（生物化学与分子生物学专业论文）冬虫夏草液体发酵富集硒、锌、锗研究.pdf

摘要 利用冬虫夏草对微量元素具有较强富集功能的特性，采用液体培养 的方式对硒、锌、锗进行了富集与转化研究，获得了富硒、锌、锗等微 量元素的菌丝体，为补充微量元素产品的开发奠定了理论基础。 通过正交试验、单因素实验等方法确定了冬虫夏草最佳摇瓶培养基 为：马铃薯2 0 ，葡萄糖2 ，酵母粉o 4 ，k h 2 p 0 4o 2 m g s 0 4 o 1 5 ，接种量5 ，最适p h 值为6 5 ，最适温度为2 5 c ，最佳转速为 1 2 0 r r a i n 。；单元素富集和三元素富集实验对硒、锌、锗的富集特性进行 了研究，结果表明适宜浓度的微量元素能够明显促进菌丝体的生长和氨 基酸的合成，但会影响腺苷和多糖的合成，三种元素的富集亦存在一定 的相互关系；对富硒、锌、锗虫草菌丝体多糖进行了初步分离纯化及性 质研究，证明虫草多糖至少含有三种组分，由葡萄糖、半乳糖和甘露糖 组成。 f 结果表明，冬虫夏草能够有效实现对硒、锌、锗的同时富集与转化， 并且适宜浓度的硒、锌、锗能够明显促进冬虫夏草菌丝体的生长。上 + 。一 关键词l 冬虫夏草、生物富集硒 锌，锗 a b s t r a c t c o r d y c e p ss i n e n s i ss u b m e r g e df e r m e n t a t i o nf o rb i o a c c u m u l a t i o no f s e z na n dg ew a ss t u d i e di n t h i s p a d e ra c c o r d i n g t oi t s s u p e ra b i l i t y o f b i o a c e u m u l a t i o no f t r a c ee l e m e n t s ，a n dt h em y c e l i ae n r i c h e dw i t hs e z na n d g ew e r eo b t a i n e d i nt h i s p a p e r , t h eo p t i m a lf e r m e n t i n g c o n d i t i o n sw e r ew o r k e do u t t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s ta n ds i n g l ef a c t o rt e s t t h er e s u l to fo p t i m i z a t i o ni s ： p o t a t o2 0 ，g l u c o s e2 ，y e a s te x t r a c t0 4 ，k h e p 0 4o 2 ，m g s 0 40 1 5 ， i n o c u l a t i o n5 p h 6 5 1 2 0 r m i n ，2 5 t h ec h a r a c t e r sa b o u tt h eb i o a c c u m u l a t i o no fz n s ea r , dg ch c - i n v e s t i g m e db ys i n g l ee l e m e u ta n dt r i p l ee l e m e n t sb i o a c c u l n u l a t i o n t h e nt h e f u n c t i o n a l i n g r e d i e n t si nt h em y c e l i ae n r i c h e dw i t hz n ，s ea n dg ew e r e a n a l y z e d t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc o r d y c e p sp o l y s a c c h r i d eg a v e u s i t sp r i m a r yp h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t o r s t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tc o r d y c e p ss m e n s sc a na c c u m u l a t es e z na n d g e s i m u l t a n e o u s l y a n d e f f i c i e n t l y , a n d t h e s ee l e m e n t sw i t h o p t i m a l c o n c e n t r a t i o nc a l lh i g h l ya c c e l e r a t et h em y c e l i a lg r o w t h k e y w o r d s ： c o r d y c e p s s i n e n s i sb i o a c c u m u l a t i o n z i n cs e l e n i u m g e r m a n i u m 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 ， 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：必 导师签 日 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 人体补充微量元素的重要性 微量元素对维持人体正常生理功能，预防和治疗某些疾病具有非常 重要的作用。 