（无机化学专业论文）基于罗丹明b的阳离子荧光探针的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 荧光分子探针具有诸如最高可达单分子检测的高灵敏度、能够实现开关操作、对亚 微粒具有可视的亚纳米空间分辨能力和亚毫秒时间分辨能力、原位检测以及利用光纤维 进行远距离检测等众多优点，已经在金属离子、核酸、细胞检测及免疫检测等方面发挥 了重要作用。罗丹明类染料具有优异的光化学物理性质，例如高的摩尔消光系数，良好 的光稳定性，高的荧光量子产率等，因此，基于罗丹明染料的阳离子荧光探针的研究受 到很多科学家的关注。 本文利用了汞的亲硫性，设计了硫化的罗丹明b 类h g + 离子荧光探针r b s l 和r b s 2 ， 并对其性质在d m f 水溶液中进行了系统的研究，发现两者对h 矿离子的灵敏度和选择 性都比较高，r b s l 的最低检测限为4 p p b ，r b s 2 的最低检测限为l p p b 。 在此基础上，设计合成了含有硝基的荧光探针r b s 3 ，通过氢键，用介孔材料 s b a 1 5 - n h 2 吸附探针r b s 3 。通过红外、t e m 、n 2 吸附脱附曲线等手段证明探针固载 在分子筛上，在纯水中固体探针的最低检测限为l p p b ，表明固载之后对h 9 2 + 离子的灵 敏度仍然比较高，从而实现了荧光探针的材料化目的。 为了增加探针的水溶性和细胞兼容性，在罗丹明母体上引入氨基酸基团，设计合成 了两个c 一离子荧光分子探针r b 0 1 和r b 0 2 。荧光光谱的测试结果表明，探针r b 0 1 和r b 0 2 在纯水中能高选择性的识别c ，通过对探针荧光增强光谱性能的测试和 e d t a 滴定实验表明，探针r b 0 1 和r b 0 2 与c ，的络合是一个可逆的过程。活体h e l a 细胞中r b 0 1 和r b 0 2 对c ，识别的荧光成像结果表明，r b 0 1 和r b 0 2 都能够进入细 胞并能有效络合c r 3 + 离子后出现荧光增强。 关键词：罗丹明b ；荧光探针；h 9 2 + 离子；分子筛；c r 3 + 离子 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 s t u d yo ff l u o r e s c e n tp r o b e f o rc a t i o n sb a s e do nr h o d a m i n e - b a b s t r a c t t h ea d v a n t a g e so fm o l e c u l a rf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rs e n s i n gc a nb es u m m a r i z e d ：h i g h s e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o nd o w nt ot h es i n g l em o l e c u l e ，o n - o f p ， s w i t c ha b i l i t y ， s u b n a n o m c t e rs p a t i a lr e s o l u t i o na n ds u b m i l l i s e c o n dt e m p o r a lr e s o l u t i o n ，o b s e r v a t i o ni n s i t u ，r e m o t es e n s i n gb yu s i n go p t i c a lf i b r e s ，e ta l ，a n da l r e a d yh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei n m e t a lc a t i o n s , n u c l e i ca c i d s i n l m u n ec e l l sa n dt e s t i n g t h er h o d a m i n ed y e sh a v ee x c e l l e n t p h o t o p h y s i c sa n dp h o t o c h e m i s t r yp r o p e r t i e ss u c ha sh i g hm o l a re x t i n c t i o nc o e f f i e i e n t , h i g h s t a b i l i t ya g a i n s tl i g h t a n dc h e m i c a lr e a c t i o n s ，a n d h i g h f l u o r e s c e n c e q u a n t u m y i e l d s ，e t c t h e r e f o r e ，t h es t u d i e so nf l u o r e s c e n c em o l e c u l a rp r o b e sf o rc a t i o n sb a s e do n r h o d a m i n ed y e sa r ea t t r a c t i n gm a n yp e