（生物化学与分子生物学专业论文）alk1在小鼠胰腺中的表达与定位研究.pdf

摘要 胰腺是重要的消化和内分泌器官，分为外分泌部和内分泌部两部分。外分泌部由腺 泡和导管组成，其分泌的胰液有重要的消化作用。散布在腺泡之间的胰岛( i s l e to f l a n g e r h a n s ) 构成内分泌部，可分泌多种激素。成熟胰岛主要含有a 细胞、p 细胞、6 细胞、y 细胞四种细胞类型，分别分泌胰高血糖素( g h l c a g o n ) 、胰岛素( m s u l i n ) 、生 长抑素( s o m a c o s t a t i n ) 和胰多肽( p a l l c r e 撕c p o l y p e p l i d e ) ，它们对体内的糖代谢和血糖 平衡发挥重要的调控作用。 近年来，由于糖尿病、胰腺癌等胰腺疾病在世界范围内的发病率不断上升，有关胰 腺发育的分子调控机制的研究越来越受关注。胰腺的发育是一个高度协调的过程，受到 多种信号通路的共同调控。1 h n s f o r m i n gg r o w mf h t o r p ( t g f p ) 信号通路是其中一类重 要的调控通路。迄今为止，已经有大量文献报道该信号通路在胰腺发育和胰腺疾病中的 调控作用，但是其中的具体作用机制至今还不清楚。 a l k l ( a c t i v i nr e c e p t o r 1 i k ek i n a s e l ；a c v r l l ) 是t g f p 信号通路中的一种i 型单跨膜 丝氨酸苏氨酸激酶受体。在t g f p 信号通路中，能够与t g f p 1 或t g f p 3 结合，通过 活化某些s m a d s 蛋白传递信号。现有研究发现a l k l 主要表达于内皮细胞，参与调控血 管发生发育过程。至今尚无关于它在胰腺细胞中表达的任何报道。我们认为，从t g f b 信号通路的重要受体a i ，k l 着手进行研究，对于进一步认识该信号通路在胰腺发育 调控中的作用途径和机理尤为重要。 本实验以c 5 7 b l 6 j 小鼠1 2 5 天1 6 5 天，1 8 5 天的胚胎、新生和出生后5 周的小鼠 为研究材料，制作石蜡切片，通过免疫组织化学染色和免疫荧光共定位技术，用抗体 r a b b i tp o l y c l o n a la n t i - a c v r l l 和p o i y c l o n a lg u i n e ap i ga m i s 研n ei n s u l i n 检测并定位基因 a l k l 在小鼠胰腺中的表达和发育变化。 结果显示，a l k l 在小鼠胚胎1 2 5 天的胰腺中没有表达，1 3 5 1 6 5 天、1 8 5 天、新 生及出生5 周时均在胰腺中有特异性表达，且表达量随着胰腺发育阶段的变化而逐渐增 多；共定位分析显示a l k l 与i n s u l i n 表达位置基本一致。 为了进一步确定上述实验结果，我们用另一种a l k l 抗体r a b b “p o l y c l o n a l a n t i t g 邛r i ( v - 2 2 ) 与p o l y d o n a lg u i n e ap i ga t l t i - s 惭n ei n s u i i n 共染新生小鼠的胰腺组织 切片，免疫荧光共定位结果显示，二者完全共定位于胰腺b 细胞。这充分肯定了a l k l 是由分泌i n s u l i n 的b 细胞表达的结果。我们认为，本实验首次发现了a l k l 在小鼠 胰腺p 细胞中的表达，为今后研究t g f b 与胰腺发育调控提供了直接证据。 关键词：a l k l ，t g f p ，免疫组织化学，免疫荧光，胰腺p 细胞 a b s t r a c t p a n c f e a si sa ni i n p o r t a n t 唧1 e xe x o c 咖ea n de n d o c r i n e 羽锄d e x o c r i n e 罾趾d ，t 1 1 a t m a i n l yp m d u c ed i g e s t i v ee m 可m e si sc o m p o s e db ya c i n a rc e u sa n d “c t s e i l d o c r i n ec e i l s 盯e m a i n l y g r o u p e dn ot h ei s l e 协o fl 卸g e m a l l s ，w 1 1 i c ha r ec o m p a c ts p h e r o i d a l c l u s t e r s e m b e d d e di nm ee x o c r i n ec e l l e a c hi s l e tc o n t a i l l sf o u rc e l lt y p e s ：旺一c e l l s ，p - c e l l s ，6 一c e l l s ， 丫一c e l l s ，w h i c hr e s p e c t i v e l yp r o d l j c e9 1 u c a g o n ，i n s u l i n ，s o m a