1 1 1 硒( s e ) 元素 硒是人体必需的微量元素，它通过谷胱甘肽过氧化物酶、辅酶q 和 维生素e 维持自由基的正常代谢以维持人体正常生理机能”。早在上个 世纪3 0 年代，第一次发现了硒化物的生物化学特性对牛及其它家畜 有剧烈的毒性，影响机体中枢神经系统，引起胎儿中毒和胎儿畸形，直 到科学家发现机体缺硒会导致大鼠肝坏死和家畜肌营养不良症之后，人 们对硒的研究才从早期的毒性研究转变为营养性研究【2 1 。 谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 由s e c y s 构成，该酶催化氢过氧 化物和脂质过氧化物转变为水和各种醇类，降低丙二醛( m d a ) ，清除 自由基对生物膜的攻击，保护膜免受氧化损伤【3 】。研究发现，硒为甲状 腺的代谢所必需，碘化甲状腺氨酸脱碘酶是一种硒蛋白，能将甲状腺素 ( t 4 ) 转化为其活性形式三碘甲腺原氨酸( t 3 ) 。最近研究者又发现 了另一种硒蛋白酶硫氧化蛋白酶，该酶在机体内广泛存在，参与调 控二硫基的氧化还原，同时参与多种蛋白质的表达1 4 1 。硒还具有其它多 种功能，如能提高动物繁殖功能；抑制巯基蛋白氧化导致高分子物质聚 合：防止晶状体浑浊而形成白内障，降低镉、铅、汞等重金属的毒性： 硒还具有一定的抗艾滋病的功效，对a i d s 病人具有明显的延长生命作 用。 据2 7 个国家对硒与乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌和 白血病的资料研究显示：癌症的发病率和死亡率与饮食硒或血硒水平呈 反比。我国科学工作者对全国2 0 个省市自治区的2 0 0 个克山病区和非病 区的近万份水、土壤、粮食、蔬菜、毛发及血液样品作微量元素分析， 结果表明硒缺乏是克山病发病的原因之一，并且在用亚硒酸钠预防克山 病方面获得很大成功。硒缺乏与心血管病、大骨节病也有关。正常人体 ( 体重7 0 k g ) 应维持含硒量1 4 - - 2 l i n g 。而人体日排硒量约0 1 5 m g ，因此 需要补充，否则易感染疾病。1 9 7 6 年国际上推荐硒a d i ( 每日允许摄入 于克学：冬虫夏草液体发酵密集s e 、z n 、g e 研究 量) 为6 0 9 9 ，我国推荐为4 0 9 9 ，考虑到体内某些元素的拮抗作用和病区 低硒适应性，建议成人供给量标准暂定为4 0 2 4 0 1 t g d i5 1 。1 9 8 8 年1 0 月中 国营养学会规定硒的r a d ( 推荐剂量) 为5 0 1 t g 。我国膳食结构以谷物蔬 菜为主，成人硒的日摄取量仅为2 6 6 1 t g ( 成人臼需量约为2 0 0 2 5 0 1 a g ) ， 属于低硒水平。人体主要依赖食物来获得硒，而生物源的有机硒与无机 硒相比具有吸收率高、安全无毒等优点。因此，开发生物源有机硒食品 或食品添加剂是给机体提供硒源的有效途径1 6 】。 1 1 2 锌( z n ) 元素 锌是人体必需的微量元素，它是人体中许多重要酶的组成部分，与 锌有关的酶大约有7 0 , - - 1 0 0 种。许多研究表明，锌是r n a 聚合酶和d n a 聚合酶呈现活性所必需的，锌能协助葡萄糖在细胞膜上转运，锌能够促 进人体的生长发育和增强人体的免疫机能1 7 j 。缺锌会导致儿童生长发育 受阻，性成熟延迟、味觉障碍和伤口愈合缓慢等疾病，孕妇缺锌甚至会 导致胎儿畸形【。在我国的饮食结构中膳食纤维摄入过多是导致锌缺乏 的一个重要原因。据调查在我国儿童中锌摄入量不足1 2 r a d 的男女比 例分别是3 i 3 和3 2 6 ，儿童缺锌应当是一个引起重视的问题【3 】。中国 预防医学科学院对北京等1 9 个省市学龄儿童头发中含锌量的分析表明， 大约有6 0 的儿童低于正常值，缺锌状况相当严重1 7 】。1 9 8 8 年中国营养 学会推荐成年人每日锌摄入量为1 5 r a g ，健康人维持正常的锌代谢平衡非 肠道日锌需求量的估计值，婴幼儿( 5 岁) 为o 1 m g k g 体重，之后每 天至少应补充2 5 , 4 0 r a g 。考虑到食物中锌的生物利用率，实际的摄入量 远高于该值。 1 1 3 锗( g o ) 元素 锗是由德国化学家w i n k e r 在1 8 8 6 年首次从硫银矿中分离出来，土 壤中平均含0 2 m e d g 。1 9 1 3 年c o m e e 从植物中测出了锗，1 9 2 9 年d u l o i l 发现动物体内也含有锗( 9 1 。