o p l e sa t t e n t i o n s an e wk i n d so fr h o d a m i n eb b a s e df l u o r e s c e n tp r o b e sr b s la n di 氇s 2a r ed e s i g n e d , s y n t h e s i z e da n ds t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z e df o rt h es e l e c t i v ed e t e c t i o no fh 一+ b a s e do ni t s t h i o p h i l i c i t yi nd m f h 2 0 ( v v = 1 ：1 ) s o l u t i o n t h e yf e a t u r eb r i g h t n e s sr e de m i s s i o ni nt h e p r e s e n c eo fn g + w i t ht h ef l u o r e s c e n td e t e c t i o nl i m i tf o rn g + i na q u e o u sm e d i ab e i n gp p b l e v e l sa n de x h i b i te x c e l l e n t h 9 2 + - s p e c i f i cl u m i n e s c e n c e e n h a n c e m e n to v e rv a r i o u s c o m p e t i t i v ec a t i o n s ，i n c l u d i n ga l k a l ia n da l k a l i e a r t h , t h ef i r s t - r o wt r a n s i t i o nm e t a l sa n dh e a v y m e t a l s b yi m m o b i l i z i n gr b s 3t ot h em e s o p o r o u ss b a 一15 - n h 2 ，ah i g h l ys e l e c t i v ea n d s e n s i t i v ec h e m o s e n s o rt o w a r dm e r c u r yc a t i o n si na q u e o u ss o l u t i o ni sa c h i e v e d r s a c o u l dq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t em e r c u r yc a t i o n sa tp p bl e v e li nt h ep r a c t i c a le n v i r o n m e n t a l m e d i a ，s u g g e s t i n gt h et h ep o s s i b l i t yf o rr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fh 9 2 + a n dt h e c o n v e n i e n c ef o rp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt o x i c o l o g ya n de n v i r o n m e n t a ls c i e n c e b a s e do n “o f f - o n f l u o r e s c e n ts w i t c hp r i n c i p l e t w of l u o r e s c e n tp r o b e sh a v eb e e n d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d r b 0 1a n dr b 0 2s h o w e dc a ns e l e c t i v e l yr e c o g n i z ec ，+ i nw a t e r t h r o u g ht h ee m i s s i o ns p e c t r u m t h ec o o r d i n a t i o n so fr b o la n dr b 0 2w i t hc d 十a r er e v e r s i b l e p r o c e s st h r o u g h r b 0 1a n dr b 0 2 晰t h 口+ a n de d t at i r a t i o n e s p e r i m e n t s t h e f l u o r e s c e n c e si m a g et h a tr b ola n dr b 0 2w i t hc d + i nh e l ac e l l ss h o w e dr b o1a n dr b 0 2 t ob ea c t e da sf l u o m s c z n tp r o b e sf o rm o n i t o t i n gc d 十i nl i v i n gc e l l s k e yw o r d s ：r h o d a m i n eb ；f l u o r e s c e n tp r o b e ；h 孑+ i o n ；s b a 15 n h 2 ；一+ i o n 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承 担相关法律责任。 