t o s t a 廿n ，p 柚c r e a t i cp o l ”印t i d e t h e yp l a ya n 曲p o n a n tr o l ei ng l u c o s eh o m e o s t a s i sa 1 1 dg l y c o m e t a b o l i s m r e c e n n y ，f o rt h ea 雠a c kr a t e so fd ia _ b e t c sm e l l m l sa n dp a r 吼e a t i cc a l l c e rg ou p ，m o r ea n d m o r ea t t e n t i o nw a sp a i dt ot h e s n l d yo fm em 0 1 e c u l a rm e c h a 芏l i s mo ft h ep a n c r e a s d e v e l o p m e n t t h ed e v e l o p r n e mo f p a n c r e a si sal l i g l l l yc o n c o r d a n tp r o c e s s ，w l l i c hi sr c g l l l a t e d b ym a l l ys i 酏a 1s y s t e m s ，o fw h i c ht r a n s f o r h l i n gg r o w m 矗l c t o 卜p ( t g f 一9 ) s i 弘a l i n gp 砒1 w a y p l a yak e yr o l e ，b yn o w ，t 1 1 e r eh a v eb e e ni n a n yr 印o r t sc o n c e m e d ，b u t1 i m ei sk n o w n a b o mt h e d e t a i l e dm e c h a n i s m a l k l ( a c 廿v i nr e c e p t o r - 1 i k e 虹n a s e l ；a c v r l l ) i so n eo f 也et y p ei 坛a i l s 1 e n l b r a l l e s e 血e t 1 1 r e o n i n e 虹n a s er e c e p t o r si nt g f ps i 驴a l i l l g ，恤c hc 趾b i n dt ot g f p lo rt g f p 3 i n 也ep a 血w a ya i l dt 1 1 c nt r a n s n l i tt l l es 培n a lb yp h o s p h o r y l a t i n gs o m es m a d sp r o t e i n s a l k l i sr 印o n e dt om o s t1 1 i g h j ye x p r e s si ne n d o 也e h a lc e l l s ，a n di n v o i v e di n 也er e g u l a t i o no fm e f b 衄a t i o no f b l o o dv e s s e l s n e r eh a sb e e nn or e p o r ca b o u ti t se x p r e s s i o ni np a i l c r e a s 岫m n o w a so n eo ft h ek e yr e c e p t o r so ft g f - ps i g n a l i n gp a 1 w a y ，i ti ss i 鲥f i c a t i v et os t u d yt h e e x p r e s s i o no fa l k lf o r1 l n d e r s t a l l d i n gt h em e c h a l l i s mo ft l l i sp 砒w a yd u 血gp a n c r e a s d e v e l o p m e n t i no r d e rt oe x 锄i n e 也ee x p r e s s i o na i l d1 0 c a t i o no fa l k ld u r 啦恤d e v e l o p m e n to f c 5 7 b l 6 jm o u s e ，b ym e a l l so fi i n 肌m i h i s t o c h e m i s 订ya 1 1 di h i s t o n u o r e s c e n c e ，w e s t a m e dt h ep a r r a f f i ns l i c e so fe 1 2 5 - 1 6 5 d a y ，e 1 8 5 d a ye m b r y o s ，n e w b o ma n dp o s 币r c n a t a l 5 - w e e k b yr a b b i tp o l y c l o n a la n t i a c w l l 趾dp 0 1 ”l o i l a lg i l i n e ap i