锗是一种具有高度生物活性的微量元素，尽 管迄今为止尚不能确定锗是人体必需的微量元素，也未发现有锗缺乏症 的报道，但由于若干中药的医疗保健作用曾被认为与有机锗有关，所以 近二十多年来人们对有机锗的合成、生物活性及其应用进行了探讨。1 9 6 8 年日本学者浅井一彦首次合成了具有广泛药理活性的有机锗化合物p - 羧 山东农业大学硕士学位论文 乙基锗倍半氧化物( g e 1 3 2 ) ，1 9 7 4 年r i c e l m 和w h e e l e r j w 合成了有 机锗螺锗，并发现它具有抗癌活性。大量的实验表明锗具有抗肿瘤、 消炎与免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血脂等多重功能，是一 种具有良好营养保健作用的微量元素【1 0 】。我国科学工作者经过大量动物 实验研究证明，g e 一1 3 2 的最大无副作用剂量为2 0 m g k g ，据此推定用与 成年人的允许摄入量为2 4m g d 。 1 2 微量元素与代谢 1 2 i 硒 硒的主要来源是食物，经口摄入后大部分在十二指肠被吸收，吸收 后的硒与血浆蛋白结合，分布到全身各组织，其中以肝、肾浓度最高【l l 】。 有机形态的硒主要以硒代氨基酸( s e l e n o - a r a i n oa c i d ) 和硒蛋白 ( s e l e n o p r o t e i n ) 形式存在。硒蛋白家族是硒在体内运转、贮存以及发挥 其抗氧化作用的主要形式，已经发现的硒蛋白有3 0 余种，其中l o 多种 已经被定性，只有少数几种硒蛋白的功效被阐明。目前研究比较透彻的 是硒代蛋氨酸( s e m e t ) 和硒代半胱氨酸( s e c y s ) 。普遍认为，谷物、 大豆和硒酵母中的硒主要以硒代蛋氨酸形式存在，而动物组织中的硒主 要以硒代半胱氨酸存在，约占总量的5 0 以上【1 2 】。硒以硒代半胱氨酸形 式，以u g a 为密码子，共翻译( c o t r a n s l a t i o n ) 入硒蛋白。由于原核生 物中u g a 是终止密码子，因而，u g a 要翻译成s e c y s 就必然需要特殊 的机制，即含有与u g a 配对的t r n a 反义密码子以及生成硒代半胱氨酰 - t r n a 的酶，以识别m r n a 上编码s e c y s 的u g a 和作为终止子的u g a 。 在原核细胞中，四种基因产物s e l a ( s e l e n o c y s t e i n es y n t h a s e ) 、s e l b ( s e c y s 特异转录因子) 、s e l c ( 硒代半胱氨酰- t r n a ) 以及s e l d ( s e l e n o p h o s p t m t es y n t h e t a s e ) 参与了s e - c y s 合成入硒蛋白的过程。首 先是s e l c 在丝氨酰- t r n a 合成酶的作用下合成丝氨酰m 斟a s “： t r 腿“( s e l c ) + s e r i n e s e r r y l - t r n a s “ 第二步丝氨酰i n a s “由s e l a 催化为s e 半胱氨酰- t r n a s “： s e r r y l - t r n a s ”+ s e l a s e l e n o c y s t e y l t r n a “ 在这个反应中，活性硒的供体是硒代磷酸盐，它由s e l d 催化合成。 最后一步为$ e l e n o c y s t e y l t r n a s e 。与转录因子s e l b 结合，s e l b 同时与 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s 厶z n 、g 。研究 m r n a 上的茎- 环结构相结合。真核细胞硒蛋白的合成机制要比原核细胞 复杂的多，除了t r n a “。外，对真核细胞的s e c y s 掺入机制中的其它因 素知之甚少，其合成机制不完全清楚，这领域有待于大量的研究工作。 1 2 2 锌 正常人体内含锌2 9 左右，含量仅次于铁而高于铜，通常锌主要靠十 二指肠吸收，吸收率为1 0 - - 4 0 ，血液吸收5 1 0 。组织中的锌含量以 眼脉络膜和精子中最高，其次为前列腺、指甲、骨骼，含量大于l o o i j t g g ， 肝、。肾、肌肉、皮肤等锌含量为5 0 “# g ，全血中锌含量为5 - 9 牡g m l ，其 中血浆中的锌占1 2 ，红细胞中的锌占8 5 ，白细胞中的锌占3 。血 浆中的锌分为两部分，一部分占3 4 ，与蛋白质( 主要是毗巨球蛋白) 牢固地结合，另一部分占6 6 ，与蛋白质( 主要是清蛋白) 稀疏地结合。 一般认为，清蛋白及n 球蛋白主要起着载体蛋白的作用。红细胞中锌主 要结合在碳酸酐酶中，自细胞中的锌主要结合在碱性磷酸酯酶中。 锌几乎都以结合于细胞蛋白的z n 2 + 形式存在。