学位论文题目：基王矍盘咽里鲍堕直壬兹左拯钍鲍珏究 作者签名：球鞋一日期率年止月趋日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 作者签名： 导师签名： 人连理工大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 分子荧光产生的原理 当用紫外或可见光照射某些物质时，这些物质吸收某种波长的光后会发射出波长和 强度各不相同的光线，当停止照射后，这种红光也随之消失，这种光被称为荧光“”。对 荧光产生原理和条件直到十世纪中期才弄清楚。g o r g e g s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎 宁和叶绿素的荧光后，首先确定和报告了他们的荧光波长总比激发波长要长。他还研究 了荧光强度和荧光物质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会淬灭，他也发现荧光可以被 外部物质淬灭，从而建议利用荧光达到检测的目的。由a l e x a n d e rj a b l o n s k i 在1 9 3 5 年提 出的荧光产生的过程图，常被称为j a b l o m k i 图【3 】( 见图1 1 ) 。通常情况下，荧光试剂 分子处于基态，吸收光后试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单 重态和三重态两种类型。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为0 或l 。s 为0 时 忙三圭 汪 j 掣磙 卅一、巍i 学 芷工二二五面函面函盎 l ，e ：一 圈1 1 发光系统的j a b l o m k i 图 f i gl 1j a b l o m k id i a g r a m f o r a p h o t o l t m a i n e e a ls y s t e m 分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机 物分子的基态是处于单线态。分子吸收光能后电子越迁到高能级，电子自旋方向不变， 此时分子处于激发单重态。s o ，s l ，s 2 ，表示分子的基态和第一，第二，激发 单重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有 电子自旋方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子此时s = i 表 明分子处于激发态的三重态，用t 表示，t 1 ，t 2 分别表示三重态的第一第二激发态，分 子中的电子从基态s 0 跃迁到激发态s ，s 2 比较容易发生，进行很快( 1 0 4 s ) ，而从基 志单重态到激发三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其它同类 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 分子或溶剂分子碰撞通过内转换回到激发态的最低能级s l ，这一过程为1 0 1 2 s ，处于激发 态最低能级的分子寿命一般为1 0 r 4 1 0 s 。它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是 荧光。从s l 到t l 能量转化是系间跨越。从t l 到s o 有两种过程：个事物能量释放； 另一个是放出光子，即磷光，在1 0 - 41 0 s 间完成。 1 2 荧光分子探针的定义 荧光探针定义为能和个别组织特异结合而又不干扰其他组织成分自身荧光的那些 荧光化合物，为了和细胞中的自发荧光物质相区别，人们也曾称荧光染料为次级荧光体， 相应地把这种染色过程称为次级染色，把像卟啉这样的自然荧光物质称为初级荧光体。 而现在把所有的荧光探针，不管其染色性能和对天然荧光的影响如何，都统称为荧光探 针劓。 荧光探针大多是含有共轭双键体系的有机化合物，共轭双键使其容易吸收激发光， 其激发波长多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。 作为荧光探针应该具有以下特点h 3 ：第一，荧光探针的荧光必须与生物样品的背景 荧光易于区别；第二，荧光探针必须不干扰研究的主体；第三，荧光探针主要用于生物 活体或在天然生物条件下的体外样品的研究，所以荧光探针的毒性、使用的p h 范围， 生物相容性等方面都有严格的要求。 目前使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类，香豆素类等化合物，它们被称为 “在化学反应中与无荧光的化合物之间形成化学键的物质 啼1 。 