ga n t i s w i l l ei 1 1 s l l l i n n o e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di n1 2 5 d a y ，a l k l 、a sp r e s e n ti nm o u s ep a n c r e a s 台o m1 3 5 dt o 1 8 5 d ，n e wb o ma i l dp o s 印r e n a t a l5 - w e e k ，a n dc x c l u s i v e l y1 0 c a l i z e dt 0t h ec e l l si n s u l 血 e x p r c s s e d ；n se x p r e s s i o nw a si n c r e a s ew i t hm ed e v e l o p m e mo f t h em o u s ep a n c r e a s b e s i d e s ，i n0 r d e r t oc o n f i r n l 也e s er e s u l t s ，w es t a i l l e dm ep a r a f 五ns l i c e so fn e wb o m m o u s eb yp o l y c l o n a lg u i n e ap i ga n t i s w i n ei n s l l l i na i l da i l o t b e ra l k la m i b o d y ，r a b b i t p o l y c i o n a l 趴t i t g 邛i 己i ( v - 2 2 ) t h ec o l o c 矾o nr e s u l t so fj m m 力o n u o r e s c e n c es h o w e dm a t n l e s et w op r o t e i ne x p r e s s e di nt h es 锄ep a n c r e a t i cc e l l s ，a 1 1 dt 1 1 i sw a sc o n s i s t e n t 丽t ht b e f o r e g o i n g w eb e l i e v e t h a to l l rf i n d i n g p r o v i d ee v i d e n c e sf b rr e v e a l i n gt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo f t g f p a c t i o ni nm o u s ep a l l c r e a 8d e v e l o p m e n t i i k e yw o r d s ：a l k l ；t g f 一弘；i m m u n o h i s t o c 船蔓n i s 姆；i 窃u 僦s c e n c e ；p a n c r e a t i c 辂一c e l 重 l 珏 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：韭d 卜日期：土“址 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：强i 罄l 指导教师签名：座金】亟一 日期：迦6 ：6 ：日期：也：6 ： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 1 通讯地址：上爸孥缸陛磁臼犀芰一 电话：一f 担2 j 堑7 占 邮编：堑鲤i f 引言 一、胰腺的组织结构与发育过程 ( 一) 、胰腺的组织结构 胰腺是一个重要的消化和内分泌器官，表面覆有结缔组织被膜，结缔组织伸入腺 实质将其分隔成许多界限不明显的小叶。胰腺表面覆以薄层结缔组织被膜，结缔组织 伸入腺内将实质分隔为许多小叶，但人胰腺小叶分界不明显。腺实质由外分泌部和内 分泌部两部分组成。外分泌部分泌胰液，含有多种消化酶，经导管排入十二指肠，在 食物消化中起重要作用。内分泌部是散在于外分泌部之间的细胞团，称胰岛，它分泌 的激素进入血液或淋巴，主要参与调节碳水化合物的代谢。 l 、外分泌部 外分泌部为浆液性复管泡状腺。小叶间结缔组织中有导管、血管、淋巴管和神 经。 1 1 腺泡 腺细胞呈锥体形，细胞底部位于基膜上，基膜与腺细胞之间无肌上皮细胞。腺细 胞具有合成蛋白质的结构特点，基部胞质内含有丰富的粗面内质网和核糖体，故在h e 切片上，此处胞质呈嗜碱性。细胞核圆形，位近基底部。细胞合成的蛋白质( 酶的前 体) ，经高尔基复合体组装于分泌颗粒( 酶原颗粒) 内。颗粒聚集于细胞顶部，其数 量因细胞功能状态不同而异，饥饿时细胞内分泌颗粒增多；进食后细胞释放分泌物， 颗粒减少。 胰腺腺泡腔面还可见一些较小的扁平或立方形细胞，称泡心细胞( c e n 打o a c i n a r c e l l ) ，细胞质染色淡，核圆形或卵圆形。泡心细胞是延伸入腺泡腔内的闰管上皮细胞 1 2 导管 腺泡以泡心细胞与闰管相连，胰腺的闰管长，无纹状管，闰管逐渐汇合形成小叶 内导管。