锌对电子的亲和力很 强，可与几种氨基酸侧链相互作用，特别是与半胱氨酸和组氨酸的硫原 子与氮原子的相互作用，这些作用可使锌与多肽内或多肽之间交联修饰 三级蛋白结构及功能。锌的这种能力非常适合于在细胞代谢中起中心作 用。 在生物体内，锌参与多种代谢过程，包括糖类、脂类、蛋白质和核 酸的降解与合成，这些多与含锌酶的广泛存在有关。锌与代谢的关系非 常密切，缺锌时常出现耐糖功能降低，胰岛素释放迟缓；脱氧胸苷参与 d n a 的作用降低，生长延迟：含硫氨基酸代谢异常，尿中硫排泄量增加， 羟脯氨酸排泄量增加；缺锌初期空腹时，血中游离脂肪酸增加，锌能促 进葡萄糖进入脂肪组织中，有利于脂肪的储存。 1 2 3 锗 锗广泛地分布于食物之中，成年人锗的摄入量为4 0 0 - 3 5 0 0 m g d 。主 要以饮水、食物或药物等形式进入人体，被盐酸或酶溶解消化吸收后， 经血液输送到全身各组织器官中发挥生物学功能，最后经汗腺、肾脏， 以汗液、尿液方式排出体外，还有一部分锗直接从消化道排出体外。 锗广泛分布在人体各器官中，其含量分别为( m g g 湿重) ：血0 2 、 山东农业大学硕士学位论文 头发2 2 、肾9 0 、肝0 0 4 、肌肉0 0 3 ，指甲0 4 s 1 i ( 干重) 、血浆 a d c e f ，其中，摇瓶发酵优化培养基配方为a 2 a 2 c l d 2 e 3 f 3 ，即：马铃 薯2 0 ，葡萄糖2 ，酵母粉0 4 ，k h 2 p 0 4o 2 ， m g s 0 4 o 15 ， 接种量5 。以该培养基在同样条件下进行验证实验，菌丝体生物量达到 1 2 6 0 e d l 0 0 m l ，证明了正交实验结果是正确的，确定为以后的摇瓶发酵 培养基。 3 2 摇瓶发酵条件实验 对最适p h 值、温度、转速等三因素各取三个水平，每个水平设三个 重复，进行了单因素实验，结果见表4 。 表4 发酵条件实验 t a b 4t h ec o n d i t i o n so f f e r m e n t a t i o n p h 生物量( s i ( ) 0 m l )温度( ) 生物量( s j o o m l )转速( r m j n ) 生物量( g ，1 0 嘶 5 50 9 8 72 01 0 5 01 0 01 1 0 4 6 51 2 4 82 51 1 9 51 2 01 2 7 9 7 50 7 8 22 80 8 0 31 6 01 0 7 6 1 7 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 由表4 以看出，其最佳p h 值为6 5 ，最适温度为2 5 c ，最佳转速为 1 2 0 r r a i n 。 3 3 单元素富集实验 3 3 1 富硒实验 将液体菌种接入装有5 0 m l 优化培养基的三角瓶中，接种量为5 ， 再加入终浓度分别为2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 、3 0 0 、5 0 0 、7 0 0 p g m l 的n a 2 s e 0 3 母液，不加n a 2 s e 0 3 为对照，2 5 、1 2 0 r m i n 振荡培养9 6 h 得菌丝体。 3 3 1 1 菌丝体生物量变化。 1 6 二1 4 善任 量1 蛰o 8 望0 6 藩o a o , 2 o o2 04 06 08 01 0 03 0 05 0 0 7 0 0 培养基硒含量( 1 a g m l ) 圈2 富硒菌丝生物量及硒含量 f i g 2b i o m a s sa n d8 e c o n o o n m l i o n o f s e e n r i c h e dm y t * l i a 裟0 0 0 0 冀急 2 50 0 墼吾 2 0 0 0 0 刈。 1 5 0 0 0 糨 + 菌丝体生物量 + 菌丝体含硒量 由图2 可以看出，n a z s e 0 3 浓度在0 8 0 1 a g m l 范围内时，对菌丝体 生物量的影响不明显，且低浓度的硒对菌丝体的生长有促进作用，在 6 0 p , g m l 时达到了最大值1 5 1 4 9 _ j f l 0 0 m l ：当n a 2 s e 0 3 浓度超过8 0 p g m l ， 菌丝体生物量急剧下降，并且，随着浓度的逐步升高，有进一步降低的 趋势，因此冬虫夏草液体发酵的适宜硒浓度不高于8 g m l 。 3 3 1 2 菌丝体硒含量的变化 用电感耦合等离子体发射光谱仪对菌丝体中硒含量进行测定，结果 山东农业大学硕士学位论文 如图2 所示。对照组菌丝体硒含量为6 3 4 7 p g g ( 干重) ，当培养基硒含 量为1 0 0 p g m l 时，菌丝体硒含量达到了6 4 3 6 9 p g g ，可以看出，当培养 液中硒含量低于8 0 i t g m l 时，菌丝体中硒含量与培养基中的硒浓度具有 较好的线性关系；而当培养液中的硒浓度高于5 0 0 p g m l 时，菌丝体中 硒含量变化趋于缓和，而此时的菌丝体生物量也很低，说明已经接近其 致死浓度了。 