1 3 荧光分子探针的结构 r 啊一的 矗删鼍蛐i - 可 图1 2 荧光探针的结构模型 f i g 1 2a s l r u c t u r a lm o d e lo ff l u o r e s c e n tp r o b e 荧光分子探针一般由两部分组成( 图1 2 ) ：( 1 ) 识别基团，能选择性地与被分析物结 合( 般形成络合物的形式) ，这使分子探针所处的化学环境发生改变：( 2 ) 荧光基团，将 一2 一 _曩量oi，暑。 大连理工大学硕士学位论文 识别基团与被分析物络合所引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号( 如荧 光) 。 1 4 荧光探针与分子结构的关系 荧光探针的荧光特性首先取决于其自身的分子结构，其次是环境因素的影响。大量 研究结果表明，荧光探针的性能与探针的共轭体系大小、共轭y 键体系的共平面性和刚 性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何构型等因素相关砸1 。 共轭体系越大，离域7 电子越易激发，越易产生荧光，荧光强度往往越强。但是芳 香环或共扼体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长向长波方向红移，这与共轭7 r 键 体系的共平面性和刚性有关。同一体系的芳香族化合物，线性结构的荧光波长比非线性 的长口1 。 强的荧光试剂除了具备大的共轭万键体系还必须具备平面性和一定程度的刚性。含 有给电子取代基的荧光化合物，其荧光强度一般都会增强。这类基团如：卟m 2 ，- n h r ， n ，o h ，o r 和c n 。含有吸电子取代基的荧光化合物，其荧光强度一般都会减弱。 属于这类取代基的有c = o ，一c o o h ，c h o ，- n 0 2 和- n = n 。荧光体取代上重原子后， 荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的取代，一般指的是卤素( c l ，b r 和d 的取代。 芳烃取代重原子后，荧光强度一般随卤素原子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子 效应旧1 。 此外，溶液中的温度、溶剂、p h 等环境因素对分子荧光也可能会产生一定程度的 影响。 1 5 荧光分子探针的识别原理 1 5 1 光诱导电子转移 典型的光诱导电子( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ，p e t ) 转移体系是由包含电子给体 的受体部分r ( r e e e p t o r ) ，通过间隔基s ( s p a c , e r ，如- c h 2 ) 和荧光团f ( f l u o r o p h o r e ) 相连而构成 的【9 。1 1 1 。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所，受体部分则用来结合客体，这 两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连成一个分子，构成了一个在选择性识别课题的同 时又给出信号变化的超分子体系。p e t 荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着 光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移到激发态荧光团 ( 还原型p e t ) 。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受 体与客体结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光 ( 图1 3 ) 。 一3 一 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 ，厂 蛔帆e 匿互 旧脚叮 t l t r l e s o nt l t x x e s c e n t 图1 3p e t 荧光分子探针识别客体原理图 f i g 1 3t h ep r i n c i p l eo fg u e s tr e c o g n i t i o nb yp e tf l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e p e t 荧光分子探针的作用机制可由前线轨道能量来说明( 图1 4 ) ，荧光团受到激发 后，其最高占有分子轨道( h o m o ) e 的电子被激发跃迁到最低不占有分子轨道( l u m o ) 上，这使得供体( 属于受体部分) h o m o 轨道上的电子能被光诱导转移到荧光团的h o m o 轨道上，引起荧光团的荧光淬灭。在受体与客体相结合后，供体的氧化还原电位增加， 其h o m o 轨道的能级变得比荧光团的h o m o 轨道的能级低，结果光诱导电子转移不能 u= 拇u 曼c m m f r e e e x c i t e d b o u n d f l u o r o p h o r e r e c e p r o rri 脯同k ，r er e c e p t o r 图1 4p e t 机理的前线轨道理论示意图 f i g 1 4 f r o n t i e ro r b i t a le n e r g yd i a g r a m si l l u s t r a t i n gt h em e c h a n i s mo fp e t 再发生，荧光淬灭被抑制。