（生物化学与分子生物学专业论文）利用抑制消减杂交技术寻找无融合生殖相关基因.pdf

中文摘要 中文摘要 在栽培甜菜与白花甜菜连续杂交和回交的过程中，我们分离到具有 无融合生殖特性的带有白花甜菜9 号染色体的m 1 4 品系在连续p u 代的 染色体传递率分析中发现，该附加染色体通过母本的传递率高达9 7 。 根据对m 1 4 遗传学及胚胎学研究结果，我们采用抑制消减杂交技术，在 甜菜花期发育的三个关键时期进行取材，建立了减数分裂时期f 向、反 向和助细胞提前退化时期讵向以及次牟核与卵细胞自行分裂时期正向四 个消减e d n a 文库。其中减数分裂时期正向消减文库共获得2 7 6 个重组 菌落，经菌液p c r 鉴定获得了2 2 9 个阳性插入片段，片段大小均在1 0 0 1 0 0 0b p 之间。随机挑取了4 3 个菌落，以d i g 标记未消减的m 1 4c d n a 和二倍体c d n a 为探针，进行反向n o r t h e r nb l o t 朵交筛选，获得了2 4 个m 1 4 中差异表达的c d n a 片段。这些片段为m 1 4 特异表达，为以后 克隆到无融合生殖相关基因的伞皎提供了可靠的来源和保障。 关键词：无融合生殖抑制消减杂交d i g 标记 反向n o r t h e r nb l o t 杂交 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a m o n g as e to fm o n o s o m i ca d d i t i o nl i n e so fb e t ac o r o l t i f l o n , z o s si n s u g a rb e e t ，al i n e ，d e s i g n a t e da sm 1 4 ，t h a tc o n s t i t u t e so ft h en o r m a l 188 v u l g a r i sc h r o m o s o m e sp l u sbc o r o l l ( f l o r ac h r o m o s o m e9 ，w a sf o u n dt oh a v e ac h r o m o s o m et r a n s m i s s i o nf r e q u e n c yu pt o9 7 t h r o u g ho n ri n v e s t i g a t i o ni n s u c c e s s i v ef o u r g e n e r m i o n s a c c o r d i n gt o t h er e s u l t so fg e n e t i c sa n d e m b r y o l o g yo fm 1 4 ，s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) w a st a k e n t os e t u p s u b t r a c t i v ee d n al i b r a r i e si nt h r e ek e yp e r i o d so fm 14 d e v e l o p m e n ti n c l u d i n gf o r w a r da n dr e v e r s es u b t r a c t i v el i b r a r i e so fm e i o s i s p e r i o d ，f o r w a r ds u b t r a c t i v el i b r a r yi ns y n e r g i dp r e d e g e n e r a t i o np e r i o d ，a n d a l s oi n c l u d i n gf o r w a r ds u b t r a c t i v el i b r a r yi na t t t o t o m i z a t i o np e r i o do fe g gc e l l a n ds e c o n d a r yn u c l e a ro fc e n t r a lc e l l 2 7 6r e c o m b i n a n tc l o n e sw e r eo b t a i n e d f r o mf o r w a r ds u b t r a c t i v ec d n a l i b r a r yo f m e i o s i sp e r i o d ，2 2 9o fw h i c hw e r e p o s i t i v ei n s e r t i o n a lf r a g m e n t sw i t ht h ea v e r a g es i z e so f1o o 10 0 0b pb y p c ri d e n t i f i c a t i o n t h e n ，4 3c l o n e sw h i c hw e r er a n d o m l ys e l e c t e df r o m2 2 9 c l o n e sw e r em a d er e v e r s en