9 0 8 0 7 0 6 0 耜 3 0 2 0 1 0 o 02 0 04 0 06 0 0 培养基硒浓度( 1 tg m l ) 图3 言硒率及有机化程度 f 酥3r a t eo f s ca c c u m u l a t i o na n d i t so r g a n i cd e g r e e 3 3 1 3 富硒率的变化 由图3 可以看出，当培养基中硒浓度低于3 0 0 肛g m l 时，富硒率多 在4 0 5 0 之间，培养基硒浓度为1 0 0 9 9 m l 时，富硒率最大为5 0 8 5 ， 当培养基中硒浓度大于3 0 0 恤g m l 时，富硒率急剧下降。 3 3 1 4 硒有机化程度分析 有机化程度分析结果如图3 所示。由图3 可以看出，当培养基硒含 量为8 0 i _ t g m l 时，有机化程度达到7 1 3 以上，随着培养基中硒浓度的 逐渐降低，菌丝体中硒的有机化程度在逐渐升高，反之则降低，这是由 其富集机理决定的。冬虫夏草富集微量元素的过程主要经历了一快一慢 两个步骤：第一步，生物吸附过程，培养基中的离子通过络合或者是离 1 9 子交换等形式与菌丝体细胞表面的化学基团结合，这一过程快速且不需 要能量，与代谢无关，主要受离子种类与浓度、p h 、富集时间、竞争离 子等因素的影响；第二步，主动运输过程，离子透过细胞膜进入细胞内 部，形成真正的有机态微量元素，这一过程缓慢且需要能量，与代谢过 程有关，主要受代谢强度的影响。 3 , 3 1 5 菌丝体中各组分硒含量 由表5 可以看出，菌丝体中有6 2 8 的有机硒与蛋白结合，说明蛋 白质是硒的主要结合对象。另外，有少部分硒是与多糖结合的，有关多 糖硒的报道不多，其结构性质及生物学功能有待进步研究。 表5 培养基硒浓度为6 0 p g m l 时各组分硒含量 ：! ! ! ：! ! ! 垫! 堕! ! ! ! 唑! ! ! 璧堂! ! ! ! 婴! 些苎! ! 凸丝 蛋白硒多糖硒核酸硒其他硒 3 3 1 6 富硒菌丝体氨基酸分析 表6 富硒菌丝体中氨基酸含量分析( m g l o o m g ) t a b 6a m i n oa c i dc o n c e n t r a t i o ni ns e - c n r i c h e d m y c e l i a a a 接差基殖邃鏖( 4 出吐2 对照2 04 06 08 01 0 0 2 0 |懈瑚憎猫抛瑚川嘲至!m懈室|嗡m始!圣埘蚴珊m帆旧嘣嘣 忡l兰泔m蛳恤挪伽 山东农业大学硕士学位论文 总和1 3 1 81 9 1 52 3 2 5 1 6 6 02 3 4 62 3 9 2 对虫草菌粉氨基酸含量的分析结果见表6 。从表中可以看出，添加 n a 2 s e 0 3 后，菌丝体中氨基酸含量除胱氨酸外均比对照有明显增加，说 明适宜浓度的微量元素硒能刺激虫草中氨基酸的合成。 3 3 2 富锌实验 3 3 2 1 菌丝体生物量及锌含量 分别添加终浓度为3 0 、5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 、3 0 0 1 t g m l 的无菌z n s 0 4 母液于灭菌的培养基中，在拟定条件下进行摇瓶发酵得菌丝体，结果如 图4 。 当培养基锌浓度为1 0 0 1 - l g m l 时，菌丝体生物量达到最大值，为 1 1 7 8 4 9 l o o m l ；当锌浓度为1 5 0 p g m l 时，菌丝体生物量为 1 0 6 6 9 1 0 0 m l ；当培养基浓度超过1 5 0 蚓m l 时，菌丝体生物量明显下降。 因此我们确定冬虫夏草的最佳富锌浓度为1 5 0 p g m l 。菌丝体中锌含量对 照组为8 7 o l p g ，g ，当菌丝体生物量达到最大时，菌丝体中锌含量为 3 2 2 2 0 似掣譬。当锌浓度为1 5 0 蚂m l 时，即达到最佳富锌浓度时，菌丝体 中锌含量为4 8 7 5 1 i _ t g g 。 2 i 嗡帆嘶嘘竺m 魄哪峨 一 加兜m村斟踮引烈 一 所 咖咙i耋量耋蚴哪 一 蝴 邡耶筋m弘卯舶 一 咖!三!至兰|!耋呦兰| 一 m州舵躬若；弘舵肿 一 胂 吣m蚴m蜥耋； 一 硒加舛弛蕊嬲 一 傩 呦!耋蝴泐薹|嗌!耋 一 嘣恤k恤职甚!帆耋她脚 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 03 05 01 0 01 5 02 0 0 培养基锌含量( u 9 m l ) 删 啦 缸 戴i 坦 3 0 0 一菌丝体生物量 卜菌丝体古锌量 图4 富锌菌丝生物量及含锌量 f i g 4 b i o r m s sa n dz nc o n c e n t r a t i o no f z n - e n t r i c h e dm c e l i a 3 3 2 2 富锌率及有机化程度分析 毋 v 丑 求 i 01 0 02 0 0 3 0 04 0 0 培养基锌浓度( ug f n l ) 图5 富锌率及有机化程度曲线 f i g 5r a t eo f z n a c c u m u l a t i o na n do r g a n i cd e g r e e 由图5 可以看出，当培养基中锌浓度为3 0 p g m l 时，富锌率最高达 o o o o 御伽佃啪湖枷瑚o 4 2 1 8 6 4 2 0 一争毛一铲蜘照o 伯们m 0 山东农业大学硕士学位论文 到了7 0 8 7 ，有机化程度达到了9 1 8 5 ；当锌浓度为1 0 0 p , g m l 时，富 锌率为3 6 9 4 ，有机化程度为8 1 5 4 ；当培养基浓度为1 5 0 1 t g m l 时富 锌率为3 4 ，0 5 ，有机化程度达到了7 6 3 3 。