由于与客体结合前后，荧光强度差别呈明显的“关、“开 状态，这类探针又被称作荧光分子开关。 到目前为止，p e t 机理已被广泛用来设计功能有机分子，有大约6 0 0 0 多篇相关的 化学文献被报道。科学家们通过p e t 机理设计了很多功能有机分子器件，其中包括分子 器、电化学传感裂12 1 、开关【1 3 1 、光电电池【1 4 1 、非线性光学材料【1 5 】、荧光分子探针1 6 】等。 p e t 是人们在设计荧光分子探针时使用的最为广泛的原理之一，多数荧光分子探针是以 脂肪氨基、或氮杂冠醚作为受体单元。化合物1 是第一个最简单的p e t 荧光分子探针旧， 在甲醇中和k + 络合后，其荧光量子产率从0 0 0 3 增加到0 1 4 。吴云扣等【1 8 】合成的以二( 2 吡啶甲基) 胺为识别基团、b o d i p y 为荧光团的p e t 荧光分子探针2 ，对p h 不敏感，其 p k a 被降为2 1 ，它的细胞渗透性很好，在细胞内z i l 2 + 的荧光显微成像研究获得了满意 帕的 斗 # 腑 粕 u 旧 大连理工大学硕士学位论文 的结果。g u n n l a n g s s o n 研究小组【1 9 】设计合成了含氨羧酸基团的化合物3 在p h 较高的介 质中稳定，并且水溶性好。当p h 3 时，其荧光被淬灭，因此，化合物3 可用在竞争性 p h 介质中，如在生理p h 条件下。 23 4 图1 5 四种p e t 荧光分子探针 f i g 1 5 f o u rp e tf l u o r e s c e n tp r o b e s 多数p e t 荧光分子探针是基于受体和客体的结合，抑制了从受体到荧光团的光诱导 电子转移，从而使荧光团发射出强荧光的原理设计的。但是，当与过渡金属作用时，结 果有时会发生变化。由于过渡金属的3 d 电子的氧化还原行为，可以发生从荧光团到络 合的过渡金属的电子转移，或者从过渡金属向荧光团的电子转移，因此，可以通过无辐 射能量转移使荧光淬灭。化合物4 的分子设计也是基于p e t 过程【2 0 1 ，但不同的是，当 络合客体后，产生了从荧光团到金属离子的氧化p e t 过程，导致荧光淬灭。 1 5 2 分子内电荷转移 当直接连有供电子基( 通常是氨基) 的荧光团和一个吸电子基共轭连接时，在光的 激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。典型分子内电荷转移 ( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ，i c t ) 2 1 - 2 4 荧光分子探针就是荧光团上连有强的吸电子基 和供电子基的推拉电子体系。i c t 荧光分子探针的受体往往是推拉电子体系整体中的 一部分，当荧光团上的受体( 如氨基) 在供电子基团一端时，和客体结合后会减少这个供 电子基团的供电能力，从而导致体系共轭程度降低，吸收光谱蓝移，并伴随着摩尔消光 系数的减小。相反，当荧光团上的受体在吸电子基团一端，也就是说，在推拉电子体系 中拉电子的一端时，和客体结合后，会增大体系推拉电子的能力，增大电子的流动性， 吸收光谱红移，摩尔消光系数增大( 如图1 6 所示) 。原理上，荧光光谱的位移和吸收光 谱的位移方向一致。除了光谱的变化外，也能观察到荧光量子产率和荧光寿命的变化。 所有这些光物理性能的变化决定于客体的大小和电荷多少。 一5 一 夕嘏 义夯 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 图i6 金属离子与供电子基或吸电子基结合引起的i c t 荧光分子探针荧光光谱的变化趋势 f i g1 6s p e c t r a ld i s 。l a c e m e n t s o f i c t p r o b e sr e s u l t i n g i n t e r a c t i o no f a b o u n dc a t i o n w i t ha n e l e e h o n - , d o n a l i n g o f e l e c t c o n - w i t h d r a w i a g g r o p 很多i c t 荧光分子探针是按照下面的原理设计的：阳离子识别体是一个氮杂冠醚， 氮杂冠醚上的一个氨原子和一个吸电子基共轭。冠醚上的这个氮原子对荧光团和阳离子 都起着电子供体的作用。5 是一个d _ a d ( 供一受一供) 型i c t 荧光分子探针口”，氮杂冠醚 有着双重身份：既是推拉电子体系中的电子给体，又是探针分子中的识别基团。当冠醚 与c 一+ 络合时，由于金属离子的拉电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的供电子能力， 因此其吸收光谱发生较大的蓝移。荧光光谱也发生蓝移，但比吸收光谱蓝移得幅度要小。 这是由于光诱导电荷转移减少了冠醚上氮原子的电子云密度，这个氮原子由于极化变为 非配位原子。因此，光激发诱导冠醚上氮原子和金属离子之间的作用减弱或消失，从而 使荧光光谱发生较小的蓝移。 