o t t h e mb l o th y b r i d i z a t i o ns c r e e n i n gu s i n gm 1 4 c d n aa n dd i p l o i de d n aa sp r o b e sw i t hd i g - l a b e l e d a sar e s u l t ，2 4 f r a g m e n t sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nm 1 4w e r eo b t a i n e d t h e s ef r a g m e n t s p r o v i d e sar e l i a b l es o u r c ea n dg u a r a n t e et oc l o n et h ec o r r e l a t i v eg e n e so f a p o m i x i s k e yw o r d s ：a p o m i x i s s s hd i g - l a b e l e d i n v e r s en o r t h e r nb l o th y b r i d i z a t i o n i i 缩略词表 缩略词表 a m p ( a m p i c i l l i n ) 氨苄青霉素 b c i p ( 5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 - i n d o l y lp h o s p h a t e ) 5 - 溴一4 一氯一3 一吲哚- 磷酸 d d h 2 0 ( d i s t i l l e dd e i o n i z e dw a t e r )重蒸去离子水 d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) 焦炭酸二乙酯 d i g ( d i g o x i g e n i n ) 地高辛 d t t ( d i t h i o t h r e i t 0 1 )二硫苏糖醇 e b ( e t h i d i u mb r o m i d e )溴化乙锭 e d t a ( e t h y l e r i ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ) 乙二胺四乙酸 i p t g ( i s o p r o p y l t h i o - d - d g a l a c t o s i d e )异丙基硫代一p d - 半乳糖苷 l b ( l u r i a - b e r t a n im e d i u m ) l b 培养基 n b t ( n i t r o b l u et e t r a z o l i u m )氯化硝基四氮唑蓝 n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) 美国国家生物技术 信息中心 o d ( o p t i c a ld e n s i t y ) 光密度值 p c r ( p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n ) 聚合酶链式反应 q t l ( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ) 数量性状位点 s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e )十二烷基磺酸钠 s o cs o c 培养基 s s c ( s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e )标准柠檬酸钠特 s s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) 抑制消减杂交 t r i s ( t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e ) 三羟甲基氨基甲烷 x g a l ( 5 。b r o m o 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p d g a l a c t o s i d e ) 5 - 溴一4 氯一3 - 吲哚一p d 一 半乳糖苷 1 1 1 第1 掌前言 第1 章前言 1 1 无融合生殖概述 1 1 1 无融合生殖的概念及分类 植物无融合生殖( a p o m i x i s ) 是指不经过精卵融合而以种子进行繁殖 的一种特殊的无性生殖方式。由于没有精卵融合产生的二倍体子代， 其基因型与母本精确相同，使子代继承亲代固有遗传特性，形成遗传上 稳定的可由种子繁殖的无性系2 1 。植物无融合生殖因其是通过种子进行 的特殊无性生殖，所以它可以固定有利基因型，改变育种及种子生产程 序，具有重大的经济意义，如果可以应用于重要作物，将是继2 0 世纪 6 0 年代“绿色革命”之后的又一次农业革命无性生殖革命哪】。 由于植物无融合生殖的重大科学及经济价值，长期以来吸引许多科 学家的兴趣，但仍有很多基本问题未得到解决。