通过比较可以看出。锌的有 机化程度要比同浓度时硒的有机化程度高，说明冬虫夏草同化无机锌的 能力更强。 3 3 3 富锗实验 3 3 3 1 菌丝体生物量及锗含量 3 e o 矗 一 嘲 霉 州 蛙 裁1 翘 1 4 05 01 0 02 0 0 5 0 08 0 01 0 0 0 酋丝体生蚴量 培养基锗含量( 弘g m l )+ 菌丝体含锗量 圈6 菌丝体生物量及锗含量 f i g 6b i o m a s sa n d c o n c e n t r a t i o n o f c t - c n d c h e dm y c e l i a 由图6 可以看出，当培养基锗浓度在5 0 一- 1 0 0 0 p g m l 之间时，锗对 菌丝体的生长影响不大，低浓度时也有促进菌丝生长的作用；在对照中， 锗的含量( 2 3 2 5 1 a g ，g 千重) 要比锌( 8 7 o l p 8 g 千重) 和硒( 6 3 4 7 p g g 干重) 高得多，这与培养基中锗含量比较高有关系，当培养基锗含量为 5 0 0 1 x e , m l 时，菌丝体锗含量达到了最大值1 4 0 2 9 1 x g g 。因此，富集时培 养基中锗含量可在5 0 - - 1 0 0 0 p g m l 之间根据需要确定。 3 3 3 2 富锗率与有机化程度分析 从图7 可以看出，当培养基中锗浓度为1 0 0 i _ t g m l 时，冬虫夏草 的富锗率达到了最大值5 7 1 ，与富硒、富锌相比，显然要低得多。由 恻巾强j v 嘲烬扣葚剁担 o o o 0 例懈例例湖哪伽瑚o 2 1 8 6 4 2 o 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 此可见，在实验的浓度范围之内，冬虫夏草富锗能力要比富锌、富硒能 力低。而其有机化程度较高。 6 5 4 i 3 嚣2 1 0 5 01 0 0 2 0 05 0 08 0 01 0 0 0 培养基锗浓度( ug m l ) 图7 富锗率曲线 f i g 8 r a t eo fg ea c c u m u l a t i o n 5 01 0 0 2 0 05 0 08 0 01 0 0 0 培养基锗浓度( pg m l ) 圈8 锗有机化程度曲线 f i g 8o r g a n i cd e g r e e o fg ei ng e - e n n c h e d m y c e l i a 蚰 0 (一毯否l葚霉蜒晏拿 山东农业大学硕士学位论文 3 4 三元素同时富集实验 3 4 1 最佳浓度配比的确定 考虑到虫草菌同时富集三种元素的情况可能会比较复杂，因此在以 上单元素富集的基础上，我们对每种元素的添加浓度进行了初步设定， 利用正交试验能够使各点分布较均匀的特点，进行正交试验，以确定最 佳浓度配比。 表7 三元素浓度水平设计 t a b ，7l e v e ld e s i g n so f s e , z na n dg o 以l 1 6 ( 4 3 ) 正交表进行设计，2 5 c 、1 2 0 r m i n 振荡培养9 6 h 得菌丝 体，其生物量结果如表8 。 表8 三元素富集实验菌丝体生物量 实验号生物量( 8 1 0 0 m l ：实验号生物量( g 1 0 0 m 11 7 4 89 1 5 3 0 21 - 7 1 4 1 01 4 1 8 31 3 8 0 1 l1 7 8 0 41 2 8 1 1 21 5 2 5 51 6 9 91 3 1 4 3 0 61 6 7 5 1 41 4 1 8 71 5 8 8 1 51 4 9 4 81 2 8 0 1 61 7 4 1 结果表明，合适的三元素比例能够显著增加虫草的菌丝体生物量， 在本实验中菌丝体生物量最大达到了1 7 8 0g 1 0 0 m t ( s e ：2 0 9 9 m l ；z n ： 1 0 0 p g m l ：g e ：2 0 0 p _ g m l ) ，比对照提高了3 8 8 5 。 对三种元素影响菌丝生物量的程度进行了方差分析，如表9 所示。 方差分析结果表明，在选定的浓度范围内，只有s e 浓度变化对菌丝体生 物量影响显著，z n 和g e 均不显著。三元素影响的显著性顺序为 s e g e z n ，同时可以看出，若依菌丝体生物量为指标，最佳浓度组合为 s e ：2 0 i _ t g m l ，z n ：1 0 0 9 9 m l ，g e ：5 0 1 t g m l 。 表9 三元素富集方差分析 里! ：! 垒! ! ! 墅塑! 金型! 竺! ! ! ! ! ：垒竺! 鱼! 竺! ! 里! ! 篓! ! ! 