抵( c 溯一 图l7 两种i c t 荧光分于探针 f i g1 7t w oi c tf l u o r e s c e n t p r o b e s r 叫h c 埘 对于阳离子控制的i c t 荧光分子探针束说，其光物理变化现象经常是很复杂的。因 为激发态电荷转移经常伴随着扭曲的分子内电荷转移【2 6 j ( t w i 删i n t r a m o l o c u l a r c h a r g e 圣 大连理工大学硕士学位论文 f 6 r s t e r 8 理论，能量转移效率决定于两个荧光团之间的距离： r = i ( i + r 民) 6 ( 1 1 ) 式( 1 1 ) 中r 表示两个荧光团之间的距离。凡表示f 6 s t e r 临界半径。两个荧光团之间的距 离的变化就会导致能量转移效率较大的增加或减少。 n h 图1 1 0 荧光共振能量转移p b 2 + 探针 f i g1 10 p b 2 + f l u o r e s c e n c ep r o b eb a s e do nf l u o r e s c e n c et e s o n 爿n c ce n e r g yt r a n s f e r 化合物8 是按照这个原理设计的p b 2 + 荧光分子探针【3 6 如。两个荧光团( 香豆素) 由含 氧醚链间隔基连接。在乙腈中探针8 络合p b 2 + 引起了吸收光谱、激发光谱和发射光谱的 变化，但碱金属和碱土金属离子几乎没有干扰。p b 2 + 离子络合物的稳定常数3 1 x 1 0 飞, i 。 能量转移效率在络合p b 2 + 离子后从0 7 7 增加到o 8 9 。 f r e t 近年来也被广泛地应用在生物酶的活性检测【3 引，用在研究蛋白的结构【3 9 1 、核 酸的结构、核酸调控【4 1 1 、寡核苷酸从核糖体上释放 4 2 1 等许多方面。 1 5 5 光诱导质子转移 。 芳香轻基( 酚类化合物) 在基态和激发态时通常具有不同的质子解离常数，受光激发 质子更加容易脱去，激发态时酸性增大，即这一类化合物激发态的p k a 要小于基态的 p k a 。比如苯酚的p k a 和p 对分别是1 0 6 和3 6 ，2 萘酚的分别是9 3 和2 8 。同样的对 于芳香质子受体( 芳胺或芳环氮杂原子) ，激发态时碱性增大，激发态的p k a * 要大于基 态的p k a 。比如2 萘胺的p k a 和p k a 分别是7 1 和1 2 2 ，吖啶的分别是5 5 和1 0 6 。这 样在合适的p h 范围内就可以由一个基态得到两个激发态，分别对应于中性和脱质子( 酚 类) 形式，或者是对应于中性和结合质子( 芳胺或芳环氮杂原子) 形式。在激发态形成的这 种脱质子或结合质子的转换能够迅速地达到平衡，从而发射出两种波长的荧光【4 3 1 。这一 原理主要用来设计p h 荧光分子探针，应用最多的是苯并【c 咕吨类染料】。 1 5 6 激发态分子内质子转移 激发态分子内质子转移【4 5 - 4 8 l ( e x c i t e d s t a t ei n t r a m o l e e u l a rp r o t o nt r a n s r c r ，e s i p t ) 是 指当某些有机分子在光、热、电等作用下被激到激发态时，分子中某一基团上的质子转 移到分子内邻近的n 、s 、o 等杂原子上，形成互变异构体的过程。以吲哚类染料为例， 一9 一 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 激发态分子内质子转移如图1 11 。 i m f r 厂、 图1 1 1 吲哚类激发态分子内质子转移机理 f i g1 11 e s i p tm e c h a n i s mf o rb e n z a z o l ed y e s 烯醇式异构体e 受光激发跃迁到酽，经过快速的分子内质子转移过程转变为酮式互 变异构体激发态k 宰，以发射更长荧光的方式衰减至基态k 【4 9 1 。这种质子转移反应，在 生物学和化学的许多过程中普遍存在，因此较早受到人们的关注【5 0 】。由于e s i p t 分子的 质子转移荧光效率高，斯托克斯位移大，作为激光染料和闪烁器的工作介质，具有突出 的优点，已为人们所应用。近年来光电子学和信息科学迅速发展的需要，人们广泛寻求 新型的具有光电信息功能的有机材料。e s i p t 分子具有光学双稳态、光致变色和光学非 线性等诸多特性，而且反应速度快，可达蠡量级，并且是可逆的，可望成为光开关、光 限幅、光波导、实时光存储等光子学器件的优选材料【5 1 1 。由于e s i p t 表现出来的良好 的双荧光性能，近年来也被作为一种信息传递机制应用到荧光分子探针的设计中【5 2 。5 4 1 。 1 6罗丹明类阳离子荧光探针的研究进展 罗丹g q ( r ) 及其衍生物是一类重要的荧光探针染料，属于咕吨类碱性染料。由于苯 环间氧桥的存在，分子具有刚性共平面结构，这使其分子结构稳定性增强，在激发光的 作用下能产生强烈的荧光，在红色可见光区( 5 0 0 r i m 7 0 0 r i m ) 受样品背景干扰相对较少， 是生物分析中经常用到的荧光染料，具有很高的研究和商业价值。因此，国内外的科学 家致力于以罗丹明为母体，通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行设计，来改善罗 丹明类荧光染料的性能，以期望用于不同的研究中。 