也正囡为如此，植物无 融合生殖的研究已成为当今生物学科中的研究热点之一。2 0 0 1 年在意大 利k o m o 召开了第二次国际无融合生殖会议吸引了2 7 个国家1 7 0 人参加 会议。讨论范围从无融合生殖机制、进化、遗传、细胞、胚胎、生态到 它的经济意义，特别是扩展了基础研究范围，把细胞周期、有性植物的 减数分裂、孤雌生殖、胚乳发育等都纳入了研究领域。近年来，每年都 有许多植物无融合生殖的评论文章发表i s , 吼8 9 1 。s a v i d a n 等人于2 0 0 1 年 编写的无融合生殖之花专著出版，充分说明植物无融合生殖已经成 为生物学科中的一个热点话题。 植物无融合生殖，按照无融合生殖发生的完全程度可分为专性无融 合生殖和兼性无融合生殖两种，其中专性无融合生殖无需经过受精自主 发育，子代基因型与母本完全一致。而兼性无融合生殖植株同时发生有 黑龙江大学硕士掌位论文 性生殖与无融合生殖，子代会发生性状分离。根据胚胎发生的起源不同 可将无融合生殖分为两类，孢子体无融合生殖( 不定胚) 及配子体无融 合生殖。不定胚是由珠心或珠被细胞直接发育成胚，与有性共存表现出 多胚现象。目前对不定胚遗传了解较少，g a r c i a 等】利用分子标记分析 杂交后代分离情况，认为不定胚的遗传控制极为复杂，至少包括6 个数量 性状位点( q t l ) 。配子体无融合生殖可分为无孢子生殖( a p o s p o r y ) 和 二倍体孢子生殖( d i p l o s p o r y ) 。无孢子生殖是由珠心体细胞直接发育成 胚囊后，由未减数卵细胞发育成胚。就被子植物而言，目前为大多数人 所认同的观点认为：胚珠发育过程中不经过减数分裂，卵细胞不经受精 卵而直接发育成胚的无性生殖过程，又称为二倍体孢子生殖。二倍体孢 子生殖是大孢子母细胞减数分裂受阻形成的，而后由未减数胚囊发育形 成胚。 配子体无融合生殖根据其未减数胚囊形成的不同，可分为9 种方式1 2 1 ： 韭型( a l l i u mo d o r u m t y p e ) 、蒲公英型( t a r a x a c u m t y p e ) 、苦卖菜型( 1 x e r i s t y p e ) 、艾纳香型( b l u m e at y p e ) 、披碱草型( e l y m u sr e c t i s e t u st y p e ) 、 蝶须型( a n t e n n a r i at y p e ) 、山柳菊型( h i e r a c i u mt y p e ) 、画眉草型 ( e r a g r o s t i st y p e ) 及黍型( p a n i c u mt y p e ) 。 1 1 2 无融合生殖研究的进展 目前尽管已在被子植物的1 4 0 个属中发现了无融合生殖的特性，但 主要都是分布在禾本科、菊科、锦葵科、蔷薇科等野生种资源中，在重 要的经济作物中很少有发现无融合生殖现象。而且由于种属间杂交不 亲合，利用现有的杂交技术转移无融合生殖基因将会遇到很大的困难。 即便有少数杂交成功，其无融合生殖基因传递率也非常低，而且作物的 营养生长也会受到很大的影响。国内外很多实验室都在对这些材料进行 第1 章前言 i l i 大量的探索工作，例如小麦和其近缘属e l y m u s 杂交、玉米和其近缘属 丹枷口c “m 之间的杂交。但由于都是属于种问或是属间杂交，需消耗大量 的时间、人力、物力，而且并没有得到品质良好的无融合生殖后代。到 目前为止，还没有选育出可供利用的具有经济价值的作物品种。b a s h a w 和h a n n a 曾推断说：用现有的传统杂交方法转移无融合生殖基因是很有 限的。 随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展，人们又寄希望于克隆 到这一基因，然后利用转基因技术将其转到其它重要的作物中。然而， 从一些研究比较深入的无融合生殖材料分析中发现，这些材料多为多倍 体，基因组数目庞大、杂合性较高，而且现在人们对无融合生殖遗传学 机理普遍认识不清，例如无融合生殖基因是显性还是隐性，是单基因控 制、两对基因控制还是多基因控制，是单一位点还是多位点等问题都没 有统一的结论。迄今为止，许多科学家已经对许多物种的配子体无融合 生殖的遗传进行了分析，例如：有报道认为大黍( p a n i c u mm a x i m u m ) i l 、 毛莨( r a n u n c u l u sa u r i c o m u s ) 的无孢子生殖为显性单基因遗传。丽三倍 体一年蓬( 西i g e r o na n n u m ) 为两个独立位点进行传递。摩擦禾 ( t r i p s a c u m ) 和白花蒲公英( t a r a x a c u mo 妒c e i n a l e ) 的遗传是受多个不 连锁位点控制的【1 6 , 1 7 , 18 】。目前认为无融合生殖是多因子构成的复合性状， 它可划分为三个主要因子：( 1 ) 缺少或改变减数分裂以阻止减数( 无减 数- - a p o m e i o s i s ) ；( 2 ) 卵细胞在没有受精的条件下，活化形成胚( 孤雌 生 n - - - p a r t h e n o g e n e s i s ) ；( 3 ) 胚乳自主或假配开始发育【l9 1 。