方差来源偏差平方和自由度平均偏差平方和f 值显著性 注：f 0 2 5 ( 3 ，6 卜1 7 8 ；f o1 0 ( 3 ，6 产3 2 9 ；f 0 0 5 ( 3 ，6 = 4 7 6 ；f o o l ( 3 ，6 户9 7 8 ：极显著：显著( + ) ：较显著 表1 0 虫草菌丝体元素含量分析 元素含量( i t g g 干重)元素含量( p g g 干重) 实验号z ns eg e实验号 z ns eg e l1 5 7 5 38 2 1 96 1 8 792 7 4 2 72 0 7 2 82 8 1 6 21 5 3 5 81 0 0 2 71 0 6 4 01 02 7 4 5 91 8 4 5 78 9 0 6 31 9 1 2 91 0 7 6 31 1 3 5 0 1 l2 5 3 4 18 6 0 1 1 8 7 3 8 42 1 7 4 71 0 9 9 01 3 2 6 71 22 4 7 4 61 0 7 5 41 7 9 9 3 52 5 0 9 49 3 7 55 4 7 5 1 33 3 0 2 81 9 1 0 67 5 6 9 62 4 4 9 27 3 2 49 3 5 8 1 43 4 0 1 82 2 2 8 31 3 1 2 8 72 8 1 1 21 3 5 4 11 4 6 7 81 5 3 5 1 6 01 1 1 1 91 3 9 2 7 82 7 8 5 81 4 6 0 11 6 7 6 3 1 63 6 9 3 27 8 8 51 9 8 4 8 山东农业大学硕士学位论文 三元素同时富集菌丝体中各元素的含量分析结果见表1 0 。5 号实验 培养基中三种元素的浓度均为5 0 p g m l ，三种元素的含量分别是z n ： 2 5 0 9 4 1 t g g ，s e ：9 3 7 5 r t g g ，g e ：5 4 7 5 p , g ，其比例约为4 6 ：1 7 ：l ， 由此可见，冬虫夏草对三种元素的富集能力的大小顺序为z n s e g e 。 1 0 号实验培养基中三种元素的浓度均为1 0 0 p , g m l ，元素比例约为3 1 ： 2 1 ：1 ，可以看出，随着浓度的升高z n 所占比例有所下降，而s e 的比 例有所升高。l 、2 、3 、4 号实验培养基具有相同的z n 浓度( 3 0 p g m l ) ， 而s e 、g e 浓度的升高能够促进菌丝对z i l 的吸收。具有协同效应。1 、 6 、1 l 、1 6 号实验培养基具有相同的s e 浓度( 2 0 1 a g m l ) ，而z n 、g e 浓 度的增加对s e 的富集影响不大，说明z n 、g e 和s e 之间不存在竞争， 也无协同作用；l 591 3 号实验培养基具有相同的g e 浓度( 5 0 1 tg m 1 ) ， 而低浓度的z n 、s e 对g e 的富集有抑制作用，较高浓度的z n 、s e 对g e 的富集有促进作用。如图9 所示。 ，、2 5 0 0 兰2 0 0 0 蚓1 5 0 0 簇1 0 0 0 1 r 5 0 0 o 024 6 图9 三元紊相互关系 f i g 9r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nz n ，s e a n dg e 在以下的实验中，我们根据中国营养学会推荐摄入量，选取三元素 比例较为合适的“号实验的菌丝体为材料对其有效成分进行了分析。 3 , 4 2 三元素富集菌丝体有效成分比较 3 4 2 1 虫草腺苷的h p l c 分析 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 鼍伏 图1 0 标准品h p l c 图谱 f i g 1 0 h p l co f a d e n i n ea n da d e n o s i n e 由图l o 可以看出，在拟定的色谱条件下，可以将腺苷和腺嘌呤分开。 1 0 8 嚣6 峰4 2 0 00 10 2 o 30 40 50 6 浓度( m g m l ) 图1 i 腺苷标准曲线 f i g 1 1 s t a n d a r da d e n o s i n eg n r y e 腺苷在0 1 0 5 m g m l 范围内呈良好的线性关系，回归方程： y = 1 7 0 3 1 x + 0 3 1 8 8 。相关系数r - - 0 9 9 9 8 。 r 山东农业大学硕士学位论文 图1 2 对照h p l c 色谱图 f i g 1 2 h p l co f e o n t r o l m y c e l i a 喜恤厶 图1 3 三元素富集菌丝体h p l c 色谱图 f i g 1 3 h p l c o f a d e n o s i n e i n m y c o l i a e n r i c h e d w i t h s e z na n d g e 图1 3 是富s e 、z n 、g e 菌丝体的腺苷h p l c 图谱，经计算可知其腺 苷含量为2 2 0 4 m g g 。通过比较可以看出，三元素富集菌丝体的腺苷含量 比对照降低了2 8 9 7 ，出现这种现象的代谢机制有待于进一步研究。 