近年来，罗丹明的内酰胺螺环状结构成为研究的热点：罗丹明的内酰胺螺环状结构， 在长波长处无吸收，无色，无荧光：破坏内酰胺螺环状结构，在长波长处有吸收，有颜 悄 大连理工大学硕士学位论文 色，强荧光。由于此结构上的优势，罗丹明内酰胺类化合物具有形成“o f f o n 型荧 光探针的潜能。可以以罗丹明为母体进行设计，使它形成具有酰胺螺环状结构的化合物， 也就是说首先它是在长波长无吸收，无色，无荧光，当它与底物作用的时候，打开内酰 胺螺环状结构，这时它在长波长有吸收，有颜色，强荧光。利用此原理对罗丹明进行设 计已用来检测金属离子。 1 6 1 h 9 2 + 离子的检测 2 0 0 5 年，h o n gz h e n g _ 【5 5 1 等人把罗丹明b 酰肼上的o 原子换成s 原子，成功地实现 了只换一个原子而改变其识别性能，即罗丹明b 酰肼选择性的识别铜离子，而罗丹明b 酰胼上的o 原子换成s 原子可选择性的识别汞离子。 同年，j i n s u n gt a e 5 6 1 等人利用汞离子催化氨基硫脲形成1 3 4 嗯二唑酮的原理合成新 的荧光探针检测汞离子。该荧光探针响应时间快，加入汞离子后，溶液瞬间变成红色， 并产生黄色的荧光。 子。 f r ， 2 2 0 、n ， 0 2 2 3 目标化合物r b s l 和r b s 2 的合成： ( 1 ) r b s l 的合成：将硫代的罗丹明b 的肼化产物( 0 1 9 ) 溶解于2 5 m l 甲醇中并 开始搅拌，慢慢加入苯甲醛( 0 0 2 3 9 ) ，继续搅拌1 0 分钟，开始加热，当反应开始回流 时加入3 滴冰醋酸，回流反应3 小时，冷却得到淡粉色沉淀o 0 4 6 舀产率：3 9 7 ( 核磁 表征见附录1 ) 。 n ( 2 ) r b s 2 的合成：将硫代的罗丹明b 的肼化产物( 0 1 9 ) 溶解于2 5 m l 甲醇中并开 始搅拌，慢慢加入4 一( - - e p 氨基) 苯甲醛( 0 0 3 3 9 ) ，继续搅拌1 0 分钟，加热，当反 应开始回流时加入3 滴冰醋酸，回流3 h ，冷却得到橘黄色沉淀0 0 6 7 9 ，产率：5 8 4 ( 核 磁表征见附录2 ) 。 n 屯矽 n l 大连理工大学硬士学位论文 2 24 晶体结构 对于分子结构最有说服力的数据就是分子的单晶衍射结果，它比较直观的反映了分 子的空间构型、键长键角的具体大小，而其他表征手段不具备这种能力。分子的结构与 分子物理化学性质有着必然的内在联系，因此探讨单晶结构将有助于更深入的了解荧光 探针的光物理性能。 ( 1 ) r b s l 的晶体结构： 将探针r b s l 溶于二氯甲射正己烷( v v - 1 ：1 ) 的混合溶剂中，室温下通过自然挥发培 养出了探针r b s l 黄色单晶。晶体结构如图21 所示，氧杂蒽平面与苯环相互垂直，它 f l z 间的二面角为9 0 0 ( 4 ) 。c 1 、c 2 、c 7 、c 8 和s l 形成闭环，c ( 8 ) 一s ( 1 ) 键长：17 4 2 ( 3 ) ， 大于c ( 8 ) - n ( 1 ) 的键长：1 2 8 7 ( 3 ) ，说明c ( 8 ) 与n ( 1 ) 之间为双键，s 1 是连接双环的螺旋原 子。 图2 i 探针r b s i 的晶体结构 f i g21 c r y s t a ls u c n 砒o f p r o b c r b s i ( 2 ) r b s 2 的晶体结构： 将探针r b s 2 溶于二氯甲烷正己烷( v ，v = i ：1 ) 的混合溶剂中，室温下通过自然挥发培 养出了探针r b s 2 黄色单晶。晶体结构如图2 2 所示，氧杂葸平面与苯环相互垂直，它 们之问的二面角为9 00 ( 3 ) 。c t 、c 2 、c 7 、c 8 和s 1 形成闭环，s l 是连接双环的螺旋原子。 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 厂、一 ( ：l i - i l 、， 、y 。下 l 例2 2 探针r b s 2 的晶体结构 p i g2 2 c r s t a l $ t r d c u l r e o f p r o b o r b s 2 ( 3 ) 探针r b s i 和r b s 2 的互变异构： 探针r b s i 和r b s 2 存在硫取代五元杂环( a ) 和氮取代五元杂环( b ) 的互变异构( 图 2 3 所示) ，由晶体结构数据分析可知主要是以( b ) 的形式存在，硫醚比硫代酰胺的配位 能力弱，因此更有利于对汞离子的选择。 、 l ， 圈2 3 探针r b s 的两种可能的互变异构体 f i 9 23 i s o m e rs t r u c t u r e o f p r o b e u s 23 光谱数据结果讨论 231 h g 对探针r 髂1 、r b s 2 荧光及吸收光谱的影响 测试条件：5 0 0 n t o 处激发，激发发射狭缝宽均为3 m ，探针的浓度为i o i x m l 。在 d m f 的水溶液( v v = l ：l ，p h = 7 ) q q 进行。 ( 1 ) h f + 对r b s l 的吸收光谱和荧光光谱的影响 不同浓度的h 矿对r b s i 的荧光光谱和吸收光谱的影响如图24 、2 5 所示。从图2 5 中可以看出。不加h 矿+ 时，r b s i 的吸收光谱在5 0 c h m i 以上几乎没有吸收带，而且其荧光 黢 大连理工大学硕士学位论文 很弱( 见图2 4 ) ，这说明r b s l 此时主要以闭环形式存在。