尽管对植物 无融合生殖的遗传存在各种不同的看法，但是这种复杂的性状显然是由 基因决定的。不同物种的无融合生殖可能存在不同的发生机制。同时在 一些研究较深入的无融合生殖材料中可发现，无融合生殖性状作为一个 盂德尔遗传单位具有重组抑制的特点【2 m ，在狼尾草( p e n n i s e t u m 黑盘江大学硕士学位论文 s q u a m u l a t u m ) 、臂形草( b r a c h i a r i a d e c u m b e n s ) 、鸭茅状摩擦禾( t r i p s a c u m d a c t y l o i d e s ) 和雀稗( p a 6 p a l u ms i m p l e x ) 与玉米或水稻的比较作图中发 现，这些紧密连锁的分子标记分布在1 2 4 0 厘摩( c m ) 的范围内，也 就是说即便是紧密连锁的标记，它距离无融合生殖基因座的实际物理距 离仍然很远。2 0 0 5 年f r i t zm a t z k 等口1 1 报道在p o a p r a t e n s i s 中无融合生殖 遗传是由a i r 、a p v 、m d v 、p i t 、e p v 血个基因控制，这些基因不同表现 度及其相互作用引起了生殖方式的很大变化。也正是由于无融合生殖遗 传分析的复杂性和无融合生殖位点的重组抑制特性，使得该基因的克隆 具有很大难度。直到目前为止在无融合生殖基因克隆方面仍然没有突破 性进展。 1 1 3 甜菜m 1 4 单体附加系的获得及研究现状 白花甜菜( b e t ac o r o l l ! f l o r dz o s s ) 是甜菜属的野生种之一，具有抗 疫、抗寒、无融合生殖等优异特性。本实验室的郭德栋教授于1 9 8 8 年开 始进行栽培甜菜( b e t av u l g a r i sl ，v v ，2 n = l8 ) 与带有无融合生殖特性 的野生种白花甜菜( b e t ac o r o l l i f l o r a z o s s ，c c c c ，2 n = 4 x = 3 6 ) 杂交，获 得了异源三倍体( v v c ，2 n = 2 7 ) ：它进一步与栽培甜菜( v v ，2 n = 1 8 ) 回交，在其后代中筛选到一套完整的带有白花甜菜染色体的单体附加系 ( v v + 1 c ) ( 如图1 1 所示) 。其中发现高频传递的特异单体附加系m 1 4 ， 经过四代传递分析，平均传递率达9 7 以上，经过标记基因杂交、多年 传递率统计、细胞学、胚胎学及分子生物学鉴定，证实为蝶须型二倍体 孢子生殖的配子体无融合生殖材料。分析认为无融合生殖基因定位在附 加的白花甜菜第9 号染色体上。通过专家鉴定，认为带有白花甜菜第9 号 染色体的栽培甜菜单体附加系m 1 4 是克隆无融合生殖基因极其难得的 材料1 2 2 , 2 3 , 2 4 j 。 第章前言 栽培甜菜旱白花甜菜0 ( w + 1 2n = 1 9 ) ( c c c c 2 = 3 6 ) f ，v c 8 8 一l 旱 x 栽培甜菜e ( w c c 。2 = 3 6 ) ( w ，2n = 1 8 ) b j r 异镢三倍体甜菜 裁培甜菜 ( w c 2n = 2 7 ) +( w ，2 n = 1 8 ) 4 b 2 i ? ， 甜菜单体附加系一呻玛b 甜菜无融合生殖单体附加系 ( w + 1 c 2 n = z 9 )( w + 1 c ，2 w = 1 9 ) 图1 1甜菜无融合生殖单体附加系m 1 4 的获得 对于获得的m 1 4 单体附加系，本实验室已进行了大量的研究工作， 主要表现在以下几个方面。 首先，我们已构建了m 1 4 的可直接进行植物转化的b i b a c 文库， 这部分工作由中科院方晓华博士完成。该文库库容4 9 ，9 2 9 个克隆，平均 插入片段1 2 7k b ，覆盖m 1 4 基因组7 5 倍，在理论上具有大于9 9 的概 率克隆到m 1 4 基因组中任何单拷贝d n a 序列。为了绘制白花甜菜9 号 染色体物理图谱框架图，又以一组白花甜菜基因组特异性散在熏复序列 为探针进行m 1 4b 1 b a c 文库的筛选，获得了2 ，3 7 7 个克隆，覆盖白花甜 菜9 号染色体( 8 0m b ) 约3 4 倍。这些克隆经重新排列组成了白花甜菜 9 号染色体特异性b i b a c 文库( b c b a c 口) 。 其次，我们对m 1 4 的胚胎学进行了详细的研究，这部分工作由申家 恒教授完成。研究结果表明，m 1 4 开花的关键时期有三个，即减数分裂 时期、助细胞提前退化时期及次生核与卵细胞自行分裂时期，并且发现 m 1 4 虽然进入减数分裂阶段，但是没有进行完整的减数分裂，而实质是 进行了有丝分裂。这说明可能是由于m 1 4 中存在无融合生殖基因所导致 的，因此减数分裂时期可能是研究无融合生殖基因的关键时期。 黑龙江大学碗士学位论文 第三，我们在m 1 4 单株后代中分离获得了高频传递和低频传递的 m 1 4 单体附加系。由于m 1 4 行兼性无融合生殖，因此在其后代中肯定会 发生性状的分离，即产生部分二倍体及单体附加系，我们将传递率小于 5 0 的称为低频传递的单体附加系，即m 1 4 ( 低频) ；与之相对应的传递 率保持在9 6 以上的称为高频传递的单体附加系，即m 1 4 ( 高频) 。 