小叶内导管在小叶间结缔组织内汇合成小叶间导管，后者再汇合成一条主导 管，贯穿胰腺全长，在胰头部与胆总管汇合，开口于十二指肠乳头。闰管腔小，为单 层扁平或立方上皮，细胞结构与泡心细胞相同。从小叶内导管至主导管，管腔渐增 大，单层立方皮逐渐变为单层柱状，主导管为单层高柱状上皮，上皮内可见杯状细 胞。 1 3 胰液 胰液为碱性液体，n a + 、r 、c a ”、m g ”、 高，胰液中的多种消化酶由腺泡细胞分泌， h c o 一。、h p o t ”等，其中以碳酸氢盐含量最 如胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、多肽酶、胰淀 粉酶、胰脂肪酶、胆固醇脂酶、d n a 酶、r n a 酶等，它们分别消化食物中的各种营养成 1 分。艨逡绥缒分泌戆酶骞楚是以懿滚形式撵爨，懿姨缀童酶缀秘骧糜蛋巍酶原，它们 排入小肠后被肠肽酶激活成为有滔性酶。腺细胞还分泌一种胰鬣自酶抑制因子，熊防 止胰缀自酶原谯胰腺内致活，若这种内在机制失调或某些致病因素使胰激自酶原农胰 藤良激活，霹羧胰腺缰缀分簿破嚣，导致惫後获豫炎。 胰腺的分泌受神经和体液的调节。交感和副交感神经随血篱进入胰腺，其末梢分 布予骤泡，副交感享串经兴奁促进胰酶分泌，交感神经兴奋使分泌减少。溜化管内分泌 细胞分泌的菜魑激素也参与对胰腺分泌的调节，如偶胰液素主黉作用于小导管上皮细 胞，使其分泌大量水和碳酸氢盐，胰液量增多：胆囊收缩素一促胰酶素可促进腺泡细 爨分泌大量溪豫骜，毽黢滚量不壤多；黉泌豢瞧有程遴簇酶分泌 乍蠲。 2 内分泌部 获鑫是蠢凌分泌露藏缰盛兹缀憝鋈，分蠢予藤浚之阉。袋久获藤懿珀0 万个胰 岛，约占胰腺体积的1 5 左右，胰尾部的胰岛较多。胰岛大小不一，小的仅由1 0 多个 细胞组成，大的有数百个细胞，墩可见单个细胞散在于腺泡之闼，胰岛绷胞呈团索状 分布，细胞间有丰富酶有孔型毛缃血管，绷胞释放激索入血。入蔟岛主要有a 、b 、 d 、p p 四种细胞，某些动物的胰岛内还有d 1 细胞、c 细胞等，细胞之间有紧密连接和 缝激逡接。雕染色凌冀中不曩嚣分蛋耱缀藏，一些特殊染色法可显示a 、转、d 三秽 细胞。近年多用电镜和免疫细胞化学法区分和研究胰岛各种细胞。 2 1a 细胞 a 缀藏缝占获岛缀瓣慧数酶2 0 ，维稳律积较大，多分毒在簇螽嗣戆部( 鹜1 3 7 ) 。电镜下可见a 细胞内的分泌颗粒较大，呈圆形城卵圆形，颗粒内的致密核芯常偏 于一铡，貘与孩芯之闻在可见一掰月形的螺榉间隙，斑含密度较低的无定形物( 图1 3 8 ) 。a 细魏分泌高瓶糖素( g l u c a g o n ) ，馥又称高您糖素缩臌。高盘瓣是小分子多 肽，它的作用是促进肝细胞内的糖原分解为葡萄糖，并抑制糖原合成，故使血糖升 蹇。 2 2b 细胞 b 细胞数爨较多，约占胰岛细胞总数的7 0 ，主要位于胰岛的中央部。b 细胞内 静分泌颗粒大小不一，其结擒因麓锡晕孛，羁舔舜，久帮鬣等斡b 缩腿鞭粒内常觅杼获或 不规则形晶状致密核芯，核芯与膜之间肖较宽的清亮间隙。b 细胞分泌胰鹩素 ( i n s u | i n ) ，投又穆胰麓索细照。艨岛素是含5 1 个氨基酸兹多肽，主要作耀是促遴缨 胞吸收血液内的葡萄糖作为细胞代谢的主甏能量来源，闷时也健进肝细臌将葡萄糖合 成糖原或转化为脂肪。故胰岛索的作用与高舡糖索栩反，可使舷糖降低。这两种激索 兹携嚣箨爱，馊盘糖求平操持稳定。羞簇纛素夔佟瘸与毫蛊蛰素穗反，可蕊盔耱降 低。这两种激豢的协同作用，使m 糖水平保持稳定。若胰岛发生病变，b 细胞退化， 胰岛索分泌不足，可致瓶糖升高，并从尿中摊出，即为糖尿病。胰岛b 细胞肿瘤或细 胞功麓亢进，巅胰岛素分泌过多，可导致祗藏耱疰。 2 2 3d 细胞 d 细胞数量少，约占胰岛细胞总数的5 ，d 细胞散在于a 、b 细胞之间，并与 a 、b 细胞紧密相贴细胞间有缝隙连接。d 细胞内的分泌颗粒较大，圆形或卵圆形，内 容物呈细颗粒状，电子密度低。d 细胞分泌生长抑素( s o m a t o s 诅t i n ) ，它以旁分泌方 式或经缝隙连接直接作用于邻近的a 细胞、b 细胞或p p 细胞，抑制这些细胞的分泌功 能。生长抑素也可进入血循环对其他细胞功能起调节作用。 2 4p p 细胞 p p 细胞数量很少，除存在于胰岛内，还可见于外分泌部的导管上皮内及腺泡细胞 间，胞质内也有分泌颗粒。p p 细胞分泌胰多肽( p a l l c r e a t i cp 0 1 y p e p t i d e ) ，它有抑制胃 肠运动和胰液分泌以及胆囊收缩的作用。 除以上几种细胞外，某些动物的胰岛内还发现有分泌血管活性肠肽( v i p ) 的d ， 细胞，分泌胃泌素的g 细胞。有的低等脊椎动物胰岛内还存在一种无分泌颗粒的细 胞，称为c 细胞，它是一种未分化细胞，可分化为a 、b 、d 等细胞。胰岛细胞中除b 细胞外，其他几种细胞也见于胃肠粘膜内，它们的结构也相似，都合成和分泌肽类或 胺类物质，故认为胰岛细胞也属a p u d 系统( a r n j n ep r e c l l r s o ru p t a k ea n d d e c a r b o x y l a t i o n ) ，并将胃、肠、胰这些性质类似的内分泌细胞归纳称为胃肠胰内分泌 系统( g a s t r o - e n t e r o - p a n c r e a t i ce n d o c r i n es y s t e m ) ，简称g e p 系统。 