f a g 6 t t t i a a a a c 8 气面丽丽面蕊丽 中国协和医科大学博士学位论文 酣哺些! 旦皇! 竺竺! ! 堡塑! 卜b i 强 b , p , a t a c ca g r a c a t bg a t g a t6 t a t a t a a gt 耵g t a t wg a tn a t 日m 晰 c cc 帆n c a 羔盎一丽l-la斟opizopaaac c a a a a a a a g a b a t c t s t a t 8b c t t a i ：；c c a t a c g a tc而cag a t t a c l 3 c t a g c 丌。 c盯 t t g ! 里塑塑堕型查兰堡主兰堡笙苎 箸争黯霈粥御 中国协和医科大学博士学位论文 p o d 吣, t h s 刑l s p am u l t i p l ec l o n l n g 爱 a n 9 2 2 9 7 s 1 0 3 0 b o h l i 6 , v e t t e 趟捌畦蹦l o 1 0 时。州蝴c 勰cc t “挑c 坩粥c 翻炯销c 舳c c 时 4 n c 4 e t h a t t h 帅t u r o t w o 脒| 硝i 雌h l b e p u 叫i | l k 帆 蹯搿磊嘶 格跫萤|蹬：净端西叭，粼器墼鬻 塞瓣 e ce一【，$瞰_cs l =一埘吾l叫1蚕 c c e t y i _ t $ g 甜耄一黜鼬一龇主| 善羹一 气巍嚣 裟登= 一 然嚣褥 中国协和医科大学博士学位论文 广- 业! 苎! 堕! 坚塑些肿瞬_ 哗6 i 恸1 目酬 暇概。幽黼。锄。如落磕鹾躁霖晶& r g 8 5 ￥i 叩叫i 邓”哪州 蚧2 搿嬲搿鬻嚣鬻。馏拙搿搿恕瘿怒黥惑稀船踩 叩l ! 翌! 一 生“雕。一一一 婴兰黧 9 7 6 躐躐囊鬻鞴瓣惑赫鼹攀蒲掰辩鼢8 i 嚣瓣甄翳 婶。! ! 竺璺墅! ! 整即 一 觳然糯瓣瓣攥徽鼷辩摧礅q 懒g c 强玳蔽 堕! 匦竺业啦些 l o b ；c 删棚髑o o r 出 中国协和医科大学博土学位论文 4 c d n a 文库 与g a l 4 a d 融合的入脑p a c t 2 文库均购自美国c l o m e c h l a b o r a t o r i e si n e ，。p a c t 2 文库以大肠杆菌b n n l 3 转化子的形式提供。 人脑快速筛选矩阵c d n a 文库平板( h u m a n t e s t i sr a p i d s o t e e n t ma r r a y e dc d n a l i b r a r yp a n e l s ) 购自美i 雪o r i g e n et e c h n o l o g i e si n c 。该文库以构建在p c m v 6 一x l 4 的质粒 形式提供。 5 工具酶及d n a 分子量标准 各种限制性内切酶，d n a 聚合酶大片段( k l a n o wf r a g m e n t ) ，t 4d n a 连接酶购自 美国n e we n g l a n db i o l a b s 公司，p r o m e g a 公司，g i b c o b r l 公司及协和友谊开发 公司。r n a s ea 购自美国s i g m a 公司。 d n a h i n d l i i ， d n a m i n d i i i + e c o r i ， p b r 3 2 2 m s p i ，p b r 3 2 2 h i n f i 为协和友谊开发公司产品。d l 2 0 0 0 d n am a r k e r 购自 大连宝生物有限公司。 6 试剂盒 p g e m te a s y v e c t o rs y s t e m 购t 自p r e m e g a 公司，酵母双杂交系统试剂盒m a t c h m a k e r t w o h y b r i ds y s t e m2 ，t w o h y b r i ds y s t e m3 购1 自c l o n t e c hl a b o r a t o r i e si n c 。b c a 蛋白质测定试剂 盒购自p i e r c e 公司。e c l 试剂盒购自中山生物工程公司。d n a 快速纯化回收试剂盒购自博大生物 公司。c o n c e r t r m h i g hp u r i t yp l a s m i d p u r i f i c a t i o ns y s t e m 贴j 自g i b c o - b r l 公司。 7 主要化学试剂 异丙基硫代半乳糖苷( i p t g ) 购自p r o m e g a 公司。焦碳酸二乙酯( d e p c ) 、十 二烷基磺酸钠( s d s ) 、明胶、溴化乙锭等为s i g m a 公司产品。