此外，于冰在构建m 1 4 抑制消减文库方面进行了初步的尝试，并对 其中的一个消减文库进行了全部测序；郑天然在m 1 4 中确证f i e 基因的 存在并在构建m 1 4 花期的c d n a 文库方面做了尝试；王志伟构建了m 1 4 b i b a c 芯片的平台，并以m 1 4 花期总r n a 为探针杂交获得了白花甜菜 9 号染色体特异的2 个b i b a c ，目前我们实验室正在对2 个候选b i b a c 作进一步的研究。 1 2 抑制消减杂交概述 目前，研究差异表达基因的方法主要有两种：一是以杂交为基础而 建立起来的方法，二是以p c r 为基础而建立起来的方法。这两种方法都 包括许多的方法，但每种方法都有一定的局限性。以杂交为基础的方法 中，t e s t e r 中低丰度的e d n a 不易与d r i v e r 中e d n a 产生同源杂交，这 样不可避免地会产生假阳性及造成低丰度e d n a 的丢失；以p c r 为基础 的方法中，由于p c r 技术本身的缺陷，在扩增过程中会出现非特异扩增 的条带，这也会造成假阳性的问题。 随着分子生物学技术的不断发展，新的研究手段不断诞生，为差异 表达基因的研究提供了强有力的工具，其中以抑制消减杂交最为显著。 这种技术将杂交方法与p c r 技术有机地结合起来，克服了两种技术单行 使用所存在的缺点，极大地提高了差异表达片段的得率，并大大降低了 假阳性率。 第1 章前言 i i i i 南i i i i i 宣i i i i i i i i 置皇皇皇葺皇皇i i i i i 誓i i i ir 每i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 皇 1 2 1 抑制消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i m eh y b r i d i z a t i o n ， s s h ) 原理 抑制消减杂交是1 9 9 6 年由d i a t e h e n k o 等f 25 j 发现的一种分离差异表 达基因的新方法，它的主要步骤是先从待比较的两类细胞中( 检测方， t e s t e r ，t ：驱动方，d r i v e r ，d ) 提取p o l y ( a + ) m r n a 反转录为e d n a ， t e d n a 和d e d n a 经限制性内切酶进行酶切( 选识别四碱基位点，产生 平末端的限制性内切酶) 后，t e d n a 等分为两份，分别加上不同接头( 接 头1 ，接头2 ) ，两个接头都只有长链能与e d n a 分子的5 端共价结合。 s s h 包括两轮杂交。第一轮杂交中，过量的d 分别加入到连有不同接头 的t 样品中，热变性后退火、复性，每个杂交体系中会产生a ，b ，e ，d 四种类型的分子( 如图1 - 2 所示) 。对于t 和d 的共有序列( 非目的序列) ， 由于d 过量加入，体系中大多数的单链t 片段与单链d 片段复性形成异 源杂交分子c ，少部分非目的序列自我复性形成同源杂交分子b ，极少量 的以单链a 的形式存在于分子群体中，理论上可以忽略不计。对于t 中 特有的序列( 目的序列) ，则只能以两种形式存在：自我复性形成同源杂 交分子b ；以单链a 的形式存在于分予群体中。第一轮杂交前，不同的 目的e d n a 分子之间存在丰度差异。根据分子杂交二级动力学原理，高 丰度e d n a 分子复性形成双链分子的速度快于低丰度d n a 分子，且丰 度越高复性越快。因此经过第一轮杂交后，在单链a 分子群体中，不同 e d n a 的丰度趋于一致。同时，由于绝大多数非目的序列形成c 或b 型 分子，目的e d n a 分子得以富集，且不同目的e d n a 分子间丰度的差异 得到了均衡。第二轮杂交中，上述两份杂交样品混合的同时，加入新变 性的d e d n a ，此时，只有经差减和均衡的单链e d n a 才能退火、复性 形成一类新型的杂交分子e ，与b ，c 型分子比较，e 分子有一个重要特 黑龙江大学硕士学位论文 点，其57 末端有两个不同的接头，即接头l 和接头2 ，这是下一步p c r 选择性作用的基础。新变性的d c d n a 的加入使e 分子群体中目的序列 进一步得到富集。理论上，e 分子代表了丰度趋于一致的所有差异表达 基因。两轮扩增下来的c d n a 群体经末端补平后，用与接头外侧序列对 应的一对巢式引物进行扩增。a ，b ，c ，d ，e 血类分子在p c r 反应中具 有不同的表现：a 和d 型分子没有引物结合位点，得不到扩增；c 型分子 只在一端具有引物结合位点，故只能线性扩增；b 型分子两端具有接头， 在p c r 反应的变性和复性过程中，长的末端反向重复序列容易分子内自 我复性形成“锅柄”结构，阻抑了p c r 扩增，这便是抑制p c r 作用( 如 图1 3 所示) ；e 型分子两端具有不同接头，得到指数级扩增，使反应体 系中e 型分子得以富集。得到的这一p c r 扩增的e d n a 群体，荐用与接 头内侧序列互补的另一对巢式引物进行第二次p c r 扩增，以进一步降低 背景，富集差异表达e d n a 。