胰岛内分泌功能也受神经系统的调节，胰岛内可见交感和副交感神经末梢。交感 神经兴奋，促进a 细胞分泌，使血糖升高；副交感神经兴奋，促使b 细胞分泌，使血 糖降低。i i 叫 ( 二) 、胰腺的发育过程 胰腺的发生发育是一个复杂的、高度协调的过程。胰腺由内胚层发育而来，它的 发生起源于两个原基，即背胰芽和腹胰芽。背、腹两个胰芽的上皮细胞不断增生并反 复分支，其末端形成腺泡，与腺泡相连的各级分支形成各级导管，于是背、腹两个胰 芽分化成了背胰( d o r s a lp a n c r e a s ) 和腹胰( v e n 廿a 1p a n c r e a s ) 。在背胰和腹胰的中轴线 上均有一条贯穿腺体全长的总导管，分别称为背胰管和腹胰管。由于胃和十二指肠方 位的变化和肠壁的不均等生长，致使腹胰和腹胰管的开口转至背侧，并与背胰融合， 就形成一个单一的胰腺【。1 9 7 2 年，p i c t e t 和r u t t e r 等人提出了胰腺发育二级变化模型 ( t w om 句o r 订a 1 1 s i t i o n ) 叫( 如图1 ) 。小鼠胚胎期8 0 8 5 天( e 8 o - 8 5 ) 时，原肠前 肠上的某些细胞将发育成胰腺和肝的命运即被决定【l2 ”j ，这标志着胰腺发育初级变化 ( p 血n a r ) rt 啪s i t i o n ) 的开始。近年的研究发现，由于分别发育成背胰芽和腹胰芽的前 肠上皮细胞受到的调节信号不同，二者并非同时出现，但它们的发育过程是一样的 “。小鼠胚胎期9 5 天，前肠末端背侧的内胚层上皮细胞增生，形成背胰芽。约 e 1 0 2 5 天，腹胰芽由背胰芽对侧的上皮增生而成，位置稍低，体积略小。背、腹两个 胰芽的上皮细胞不断增生并形成外瑚结构，这一结构与将发育成十二指肠的肠管壁是 垂直的，此时上皮细胞璧多层分布且核质比高，而成熟的胰腺导管上皮细胞楚单层 的。层层堆积的胰腺上皮细胞受其周围廊充质细胞传递的信号的指导，开始了形态上 的分支变化。e 1 2 5 天时，可良躐察到具有明显缎织特征的腺泡和导管。迄今为止，还 没有确切的实验数据揭示这些增髓的胰腺内胚层细胞发商为导管的命运是如何被决定 的，以及辱管发黛的详缅枫箭是戆样的 l 瓢。内分泌部的教育开始得很早。超裙，大多 数内分泌细胞同时分泌几种激素，e 9 5 天左右便能在胚胎中检测到同时含有胰商血糖 素和胰岛索静缅耱，镭愆数量在之后酶2 3 天肉不断堙鸯拜，含生役撺素帮获多敖黪缁憨 则出现较腕陋”j 。e 1 3 5 天至e 1 5 5 天，是胰腺发育次级变化( s e c o n dt r a n s i 廿o n ) 阶 蔽，获藤器绍魏萋鞋舞努泌鄱齐始避行终极分 乏，缁庭数攫激增，旎疼蛋篷含量瓣离了 1 0 0 1 0 0 0 倍，同时散在分布于导管之间的内分泌细胞逐渐聚集成簇【l 引。次级分化之 爱，舞分泌缀胞大量增臻，内分泌缨您懿骞丝分旋活动 一分活疑，势逶遂迂移袋集残 团，这个时期被称为胰岛发生( 1 s l e t o g c n e s i s ) 【1 4 j 。e 1 8 5 天时，已经能够看到类似于 戒傣孛匏戏熬簇鹞蘩兹h 秘。壤骧瓣发育受劐多穆售号逶糖豹共骥调节，送寒数磷突发 现f g f ( f i b r o b l a s tg r o w t hf k t o r ) 、v e g f ( v a s c u l a re n d o m e l i a l 舯w mf ；糙t o r ) 、t g f - 瑟、b d g e 孙g 一磬p e 堍锺d s 镣多秘僖号转导邋路参与调控了这个复杂戆过程【1 4 j 。 二、t g f - 8 及其受体结构与信号通路 ( 一) t g 私器及冀受棼结构 t g f d 是一种多功能的多肤搽细胞因子，发现于2 0 年前，首先由a s s o i a n 等在1 9 8 3 年囊人血小扳中成功提取，已被谈实在细胞的生长调节中起重要作用。t 娜8 是静由 二硫键连接，分子量约为2 5 k d 的多肽二聚体，每个单位由1 1 2 个甄基酸组成，其中9 个高 度保守的拳髓氨黢残基，遁过二硫键形成半溉氨酸的刚性结构，t g f 一8 具有耐酸、碱、 热和耐交性的特傲。在脊椎动物中，t g f p 超家族包括t 1 3 f p 、活化素( a c t i v i n ) 、曹 形成蛋囱( b o n em o i p h o g e n e 氐p r o t e i n s ，b m p ) 、生长分化因子( g r o 州ha i l d d i 脯r e n t i a f i o n 蠡e 袖r s ，g d f ) 等l 塌。在哺乳动物中融相继充隆蹬t i g n p l 、g f p 2 、粥f i b 3 三种皿单位，由不同的糖因编粥，编码基因分别定位予1 9 、1 、1 4 号染色体上具有高 渡的( 6 0 8 0 ) 丽源静竣替酸亭戮，其中，对t g l 的研究最为深入耱活跃。t g f 一 种属阃亦肖明显的序列同源性( 9 6 5 ) ，提示其介导独特的、保守的生理过程【5 引。 