3 4 2 2 三元素富集菌丝体的虫草酸分析 本实验对三元素富集菌丝体中虫草酸含量进行了分析比较，结果表 明，对照菌丝体为8 0 0 2 m g g ，而三元素富集菌丝体的虫草酸含量为 8 3 1 7 m g g ，两者没有明显差异。 戢 一 一 椭 于克学：冬虫夏草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 3 4 2 3多糖含量分析 用硫酸苯酚法对菌丝体中多糖含量进行了比较，结果表明，三元素 富集菌丝体的多糖含量( 1 1 3 m g g ) 比对照菌丝体( 1 5 2 m g g ) 降低了 2 5 7 。 3 4 2 4 总氨基酸含量分析 对三元素富集菌丝体中氨基酸含量分析结果如表1 1 所示。 表1 1富s e 、z n 、g e 菌丝体氨基酸含量( m g 1 0 0 m g ) 氨基酸含量 氨基酸含量氨基酸含量 a s p 2 8 5 v 射1 5 1n h ；0 6 2 t h r1 3 8 m e t0 6 8h i so 5 7 s e r1 1 5 l i e1 2 5 a r g 1 2 5 g l u 3 4 0l e u 1 7 0 t r p g l y 1 4 11 w 0 8 2p m1 1 8 a 1 a2 2 3 p h e 1 1 9 c v s0 4 5 l v s1 4 0总和2 5 0 4 氨基酸分析结果表明，三元素富集菌丝体氨基酸含量( 2 5 0 4 ) 比 对照( 1 3 1 8 ) 提高了8 9 ，由此可见，全面均衡的微量元素营养对氨 基酸的合成具有显著的促进作用。 富s e 、z n 、g e 虫草菌丝体有效成分的比较如图1 4 所示。 山东农业大学硕士学位论文 图1 4 有效成分比较 f i g 1 4c o m p a r i s o n o f f u n c t i o n a li n g r e d i e n t s 3 5 虫草多糖( o 嘲旧e 芦p o l y s a c c h r i d e ，c p ) 的初步分离纯化及性质 研究 3 5 1d e a e 一纤维素柱层析 取l o m l 去蛋白多糖水溶液加入已平衡好的d e a e - 纤维素柱( 硼酸 犁。2 6 9 0 c m ) 中，先用蒸馏水充分洗脱，再分别用0 0 5 、o 1 、0 5 m o l l 的n a c l 溶液洗脱，速度为i m i m i n ，每管5 m l 收集洗脱液，硫酸- 苯酚 法显色后4 9 0 栅测定吸光度，绘制洗脱曲线，如图1 5 所示a 曲线上分别在第1 0 、4 5 、7 4 管附近各出现一个蜂，分别合并各峰洗 脱液得到多糖组分1 - 1 、1 - 2 、1 - 3 。经s e p h a d e xg - 2 5 柱层析脱盐，减压 浓缩至干得到白色纯化多糖。 于克学t 冬虫复草液体发酵富集s e 、z n 、g e 研究 02 04 06 08 01 0 0 管数 图1 5d e a e 纤维素柱层析曲线 f i g 1 5d e a e - c e l l u l o s ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h y 3 5 2 虫草多糖的理化性质 3 5 2 1 茚三酮试验 取上一步所纯化的多糖1 0 m g ，装入安瓿瓶中，加6 m l 2 nh 2 s 0 4 ， 封口，置1 0 5 c 烘箱中加热水解6 h ，使多糖完全水解，饱和b a ( o h ) 2 溶液沉淀s 0 4 2 。离子，离心，减压浓缩得到水解多糖。茚三酮试验均为阳 性，说明多糖各组分中均含有肽链。 3 5 - 2 2 虫草多糖的单糖定性分析 采用新华一号滤纸进行纸层析。 展层剂l ：乙酸乙酯：乙酸：甲醇：水= 1 2 ：3 ：3 ：2 ( v v ) ，展层剂2 ：正丁醇： 吡啶：水= 1 0 ：3 ：3 ( v v ) ，展层剂3 ：正丁醇：苯：毗啶：水= 5 ：l ：3 ：5 ( v v ) ，显色剂为 苯胺一二苯胺试剂。结果如图1 6 所示。 t ， i ， i 半乳糖葡萄糖1 - 1 未糖卜2甘露糖卜3果搪 图1 6 多糖各组分层析图 f i g 1 6p a p e rc h r o m a t o g r a p h yo f c p 结果表明，展层剂2 能够较好地将单糖分离，其r f 值分别为：半乳 糖0 3 6 、葡萄糖0 4 2 、木糖0 5 3 、甘露糖0 5 8 和果糖0 4 7 。虫草多糖的 三种组分均有相同的单糖组成，其r f 值分别为0 3 5 、0 4 2 和0 5 9 ，可断 定为半乳糖、葡萄糖和甘露糖。 4 讨论 4 1 培养基优化 本实验所用培养基是在p d a 培养基的基础上进行优化得到的，而没 有对其它培养基进行筛选，主要是考虑到该培养基的实际应用价值。该 培养基营养较全面，非常适合丝状真菌的生长需要，而且成本相对较低， 在实验室和在实际生产中的制备比较容易，粘度较低，有利于在发酵过 程中氧的溶解和传递。 4 2 冬虫夏草对s e 的富集 冬虫夏草液体发酵对s