经过第二次扩增的p c r 产物既可以直接用 于构建差减e d n a 文库，又能用作杂交探针对文库进行差示筛选，筛选 出来的克隆经n o r t h e r nb l o t 及反向n o r t h e r nb l o t 杂交验证后，可进行测 序分析 2 6 , 2 7 , 2 8 】。 第1 章前言 t e s t e r c o n a w i t h a d a m o r ld r i v e r c d n a l i ne x c e s s jt e s t e re d n a w i t h a d e p w r 2 f l 鼍= = = = 迅暇 a 【= 卜- - - 一 b i 刁= = = = ；= 一 d a b c ，d + d i f i l l i n t h e 日n d s 山 l a m d d - p ”r ，l m - e ，r r s c a 一- - b ，dd oa m p l i f i c a t i o n b - b +r i oa m p f l f i c b t i o n cl i n e a ra m p l i f i c a t i o n j 5 【= _ 栅口3 a n d 3 m r - q舡5 _ 图 - 2 抑制消减杂交原理示意图 9 一 三 黑龙江大学硕士学位论文 图1 - 3 抑制p e r 原理示意图 1 2 2 抑制消减杂交操作流程 图l _ 4 抑制消减杂交操作流程阁 ，1 0 - 第1 章前言 1 2 3 抑制消减杂交的优点和缺点 ( 1 ) 优点 具有高度灵敏性，均衡化作用使得分离与低丰度m r n a 对应的 c d n a 克隆成为可能【2 射。 程序相对简单，操作简便易行，仅需两轮杂交，不需要移出杂交 复合体，接头设计简化且不需反复交换接头，也不需要降解接头【3 0 1 。 降低了起始样品的使用量。 可以同时使上百个差异表达基因的片段得到分离d 。 s s h 采用的杂交体系成分简单，差减产物经稀释后可直接用于 p c r 扩增，避免了多轮杂交、反复过柱纯化的麻烦。 选用识别四碱基位点并产生平头末端的限制性内切酶使基因 ( 组) 的复杂程度降低，大大提高了信息量，更具有代表性。尽管进行 酶切给分离全长e d n a 带来麻烦，但是一旦得到任何一条表现真实差异 的e d n a 片段，有许多方法可以帮助我们方便地得到全长c d n a 克隆。 提高了特异性，降低了假阳性m 】。 ( 2 ) 缺点 尽管s s h 有上面所提到的各种优点，但个新技术在产生初期仍不 可避免地存在一些缺点和不足。 对起始材料量的要求不是很低，不适合应用于来源困难的样品。 样品必需保持新鲜，以防r n a 降解造成信息的丢失。 非酶切位点区域内的点突变，缺失或插入均不能有效地被发现。 得到的片段尚需结合其他方法才能得到其全长。 完全无酶切位点的片段或酶切位点较少的基因组无法用消减杂 交技术进行筛选。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 4 抑制消减杂交的应用 ( 1 ) 动物研究中的应用 在肿瘤基因克隆中的应用 5 0 以上的癌症中因p 5 3 基因的突变而导致p 5 3 蛋白的失活。通过 s s h 技术，在p 5 3 介导的凋亡细胞中证实了c f o s 可作为p 5 3 转录激活的 一个特异性靶位点，这为癌病变过程中p 5 3 与c f o s 这两个关键性的调节 蛋白之间的联系提供了直接证据【3 3 】。 在生殖与发育的基因调控中的应用 s i m p s o n 等t 3 4 1 干f j 用s s h 方法研究了马受孕1 2 天和1 5 天基因表达的 差异，在1 2 天至1 5 天期间，原肠胚已经形成，中胚层开始形成，经过 差异筛选分离出5 5 个e d n a 克隆，其中两种c d n a 被鉴定为钙调素和 磷酯酶a ，这两种e d n a 或许与胚胎发育过程中原肠胚的形成有关。 在免疫调控基因研究中的应用 李乐群等d 5 1 在国内首次报道应用s s h 方法克隆出差异表达基因，克 隆出两个淋巴组织中与束缚应激有关的e d n a 片段，经o e n b a n k 检索， 无全长同源序列，提示可能来自新基因。 在代谢调控机理研究中的应用 w a n g 等f 3 6 j 在寻找脑缺血耐受相关基因的过程中，用s s h 方法鉴定 了缺血处理后上调的基因，发现摹质金属蛋白酶抑制剂基因( t i m p ) 与 缺血处理后诱导的缺血耐受有关；继而在缺血脑中筛选出一种与人和鼠 动物单核细胞趋化蛋白3 同源的2 4 k b m c p 3 基因，该基因在脑缺血1 2 小时后，呈高度表达。m c p 3 m r n a 的诱导与缺血后白细胞的渗透和堆 积平行，这提示m c p 3 可能在驱使炎症细胞到炎症组织过程中起着某种 作用。 第1 章前言 在原核生物分子遗传分析中的应用 s s h 技术不仅可以用分析基因表达的变化，也可用于基因组的分析。 a k o p y a n t s 等【” 1 9 9 8 年首次将该方法进行改良并用于细菌基因组比较分 析，为病原体中未知的毒力基因( 致病岛) 筛选和微生物基因组差异、 分子进化的研究提供了重要技术手段。 