t g f ，受体玮您c e p 瞬，邵瓣蔻罩g 瑟缡施貘表巍高亲秘力结合溪自，掰标记 分析法鉴定并命稻了三种t ! r 的豫型：t p r i 、t b r - i i 、t d r - i i i ，其中，对t p i u i 的研究 最为丰富。善r - l 、t 辩l l 瓣震丝鬣酸穗芬氨酸激终受体黎族，甥为跨蔟蕤蛋鑫。 多r i i 的分子量为5 3 k d ，由四部分组成：2 2 个氨基酸组成信号肽、1 0 1 个氨基酸组成亲水 懿缨瑰势送、2 3 令氨基酸缝藏跨貘区和3 s 5 个氨鍪骏缀裁缨疆蠹逸。t 8 r - 粒分子量为 7 5 k d ，由5 6 7 个氨基酸组成：2 3 个氨基酸组成信号肽、1 3 6 个氨旗酸组成亲水的细胞外 送、3 0 个氨基酸缀藏跨羧区积3 7 8 个氨纂酸组成缨骢痰嚣。t 8 孙i 与t 8 r * i 豹不阕之处 夜于：t b r i 细胞内区商由激酶赋和激酶区前近膜处富含丝氨酸苏氨酸的的特征性结 4 构g s 区，t d 艮i i 细胞内区有由2 2 个氨基酸组成的富含丝氨酸苏氨酸的短尾。t p r - i i 的胞内区高度保守，有许多自身磷酸化的位点，具有自身磷酸化的功能。t p r _ i i i 是细胞 膜表面分布数量最多的一种分子量为2 8 0 3 3 0 k d 的大跨膜蛋白，由信号肽、7 5 2 个氨 基酸组成的细胞外区、跨膜区、4 1 个氨基酸组成的短的细胞内区组成，胞内区高度保 守，4 2 为丝氨酸和苏氨酸，可能作为胞内激酶的底物。 ( 二) t g f b 信号通路与胰腺发育 1 1 g f b 的信号通路 t g f 。b 无论是通过自分泌途径还是旁分泌途径，都要与邛r 结合才能发挥作用。 目前，有关该信号通路在转录因子s m a d s ( m o t l c ra g a i n s td p p ) 介导下参与众多生命活 动，如细胞增殖凋亡、分化迁移、胚胎发育，血管系统形成、机体内环境平衡的维持 等的报道层出不穷【1 9 - 3 0 】。对t g f p 的信号通路中细胞表面的t p r 激活、s m a d 转录复 合物的形成和s m a d 转录复合物的作用机制已基本清楚( 如图2 ) 。t g f b 的信号传导 有赖于t p r - i 与t p r 的共同存在，t p r - i i 可以不依赖t p r i 而与t g f p 结合，但需 要t p r _ i 向下游传递信号。t p r - i i i 不直接参与信号的传递，主要是调节t g f - p 与信号受 体的结合。t g f p 首先与t 限一i i 结合，t g f p 的构像会发生改变，易被t p r _ i 识别而形 成t p r - 1 1 _ t g f p - t p r _ i 复合物，t p r i i 磷酸化t p r - i 上的g s 区，t p r _ i 磷酸化是信号 传导的关键步骤，活化的t b r i 进而特异性地识别和磷酸化受体调节性s m a d 蛋白。 s m a d 蛋白有由s m a d 基因编码的分子量为4 2 6 0 k d 的蛋白分子，是t g f b 受体复合 物的下游信号调节蛋白，存在于细胞浆中，可将信号由胞膜直接传导至胞核。目前，在哺 乳动物中已发现8 种s m a d 蛋白，从结构和功能上，分为3 个亚型：受体调节s m a d ( r s m a d ) ，包括s m a d l 、2 、3 、5 、8 ，作为t b 激酶的底物，活化后入核，调节特异基因 的表达；共同介导的s m a d ( c o s m a d ) 是s m a d 4 ，能与r - s m a d 相互作用，形成异聚体； 抑制性s m a d ( i s m a d ) ，包括s m a d 6 、7 ，对r s m a d 和c 伊s m a d 介导的基因表达具有 抑制作用。s m a d 家族有高度保守n 末端和c 末端，即n h l 区和n h 2 区。s m a d 激活受 体产生的磷酸化发生在所有s m a d 成员均具有的c 末端的s x s 结构。在细胞浆中存在 着一种膜结合蛋白s a r a ( s m a da 1 1 c h o rf o rr e c e p t o ra c t i v a t i o n ) ，与s m a d 2 和s m a d 3 结合 而使s m a d 2 和s m a d 3 保留在细胞浆中。s a r a 使s m a d 表现为活化的t g f b 受体复合 物的底物，同时s m a d 磷酸化过程降低了s m a d 对s a r a 的亲和力。一旦s a s a 释放， s m a d 2 和s m a d 3 可与s m a d 4 相互作用，促进s m a d 2 3 一s m a d 4 复合物的形成。s m a d 4 是 c o s m a d ，对t g f b 无磷酸化反应，不能被单独移至胞核内，但对于大多数s m a d 转录 复合物的形成是必要的。s m a d 2 ，3 ，s m a “复合物可由胞浆移至胞核，此过程由在 s m a d 的c 末端n h 2 区的疏水表面介导，核定位信号确定在s i m d 3 的n 末端n h l 区， s m a d 2 3 s m a d 4 复合物可根据目的基因形成异二聚体或异三聚体。