三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 、 琼脂糖、尿素、鲑精d n a 与酵母t r n a 等购自g i b c o - - b r l 公司。l i p o f e c t a m i n 2 0 0 0 购自i n v i t r o g e n 公司，g 4 1 8 购自s i g m a 公司。快速杂交液( e x p r e s s h y b t m ) 购自美国 c l o n t e c h 公司。硝酸纤维素膜为s & s 公司或o e l m a n 公司产品，x 光片为f u j i 公 司产品。其它各种试剂为进口或国产分析纯试剂。碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶偶联 羊抗兔塘g 、羊抗小鼠i g g 、f i t c 标记羊抗兔i g g ，t r i t c 标记羊抗小鼠i g g 抗体 均购自中山生物工程公司。小鼠抗m y c 单克隆抗体购自s i g m a 公司，抗l m 0 2 多克 隆抗体购自s a n t a c r u z 公司。 中国协和医科大学博士学位论文 8 培养基 l u r i a b r o t h b a s e 、l u f i a a g a r 购自g i b c o - b r l 公司。d i f c o t r y p t o n e ，y e a s te x t r a c t ， y e a s tn i t r o g e nb a s ew i t h o u ta m i n oa c i d s 购自d i f c o 公司。 d m e m ，胎牛血清( f b s ) 购自g i b c o b r l 公司。胰蛋白酶购自s i g m a 公司。 9 主要仪器及设备 实验所用主要仪器有：冷冻高速离心机( b e c k m a n ) 、e p p e n d o f f 冷 b y , n 心机、m i l l i q p l u s 超纯水系统o “i l l i p o r e ) 、电泳仪( 国产) 、紫外观测仪及照相系统( u v pi n c ) 、 u l t r a s e a n x l 扫描仪 h a r m a c i a ) 、匀浆器( p o l y 仃a 1 1 ，s w e d e n ) 、电转仪( b i o r a d ) 荧光显 微镜及照相系统o m k o n ) 、激光共聚焦显微镜( l e i c a ，t c sn t ) 等。 1 0 d n a 序列分析软件 核酸蛋白序列分析软件d n a m a n 。 ! 里堡塑堕型查兰堕主堂竺丝苎 1 1 引物 引物名称序列用途 h b e x c d s f5 - a c tc g tg t ct c ge t ac c a g c 一3 用于扩增人b e x l 全长 h b e x c d s r5 - c t at a at g ag c at c tt t cc a tg c aa t a c d n a g - 3 m b e x c d s ，f5 - c i j i ct c tc t cc a gc c cg c - 3 用于扩增小鼠b e x l 全 m h e x e d s - r5 - c c ca t gc a at t ga t aa a tt c tg - 3 c长c d n a h b e x l 一4 t - f b 5 - c g cg g a t c ca t gg a gt c ca a ag a ga a a 用于人b e x l 蛋白表 c t a - 3 达载体的构建 h b e x l 4 t - r x 5 - c c gc t cg a g t c ag g gc a ta a g g c a - 3 h b e x l - a s f e 5 - c c gg a at t ca t gg a g t c ca a ag a ga a a 用于人b e x l 酵母双杂 c t a g c a g 一3 交诱饵质粒的构建 h b e x l a s r b 5 - c g cg g a t c cc a g g a tt e ag g g c a ta a g g c 一3 b e x l - - p e g f p - n 1 f5 - c c gc t cg a gt g ac t tg c ag g g t c ca c c 用于人b e x l 绿色荧光 x ： a t gg a g t c ca a ag a gl l a ae t a g c ag - 3 蛋白载体的构建 b e x - p e g f p - n 1 一r b ：5 - c g cg g a t c cc cg g gc a ta a gg c aa a a c t ca t e 一3 l m 0 2 3 1 一f e ： 5 - c o gg a a t t cc a ca c e c g cc g ct a