a k o p y a n t s 等比较了猴幽门螺杆菌克隆株j 1 6 6 与标准对照株2 6 9 9 5 之间的基因组差异，筛选出只在j 1 6 6 株中高度表达的7 个特异性克隆， 进一步测序、杂交实验证实这些克隆表达产物与基因组d n a 限制性修饰 酶和代谢酶有关，而这些代谢酶和修饰酶可能造成d n a 的分子进化差 别。 ( 2 ) 植物研究中的应用 在植物领域，s s h 技术特别适合于研究发育阶段转型前后，个体内 不同器官之间，以及受环境影响较大的差异表达基因的克隆。一方面这 些待比较群体间存在丰富的差异表达基因，另一方面，一些低丰度的调 控因子参与其中，更能体现s s h 分离低丰度基因的优势f 3 8 1 。 郭新红等口9 1 利用s s h 技术构建了渗透胁迫诱导梭梭( h a l o x y l o n a m m o d e n d r o n ( c a m e y ) b g e ) 幼苗c d n a 文库以及对差异表达基因进 行了筛选和鉴定工作，以h o a g l a n d 溶液培养的梭梭幼苗( h ) 对照群体， 甘露醇处理的梭梭幼苗( m ) 为目标群体，进行抑制消减杂交。用经过 h c d n a 消减的m c d n a 构建一个含有大约4 0 0 个独立克隆的消减文 库，采用消减前的h e d n a 和m c d n a 以及正向反向消减后的c d n a 为 模板标记探针，对随机挑取的1 0 0 个重组质粒进行差示筛选，挑取8 个 进行n o r t h e r nb l o t 杂交分析，证实其中3 个候选克隆为m 中特异表达或 表达增强的基因。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 5 抑制消减杂交的应用前景 作为克隆基因的一种新技术，s s h 的优点是其他方法难以达到的， 既能从真核生物中筛选差异表达的基因，又能从原核生物基因组中筛选 出与致病有关或与分子进化有关的基因，可见其应用范围十分广泛，而 且随着基因芯片技术的成熟，使进行大规模差异筛选成为可能，目前已 有人将s s h 与m i c r o a r m y 结合用于差异基因的大规模快速筛选鉴定。 随着人类基因组计划和微生物全基因组测序的逐步完成以及高通量 测序技术的不断发展，通过s s h 技术筛选到的特异片段序列可与相应的 基因序列库中的e s t 进行同源比较或通过计算机分析查找到基因的全序 列，进而推测鉴定基因表达蛋白的功能，这为包括环境基因组、药物基 因组在内的功能基因组研究提供了新手段，进一步把基因克隆的研究推 向基因功能的研究1 4 0 。 1 3 表达序列标签( e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g ，e s t ) 1 3 1e s t 的概述 e s t 通常是长约1 5 0 5 0 0b p 的基因表达序列片段，1 个e s t 代表生 物体某种组织某时期的1 个表达基因。e s t 技术是1 9 9 1 年建立起来的 一种相对简便和快速鉴定大批表达基因的技术。它是将m r n a 反转录成 c d n a 并克隆到载体构建成c d n a 文库后，大规模随机挑选c d n a 克隆， 对其5 或3 端进行一步法测序，所获序列与基因数据库己知序列比较 从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列 生命过程认识的技术。 第1 熏前言 1 3 2e s t 的应用 1 3 2 1 利用e s t 标记绘制遗传图谱 遗传图谱、物理图谱和转录图谱是基因组计划要获得的三张遗传学 图谱。构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝短序列或低拷贝的序列标 记位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，s t s ) 作为界标，由于大多数基因是单拷 贝的，所以e s t 可以用来充当s t s 4 ”。同样e s t 片段由于其多态性高可 以作为分子标记，用来建立遗传连锁图谱f 4 3 】。如有人用同本的水稻品种 n i p p o n b a r e 和印度品种k a s a l a t h 杂交f 2 代1 8 6 个植株作遗传图谱，选用 了2 ，3 0 0 个d n a 标记，1 2 个连锁群，总的遗传距离为1 , 5 5 0c m ，其中 7 0 的标记来源于e s t i 州。转录图为染色体d n a 的某一区段内，所有可 转录序列的分布图，e s t 为转录基因的产物，可直接用来构建该图，它 可以与基因组文库序列比较，提供内含子结构、可选择的剪切方式、转 录起始与终止位点等信息。 1 3 2 2 分离和鉴定新基因 分离基因的经典方法为图位克隆和转座子标签克隆，是利用分子标 记或表型变化来分析鉴定基因。以e s t 为重要来源的染色体物理图谱进 一步方便了对候选基因的连锁分析，它可以将基因确定在更狭小的染色 体区段内，缩小了基因的筛选范围。用e s t 取代对c d n a 全长的筛选、 基因组序列的鉴定等繁琐的实验操作，可大大提高分离基因的效率。