在细胞核中，激活的 s m a d 复合物可利用一些s m a d 同家族序列c a g a c 拷贝直接识别目的基因而调节基因 的转录。t g f b 的信号传导绝大部分是通过s m a d 蛋白的表达实现的，此外，该信号通 路还能影响一些非s m a d s 依赖性的信号通路，t g f b 已被证实在不同细胞系中可激活 瞧步 鬣号璃节激簿e r k 1 ，e 登x 2 ，p 3 8 或e ，麸瓣姿 基寒溃墩酶派) 存墼分袈激滔蛋巍 激酶( m a p k ) 而究成信号传导【2 83 1 】。目前，t g f b 激活这些激酶的确切方式尚不完全清 楚。傣号通路之间的相互关联可能加强了s m a d s 介导的t g f b 信号通路，还可能影响 了菲s m s 莜赖往靛蓓号传递律震。嚣露，这释稽互关联遣谴t 琵藩一信号道路蕊臻耱 变得舜常强大，在几乎所有器官的发育和功能调节中，在众多痰病的致瘸机理中，都 发挥麓复杂嚣爨援救作嗣c 2 2 0 0 3 2 3 列。 2 t g f 。b 信号通路与胰腺发育 联兹已经煮缀多文献擐道，蜀0 f 一透鼹跫类十分耋要麴黢艨缨强发鸯强功戆瓣 调节因子，与胰腺发育过程的调控密切相关；在胰腺痰病中，该通路通常会由于基豳 突变或蛋白表达异常而失滔【3 4 训】。逡今，相关文献报道主要包括以下几方灏： 2 1t g f b 超家族成员腻腺中的表逖 邋年来，人们陆续发现了t g 节。班超家族成员及摆瘟受体，t g f p 配俸拮抗因子 f o l l i s 诹t i n 、n o g g i 撞、g r e m l i n 等在腹袋上度缀臆、闻充痿缁胞以及成体胰豫审育表达嘎 y 锄a n a k ay 等人通过免疫组织化学和原位杂交检测了t g f p 1 ，r g f p 2 ，t g f p 3 在人 类获藏中蕊表达，结果显示它翻在簇骤导管、豫逸帮虑分泌缨熬中均有不怒程度的表 达，蕻中t g f ，p l 主要袭达于胰腺外分泌部，t g f p 2 、t g f p 3 主要表达于内分泌维 胞，其中大多数是分泌i n s u l i n 的绷胞；此外，三者均表达于胰腺导管。由此他们推 繇，j 谤一叠l 、善g f 。罄、彳疆努爵麓在获簇中逶避蠡分泌( 渊| o e 豳e ) 零l 旁分泌 ( p 鲫a c r i n e ) 的方式实现典作用的黢挥，丽三者表达方式的差异可能预示箫它们对胰腺 内外分泌部发育调控 乍属的不同l 川。此外，c d s e r ac a 等人发现t 8 艮i i 农c d 1 小鼠 e 1 2 。5 天，e 1 5 。5 天，e 1 8 5 天胰腺静管上皮缩臆中有显藩表达，在腺泡帮海分泌细臆中 有微髓表达。他们推测t b r - i i 可能为成体胰腺导管发育所必需【日1 。 2 2t g f b 超家族成员对胰腺发育的调控 f s a n v i t o 等人在体外实验中旋现t g f ，b l 能抑制小鼠胰腺腺泡生长，并能促进内 分泌帮缨蘧，尤其是含蠢迹繇l i 固t 瓣参缝魏戆发弯，稳 】接溅零鼯- 多l 霹耱在俸疼谖节 了胰腺腺泡和内分泌部发育平衡【5 制。 在静肠上皮细胞向胰腺鲴胞分化的过程中，间充质细胞发捧着重要的作用。研究 发现，发育中的胰腺在去除闯充族细艟后，不能形成辩管和骤泡，僵帮德迸了内分泌 部的发育和分化【4 “”】。科学家们搬测上皮一间充质细胞间的相互作用调节了胰腺内外分 泌帮豹发弯乎稳。夏t g f 零瘩号邋黪对于这搴孛稳互作建起羞重要滟调控擘翔邳5 ”。魑 外，述有研究表明t g f 。b 信号通路负调控了腺泡的生长，但对于维持胰腺外分泌部中 腺泡的分化状态必不可少【3 1 】。 2 3参与胰岛发生过程 6 胰岛发生过程包括了内分泌前体细胞从胰腺导管上皮中的分化，透过基底膜向周 围间充质迁移，各种激素分泌细胞的积聚成簇直至最终形成成熟胰岛很多步骤。在迁 移过程中，内分泌部前体细胞受到m m p s ( m a t r i xm e “l o p r o t e i i l a s e s ) 的控制。旧s 是一类能够降解胞外基质蛋白的酶类大家族，在胰腺发育过程中发现有m m p 2 和 m m p 9 表达，当m m p 的功能被抑制后，分离状态下的胰腺上皮内的胰岛形态发生就 会受到影响。有文献报道t g f 邙信号通路可能调控了胰岛中的m m p s 的活性。在实验 中，m i m l e sf 等人发现外源t g f b 1 正调控胰岛的形态发生和m m p 2 的活性；当 t g f b 特定的拮抗因子存在时，二者均无法实现，这些实验结果表明，t g f p 是胰腺 m m p 2 的关键活化剂，而m m p 2 为胰岛形态发育所必需【5 。 ( 三) 、a l k l 的研究现状 a l k l 基因被定位于1 2 q 1 1 一q 1 4 ，全长约1 4 k b ，由1 0 个外显予构成，其编码a l k - 1 蛋 白。a 1 蛋白是由5 0 3 个氨基酸残基组成的。是l 型丝氨酸苏氨酸激酶受体，其主要 表达在内皮细胞上。1 型丝氨酸苏氨酸激酶受体己鉴定七种，分别称为a l k l 、2 、3 、 4 、5 、6 、7 。 