g c t c 用于人l m 0 2 真核表达 载体的构建 a c ca t gt c ct e gg c ca r cg a a - - 3 1 m 0 2 3 ，1 i x 5 - c c gc t cg a gc t at a tc a tc c ca _ t tg a t c t ta g tc c - 3 1 h b e x l i - 3 f ： 5 - t t t gg g c a g t c a g c a c t g a e e c c c e c c c 用于人b e x l 的i r n a 载体构建 c c c g g g g g g t c a g t g c t g a c t g c c t t t t t - 3 h b e x l - i - 3 一r 5 - e t a g a a a a a g g c a g t c a g c a c t g a c c e e c c g g g g g gg g g g g g t c a g t g c t g a c t g c c - 3 c - k i t - p g l 3 一f5 - c g gg g ta c cg g aa c cc & ct g tg t to c ta c a用于构建带c k i t 启动 g - 3 子的荧光素酶报告基 c - k i t p g l 3 r 5 - g a ag a t c t ac g c a a gc a gt a gg a gc a g a - 3 因 中国协和医科大学博士学位论文 b 实验方法 1 载体质粒的构建 如果载体质粒和目的d n a 片段之间有相配的限制性内切酶位点，则将经相同酶 切的载体和目的片段，经琼脂糖凝胶电泳切胶回收，直接进行连接、转化。在某些 情况下，可用k l e n o w 酶将酶切后的载体或目的片段的粘性末端变为平端，以使载体 和目的片段末端相配。 如果载体质粒和目的d n a 片段之间没有相配的酶切位点，则需设计引物扩增目 的片段，在引物中引入合适的酶切位点。p c r 产物先与p g e m - te a s yv e c t o r 连接， 构建一个中间载体，再将其中的目的片段切下与经相同酶切的载体连接。 1 1 质粒d n a 的小量制各( 碱裂解法) 1 ) 挑选单个菌落接种于5 m l 含适当抗生素的l b 培养液中，3 7 剧列震摇培养8 1 2 小时。 2 ) 收集3 5m l 菌液于1 5m l 离心管中，1 2 0 0 0r p m 离心3 0 秒。将菌体沉淀悬浮于 2 0 0 9 l 溶液i ( 含5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5m m o l l t r i s c i p h 8 。0 ，1 0 m m o l l e d t a ) 中，混合器上充分重悬菌体沉淀。 3 ) 加入4 0 0 肛1 新配溶液i i ( 碱裂解液含0 2m o l ln a o h ，i s d s ) ，轻轻颠倒混合 数次，冰上放置5 分钟。 4 ) 加入3 0 0 b t l 溶液i i i ( 中和液5m o l l k a e ，p h 4 8 ) 混匀后冰上放置5 分钟。在室温 下，1 2 0 0 0r p m 离心5 分钟，收集上清。 5 ) 上清中加入等体积酚氯仿( v ：v = i ：1 ) 抽提一次，4 * 0 1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟， 转移的上层水相再用等体积氯仿抽提一次，4 0 1 2 0 0 0r p m 离心2 分钟，收集上层 水相。 6 ) 加入等体积异丙醇，混匀后室温放置1 0 分钟。其后，室温下1 2 0 0 0r p m 离心5 分 钟。 7 ) 弃上清，以7 0 乙醇洗涤沉淀，沉淀于3 7 1 3 干燥后，溶于2 0 3 0u l t e 中， - - 2 0 保存。 1 2 限制性内切酶酶切反应 将质粒，一定体积的无菌d d h 2 0 ，限制性内切酶( 按3 5 u 酶l “g 质粒的比例确 1 8 中国协和医科大学博士学位论文 定所用酶量，且酶的体积不能超过酶切反应体系的l o ) 及对应缓冲液，加到o 5 m l 管中。3 7 。c 或2 5 ( s m ai ) 酶切2 4 小时。 1 4d n a 片段的玻璃奶回收法 1 ) 取一定量酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳。 2 ) 待d n a 条带迁移至适当距离时，切下待回收的d n a 条带( 体积尽量小) ，置于1 5 m l 管中。 3 ) 加入3 倍体积溶胶液，于室温反复轻摇，使凝胶完全溶化后，加入1 0i t l 玻璃奶， 颠倒混合数次，冰上放置1 0 分钟，以使d n a 与玻璃奶吸附。其间间隔2 3m i n 轻轻混合一次。 4 ) 1 2 0 0 0r p m