将 获得e s t 用生物信息学方法与各公共数据库中已知序列进行比较，可迅 速而准确地确定基因功能。由于在构建c d n a 文库时要尽可能地选用全 长e d n a 所以一旦发现有价值e s t ，可以找到对应的克隆，获得的全 长e d n a 可以直接用于如转基因等的研究。利用e s t 方法进行发现、分 离基因的研究，不仅是人类基因组研究的热点，而且是植物基因组研究 黑龙江大学硕士学位论文 的重要内容1 4 ”。 1 3 2 3 基因差异表达的研究 一般认为某时期的基因表达数量通常占全部基因的1 5 ，细胞的 分化由基因特异性的时空表达决定。近年来，对基因差异表达研究发展 了如差减杂交、m r n a 差异显示等新技术，这些技术各有优势，而e s t 技术的优势在于其稳定性高和分析规模大。对c d n a 文库随机挑选克隆 进行大规模测序，可直接回答特定组织细胞在某一时期哪些基因表达了， 丰度如何等问题，从而能在基因整体水平研究相关的功能及代谢。目前 基因差异表达研究是植物e s t 研究的主流，基因表达谱的研究更是其中 的热点，如水稻胚乳发育中的基因表达蚓、拟南芥防御系统基因表达【4 7 i 、 油菜保卫细胞的代谢研究h 叭、杨树和松树木质行程中的基因表达t 4 9 , 5 0 峙 等，涉及的植物种类多，研究内容广泛。 1 3 2 4 比较基因组学研究 植物比较基因组学研究是从比较不同植物的遗传图谱开始的，如禾 本科遗传作图的共线性研究。利用e s t 中古老保守序列( a n c i e n t c o n s e r v e dr e g i o n ，a c r ) 来研究物种之间的进化关系，可以避免选择家 系、构建群体、大量的统计分析等周期长而繁琐的遗传图谱制作过程， 并且使结果更加准确。如对拟南芥的研究表明，约2 3 以上的e s t 中有 a c r 序列，据此可以判定进化关系5 1 i 。此外利用基因组较小的模式生物 所获已知功能的基因，与复杂基因组生物如人、作物的e s t 比较，从而 推测待测e s t 的功能，亦为比较基因组学研究的重要内容。 1 ，3 2 5 用于制备d n a 芯片 d n a 芯片技术是近年来发展起来的研究功能基因组学的方法，e s t 是用于制备d n a 芯片很好的基因资源1 5 2 1 ，而芯片技术同样也是目前高 通量筛选e s t 的有效方法。随着更多基因组计划的开展和更多已知功能 第1 章前言 基因的累积，将来无需测序只通过d n a 芯片技术就可研究基冈功能。 e s t 计划的实施，不仅获得了关于表达基因的信息资源，同时也获得了 大量已鉴定了的c d n a 克隆资源，而这些资源就是功能基因组学研究不 可缺少的。 1 4 本实验拟采取的技术路线 本实验以具有无融合生殖特性的m 1 4 单体附加系和二倍体栽培甜菜 为材料进行抑制消减杂交，建立了甜菜开花三个关键时期的消减e d n a 文库，并进行了反向n o r t h e r nb l o t 杂交筛选，获得了一定数量的可能与 m 1 4 发育阶段相关的e s t 。 技术路线图如图1 5 所示。 黑龙江大学硕士学位论文 d r i v e r ( 二倍体栽培甜菜) t e s t e r ( m 1 4 单体附加系) d r i v e r ( 二倍体栽培甜菜) 图1 - 5 本实验采取的技术路线图 1 8 第2 章材料与方法 第2 章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 甜菜单体附加系m 1 4 品系( c h r o m o s o m e9m o n o s o m i ca d d i t i o nl i n eo f 丑c o r o l l i f l o r az o s si nbv u l g a r i sl ，v v + c 9 ，2 n = 1 8 + 1 ) 与普通栽培甜 菜( 日v u l g a r i sl ，v v ， 2 n = 1 8 ) 于2 0 0 4 年6 7 月间取自黑龙江大学 分子生物学实验室植物园。 本实验依据申家恒教授的胚胎学研究结果，在花期对m 1 4 单体附加 系及栽培甜菜的花器进行取材。由于不同时期花蕾的大小不同，因此将 三个取材时期转化为花穗中不同花蕾大小的三段，具体如表2 - 1 所示。 实验中共进行了四组抑制消减杂交实验，具体实验组合如表2 - 2 所示。 其中只对减数分裂时期正向抑制消减杂交的产物进行了转化和筛选工 作。 表2 1 取材时期与花蕾直径及花穗部位对应表 取材时期花蕾直径( r a m )花穗相应部位 黑龙江大学硕士学位论文 表2 - 2 抑制消减杂交实验组合 2 1 2 实验菌株与克隆载体 p g e m t e a s y v e c t o rs y s t e m s 购自p r o m e g a 公司( 质粒图谱见附录) 。 菌株为e c o i lj m l 0 9 ，购自t a k a r a 公司。 2 1 3 引物与接头 e d n a 合成引物： 5 - t t tt g ta c aa g ct t ，。n ：n 3 p c r 引物： 5 - c t aa t ac g ac t ca c ta mg g g