现有研究表明，a l k l 是一种与b t g f 类配体结合的i 型细胞表面受体，它与其 它i 型受体在丝苏氨酸蛋白激酶功能域有很高的同源性，在功能域之前有一个寡含 甘氨酸和丝氨酸区域( 叫g sd o m e 血) ，c 端尾较短。在t g f b 信号通路中，a l k l 能够 与t g f p 1 或t g f p 3 结合，也可与a c t i v i n 结合，在涉及t ( p 的共同信号传递途径 中，a l k l 与e r d 0 9 1 i n 在内皮细胞表面相互作用，在组织中表达量与c n d o l i n 平行在内 皮细胞和血管丰富的组织表达高，通过活化s m a d l ，s m a d 5 ，可能还有s m a d 8 ，进行 信号传递m 。“。 现有文献报道a l k l 主要表达于内皮细胞，参与调控血管发生与发育形成过程， 目前关于它的研究集中在其与遗传性出血性毛细血管扩张症( h e r e d i t a r yh e m o h a g i c t e l a l l g i e c t a s i a ，删t ，又叫o s l e rw e b e rr e n d u ) 的相关性上【4 ”。至今尚无关于它在胰 腺细胞中表达的任何报道。 三、免疫组织化学技术简介 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学，应用免疫学原理，通过抗 原与抗体的特异性结合，显示组织内和细胞内的抗体或抗原成份。这种检测技术的特 异性强、灵敏度高、应用广泛，是生物学和医学领域中的重要研究手段。通常需对已 知抗原或抗体进行标记，用相应的显色和观察方法检测目的抗体或抗原。常用的标记 物有荧光素、铁蛋白、辣根过氧化物酶等。 免疫组织化学技术自它问世以来发展迅猛，用“日新月异”一词形容它毫不过分。 酶标免疫组织化学技术是由n a k a n e 等人于6 0 年代末期创立的最早的免疫酶组 7 织化学技术，之后s t e r n b e r g e r 等人于7 0 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶 法( 又称间接法) 和p a p 法( 过氧化酶抗过氧化酶法) 。8 0 年代初期美籍华人h s u 又建 立了卵白素生物素复合物法( a b c 法) ，自此之后，免疫金银染色法、免疫电镜等技术相 继问世。8 0 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白( 或译成链霉菌亲合素，s t r e p t a v i d i n ) 与生物素结合力极强，遂用它标记过氧化酶建立起了s p 法，或称l s a b 法 ( 链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素 起非特异性结合反应，故背景染色更加清晰，且敏感性比a b c 法高4 8 倍，比p a p 法高 8 1 6 倍。进入9 0 年代，免疫组织化学又向基因水平深入发展，与分子生物学技术的结 合日益紧密。如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术，因而 又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。有人做过这样一个统计，7 0 年代利用免疫组 织化学技术的科研论文全世界范围内每年不超过1 0 篇，而今每年已超过1 万篇。下面 对这项技术的发展作概述： 1 利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质，并可利用荧 光定量技术计算抗原( 或抗体) 的含量，以达到对定性、定位、定量测定的目的 2 抗生物素一生物素一过氧化酶复合物技术( av i d i nbi o ti n2 p e r o x i d a s ec o p l e xt e c h n i q u e ，简称a b c 技术) 是hs u 等于1 9 8 1 年创立，其特点是利用抗生物素分 别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶 2 。该方法简便、节约时间，敏感 性、特异性高，背景染色淡。由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力， 可用于双重或多重免疫染色。 3 葡萄球菌蛋白a ( s t a p h y l o c o c a lpr ot e i na ，s p a 或s p ) 具有免疫特性，发展成 为免疫学上一种极为有用的工具。其优点是不受种属特异性的限制，染色时间短、灵 敏性高和背景染色淡等。故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用 4 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法( 简称ap a ap 法) 克服了辣根过氧化酶( h r p ) 的不 足。链霉素亲和素( s tr e pt a v i d i n ，s a ) 具有高度的亲和力，利用生物素结合