（微生物学专业论文）高羊茅内生真菌的分离、鉴定及其生物防治的初步研究.pdf

四川大学硕士学位论变 中文摘要： 高羊茅内生真菌的分离、鉴定及其生物防治的初步 研究 研究生张晓娟 微生物学专业 导师乔代蓉副教授 禾草内生真菌在寄主体内渡过全部或几乎全部生活周期而不表现任何症 状，与宿主互惠互利，提高宿主对生物胁迫( 抗虫、抗菌等) 和非生物胁迫 抗性的能力，使得共生体系具有较强的竞争力。禾草内生真菌产生丰富多样 的次生代谢产物，具有多种生物活性，对害虫和植物病原菌起到抑制和灭杀 作用，这些优良特征能够使内生真菌有望成为生物农药。因此对禾草内生真 菌在植物病害生物防治方面的研究不但具有经济价值和生态学意义，还有现 实的理论意义。 本文从高羊茅交战的植物组织中分离内生真菌，利用形态学和分子生 物学的方法对之鉴定，筛选内生真菌抑菌谱，并对抑菌机理做了研究，试验 结果如下： 1 高羊茅内生真菌的分离与鉴定 采用苯胺兰染色法检测多年生黑麦草和高羊茅部分商业品种的种子，高 羊茅交战1 1 种子的内生真菌感染率最商，达到7 3 。 用组织捣碎的固液分离法从高羊茅交战i i 植株分离得到6 株白色菌株， 通过组织印迹以及孢子灭活试验证明所分离的菌株为内生的。 从形态学和分子生物学两方面鉴定6 株内生真菌。6 株真菌按形态划分为 2 个菌群，菌l ( j 2 1 、j 2 2 、j 2 5 、j 2 6 ) 电镜扫描观察孢子形状为肾形，长约 6 4 1 0 p - m ，分_ r7 卜物学鉴定采用a p p c r 的方法，在0 7 ，0 9 ，2 1k b 左右i b 现条带。菌1 1 ( j 2 3 、j 2 4 ) 电镜十f 描观察分生孢子形状为长卵形，4 i - - 7 2 网川大学硕十学位论文 1 2 1 5 m ，分子鉴定采用1 8 s r d n a 法，进行系统发育分析。 综合形态学和分子生物学鉴定结果，菌i 为禾草内生真菌的优势菌株 n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m ，菌与a c r e m o n i u ma l t e r n a t u m 有非常高的相似 性。本文首次从高羊茅株中分离得到a c r e m o n i u ma l t e r n a t u m ，a c r e m o n i u m a l t e r n a t u m - - e a r u n d i n a c e 是一种新的稳定的共生体系，这对于研究禾草及其 内生真菌的共生体系提供了宝贵的资料。 2 6 株内生真菌的生物学特征 对6 株内生真菌利用碳源的能力做了初步研究，结果表明6 株菌可以利 用果糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖，麦芽糖、乳糖等碳源m s 改良培 养基，生长良好。 牛奶石蕊试验菌落周围无明显的透明圈，说明分离的内生真菌不具备水 解蛋白的能力 3 内生真菌抑菌谱试验 抑菌谱的筛选发现6 株内生真菌对核盘菌( s c l e r o t i n ms c l e r o t i o r u m ) 、番 茄灰霉病原菌( b o t r y t 缸c n e r e a ) 、番茄晚疫病原菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n b ) 等植物致病菌有一定的抑制作用。其中j 2 4 对核盘菌抗性较为明显，与核盘 菌之间有明显的拮抗带，宽为1 3 r a m ，可以作为潜在的生防菌深入研究。 4 j 2 4 对核盘菌抗性的初步研究 采用玻璃纸条法研究j 2 4 寄生能力，j 2 4 不是核盘菌的寄生菌。 j 2 4 难挥发性代谢产物的抑菌作用的研究( 采用圆盘滤膜法) ，发现可以 抑制核盅菌菌丝生长，抑制率达到6 9 ：平板上形成菌核的重量减少率为4 9 7 ，菌核萌发率为6 9 2 。 卜述研究表明j 2 4 对核盘菌的生物拮抗的机理不足通过重寄生破坏菌丝， 而足次级代谢产物的存在产生作用。j 2 4 有望成为核盘萄的生防菌。 5 j 2 4 活性物质发酵条件的优化：从不同的仞始，m 温度、转速、装液 2 四川大学硕士学位论文 量、接种量5 方面优化培养条件为：温度2 8 * ( 2 ，转速2 0 0 r p m ，初始p h 6 ，接 种量1 0 ，装液量3 0 。 