加入h 孑+ 后，r b s l 的吸收光谱 在5 6 6 n m 处出现很强的吸收峰，荧光光谱在5 9 9 n m 处的荧光强度大幅度增加，r b s l 的荧 光强度分别增大约1 2 0 倍，证明r b s l 探针分子明显地发生了开环。溶液颜色从无色变为 深红色，用眼睛就可以方便地定性分辨出溶液中是否含有h f + 。由紫外滴定曲线计算得 r b s h 矿+ 体系的平衡常数鼯5 4 x 1 0 8 舻，并以罗丹明b ( 西= o 8 9 ，乙醇溶液中) 为标准测 定了体系荧光量子产率o = 0 1 l 。 图2 4 在不同浓度h 9 2 + - f 的r b s l ( 1 0 i _ t m ) 的荧光滴定曲线【h 孑+ = o - o 2 r e t o o l f i g u r e 2 4 t h ef l u o r e s c e n te m i s s i o ns p e c t r a lo f r b s l ( 1 0 m ) w i t ha d d i t i o no f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n so fr i 9 2 + i nd m fa q u e o u ss o l u t i o n 图2 5 在不同浓度h 9 2 + 下的r b s l ( 1 0 i _ t m ) 的吸收滴定曲线 f i g 2 5 t h ea b s o r p t i o ns p e e l r ao f r b s l ( 1 0 i t m ) i nt h ep r e s e n c eo f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sh 9 2 + ( 2 ) h 孑+ 对r b s 2 的吸收光谱和荧光光谱的影响 不同浓度的h 矿对i 也s 2 的荧光光谱和吸收光谱的影响如图2 6 、图2 7 所示。从图2 7 中可以发现，不加h 矿+ 时，r b s 2 的吸收光谱在5 0 0 n m 以上几乎没有吸收带，而且其荧光 很弱( 见图2 6 ) ，这说明i 氇s 2 此时主要以闭环形式存在。加入饱和h 矿后，r b s 2 的吸收 ooc啊eoo 基于罗丹明b 的阳离子荧光探针的研究 光谱在5 6 4 n m 处出现很强的吸收峰，荧光光谱在5 9 5 n m 处的荧光强度大幅度增加，发射 光谱有红移，最大发射峰从5 7 8 n m 位移至u 5 9 5 n m ，证明r b s 2 探针分子明显地发生了开环。 溶液颜色从无色变为深红色，用眼睛就可以方便地定性分辨出溶液中是否含有h 孑+ 。通 过计算探针i 氇s 2 与h 矿的平衡常数肾7 8 x 1 0 8 衍以罗丹明b 为基准物( m = 0 8 9 ，乙醇 中) 测得o = 0 1 2 。 i - i u 时 图2 6 在不同浓度h 9 2 + - f 的r a s 2 ( 1 0 k t m ) 的荧光滴定曲线 f i g u r e 2 6 t h ef l u o r e s c e n te m i s s i o ns p e c t r ao f r b s 2 ( 1 0 i t m ) 丽t ha d d i t i o no f v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fr i 9 2 + w m - s - = , o - ( m m ) 图2 7 在不同浓度h 9 2 * t 的r b s 2 ( 1 0 1 a m ) 的吸收滴定曲线 f i g 2 7 t h ea b s o r p t i o ns p e c t r ao f r b s 2 ( 1 0 i - t m ) i nt h ep r e s e n c eo f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sn g + 2 3 2 探针r b s l 、r b s 2 对h 9 2 + 的选择性 ( 1 ) 金属离子对r b s l 、r b s 2 吸收光谱和荧光光谱的影响 大i 耋理工人学硕士学位论文 通过吸收光谱和荧光光谱检测探针e b s l 、r b s 2 对金属离子的选择性识别。在探针 r b s l 、r b s 2 的d m f 水溶液中，加入2 5 e q 的常见金属离子n a + 、k + 、“+ 、c d ”、c 0 2 、 c u 2 + 、m 9 2 + 、m n 2 + 、n i 2 + 、a g 、p b ”、z n 2 、h 矿的识别分别如图2 8 、图2 9 所示。 u c ac d kr i g n ip b z n h g 幽2 g 探针r b s i 对金属离子的荧光( a ) 及紫外o ) 选择性 f i g u m 2 8f l u o r e s c e n c ea n d a b s o r b a n c bs p e c t r a o f r b $ 1 ( 】0 阚i a a d m f h 扣( 1 ：1 ，v v ) s a l u f i o a m m e o f 2 5e q u i v o f d i f f e t e a t m e t