关键词：高羊茅，内生真菌，鉴定，核盘菌，生物防治 j 目 i + 英文摘要： i s o l a t i o na n di d e n t i 矗c a t i o no fa n t i m i c r i o b i a l e n d o p h y t i cf u n g ia s s o c i a t i e dw i t ht a l lf e s c u ea n d t h e r o l eo n b i o l o g i c a lc o n t r o l g r a d u a t es t u d e n t z h a n g x i a o j n a i l t u t o r q i a o d a i r o n g e n d o p h y t i cf u n g u ss h a r et h ep r o p e r t yo fl o n g - t e r m ，l a r g e l ya s y m p t o m a t i c a s s o c i a t i o n sw i t hh o s tp l a n t s f u n g a ls y m b i o n t so fr e l a t e dg e n e r ae p i c h l o ga n d n e o 砂p h o d m ma r es y m b i o n t so fm a n yc o o s e a s o ng r a s s e st ow h i c ht h e yp r o v i d ea v a r i e t yo ff i t n e s se n h a n c e m e n t ss u c ha si n c r e a s e dr e s i s t a n c et ob i o t i cs t r e s s e s w e c a ni m p r o v et u f f - g r a s s e sb ys t u d y i n ge n d o p h t i cf u n g i e n d o p h y t e - i n f e c t e dg r a s s e s c a np r o d u c ec h e m i c a l sw h i c ha r et o x i co rd e t e r r e n tt oi n s e c t sa n df u n d d i s e a s e s o t h e y a r ee x p e c t e dt ob ep o t e n t i a l b i o l o g i c a lp e s t i c i d e w i t h t h e d e v e l o p m e n to ft h em o l e c u l a rt e c h n o l o g y , t h em e t h o do fm o l e c u l a rc a nb eu s e dt o i d e n t i f ye n d o p h y t i cf u n g i r e r e s e a r c ho nt h ea n t i m i c r o b ee n d o p h y t e sn o to n l y b r i n g sv a s te c o n o m i cp r o f i t sb u ta l s oh a sr e a l i s t i ct h e o r e t i cs i g n i f i c a n c e i nt h i s s c i e n t i f i cd i s s e r t a t i o n , s o m et a l lf e s t u ec r o s s f i r e l lw e r ec h o s e na st h em a t e r i a l sf o r s e p a r a t i o no fe n d o p h y t e s 3 2 4 ，o n eo fp r o d u c e da n t i f u n g u se n d o p h y t e si s o l a t e d f r o mt a l lf a s c u e ，w a si n d e n t i f i e db yp h y s i o l o g i c a la n d1 8 s r d n at e c h n i q u e s t h e r e s u d sw e r ea sf o i l o w s 1 b yt i s s u es u r f a c e s t e r i l i z e d ，6s t r a i n se n d o p h y t e si s o l a t e df r o mt h et i s s u e s o ft a l lr e s c u e i d e n t i f i e do fe n d o p h y t i cf u n g u s b a s e do nt h em o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r sa n da p - - p c r 、1 8 s r d n a ，j 2 1 、j 2 2 、j 2 5 、j 2 6 w e r ei d e n t i f i e da s n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m ，j 2 3 a n dj 2 4w e r ei d e n t i f i e da sa c r e m o n i u m 4 j 、 l 婴型查兰塑主兰竺丝苎 口l t e r n a t u m t h i sn e w l yf o u n de a r u n d i n a c e a - a a l t e r n a t u mc o m b i n a t i o ns h o u l d b e ag o o de x a m p l et oi n v e s t i g a t ee n d o p h y t e h o s t i n t e r a c t i o n p l a n t s a n dt h e i r e n d o p h y t i cf u n g i 2 e n d o p h y t i cf u n g u s c a ng r o wo nm s w h i c hi n c l u d ef r u c t o s e ( o rx y l o s e 、 g l u c o s e 、s u c r o g g 、m a l t o s e 、l a c t o s e ) 3 b ya n t i m i c r o o r g a n i s ma s s a y , w i d e s p e c t r u ma n t i b i o t i c sp r o d u c e db y i s o l a t e j 2 4w e r es t r o n ge f f e c t sa g a i n s ts u c ha sb o t r y t i sc i n e r e aa n dw e r eg o o de f f e c t s a g a i n s tt h ep h y t o p a t h o g e ns u c ha s s c l e r o t i n i as c l e r o a o r u m 4 d u a lc u l t u r a la s s a yo np o t a t od e x t r o s ea g a rr e v e a l e dt h a tj 2 4w a s a n t a g o n i s t i ct o s c l e r o t i n i as c l e r o t i o m m i t sn o n - v o l a t i l em e t a b o l i t e ss u p p r e s s e d m y c e l i a lg r o w t ho fs s c l e r o t i o r u m a n dd e c r e a s e db i o m a s so fs c l e r o t i ap r o d u c e d o nt h ep l a t e s a n di t sv o l a t i l em e t a b o l i t e sc a na l s os u p p r e s s e dg e r m i n a t i o no f s c l e r o t i a l 5 t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yh o w e v e rw a sa f f e c t e db yd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nb yj 2 4 t h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n si ns h a k i n gf l a s kw e r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e2 8 c ，t h er o t a t i o nr a t e w a s2 0 0r p m 。p h6 , c u l t u r em e d i u m3 0m l i n1 0 0m lf l a s li n o c u l a ns i z e 1 0 t h e s ef e a t u r em i g h tb eb e n e f i c i a lf o rf u r t h e rd e v e l o p m e n ti na p p l i c a t i o na sa b i o c o n t r o la g e n t k e y w o r d s ：t a l lr e s c u e 。e n d o p h y t i cf u n g i ，i d e n t i f i c a t i o n ，s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ， b i o c o n t r o l 5 家畜中毒，因此禾草内生真菌引起越来越多学者的关注。目前研究重点在利 用内生真菌双重特性中有益的一面，如将内生真菌人工侵染禾草，培育含有 内生真菌但对家畜无毒的抗逆性牧草和适应性广的草坪草品种。 内生真菌可以产生丰富的次生代谢产物，可能成为生物防治中有潜力的 微生物农药。j fw h i t e 等人在平板上做了抑菌试验，n c o e n o p h i a l u m 对 a l t e r n a r i aa l t e r n a t e 、c l a d o s p o r i u mc l a d o s p o r i o i d e s 、r h i z o c t o n i ac e r e a l i s 等有 抗性1 6 1 。b l a n k 和g w i n n 等人分别研究了温室条件下苇状羊茅内生真菌 n e o t y p h o d i u m c o e n o p h i a l u m 对高羊茅苗病的作用，他们发现感染有内生真菌的 阳性苗成活率显著提高，出苗率与内生真菌带菌率显著正相关1 7 a l 。w e s t 与 w e l t y 等人分别研究了温室和田间条件下内生真菌n c o e n o p h i a l u m 对高羊茅 锈病的影响，感染有内生真菌的阳性苗降低了病害的发生，对病菌有很好的 抗性 g a o i 。此外s c h m i d t 等人研究了内生真菌n u n c i n a t u m 对草地羊茅叶斑病 的影响，在离体叶片试验中对病斑的扩展有一定的作用，禾草内生真菌作为 生防菌大多集中在应用于禾草宿主当中【1 1 l 。 由于传统的真菌鉴定方法依赖于孢子形态的观察，对于那些不能产生孢 子的真菌很难进行鉴定。此外由于培养条件不同，孢子成熟度不一，从而容 易产生一定的偏差，因此传统鉴定的方法受到挑战。随着分子生物学技术的 发展，越来越多的分子技术应用于内生真菌的鉴定以及检测中，如 r a p d p c r 、微卫星标记、r d n a 、r r n a 等。u u 等人用3 0 个不同的随机引 物对n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m 和n e o t y p h o d i u ml o i i 的d n a ，筛选到一条 引物，它可以将两昔区别开，这是一种快速鉴定这2 种菌的方法【1 2 l 。k a t h l e e n 等人利用微卫星杯记这种方便快捷的方法确定植物中是否含有n e o t y p h o d i u m 属或e p i c h l o 享属内生真菌1 u j 。1 9 9 6 年a n t h o n ye g l e n n 等将一些报道的 6 四川大学硕士学位论文 a c r e m o n i u m 属的内生真菌以及其他的a c r e m o n i u m 属的1 8 s r d n a 扩增出来， 做了系统发育进化树的分析，将根据体外培养形态的相似性为基础命名的 e p i c h l o 亭和与之相近的无性禾草内生真菌从a c r e m o n i u m 属划分出来，建立了 n e o t y p h o d i u m 属1 1 4 1 。郭良栋等人利用扩增5 8 s r d n a 和i t s 的扩增，对不能 产生孢子的棕榈树内生真菌进行鉴定，并直接从树叶内检测和鉴定内生真菌 【1 5 1 。分子生物学研究方法对禾草内生真菌的研究中起到十分重要的作用，有 待进一步的发展。 综上所述，禾草内生真菌作为植物病害生物防治的研究以及分子检测和 鉴定的研究成为禾草内生真菌研究的重要领域，为禾草内生真菌在生物防治 方面应用、牧草和草坪草改良及对代谢途径中产毒素的关键酶克隆打下基础， 具有重要的经济价值和理论意义。 本试验对多年生黑麦草和高羊茅的部分商业品种进行了内生真菌感染率 的调查，高羊茅交战的种子中感染率最高，为7 3 。种子内观察存在内生 真菌菌丝，从而可以保证有可能分离得到内生真菌。本文拟从高羊茅交战 植株分离鉴定内生真菌，并对内生真菌的生物学功能做初步研究，希望能够 将内生真菌的应用范围拓展到对植物病害的防治中。 7 四川欠学硕士学位论文 论文： 第一章高羊茅内生真菌的分离、鉴定与生物学特征 禾草内生真菌研究最多的是n e o t y p h o d i u m 幻肼和n e o t y p h o d i u m c o e n o p h i a l u m ，宿主植物分别是多年生黑麦草和高羊茅。其中n e o t y p h o d i u m c o e n o p h i a l u m 由于其产生的毒素引起家畜中毒而备受关注。研究表明感染内 生真菌的n e o t y p h o d i u m 属内生真菌的代谢产物对线虫、阿根廷象甲等有很好 的抗性【1 6 1 ，是潜在的生防菌。 丝状真菌的鉴定主要依靠形态学方法，以菌落质地、形态、生长速度及 孢子大小、形状等为鉴定指标。郭良栋等发现用分子生物学方法鉴定菌株有 时会得到与传统形态学鉴定不同的结果i ”，这表明传统形态学方法由于一些 培养条件的偏差等原因造成鉴定结果不准确，因此为了得到更为精准的结果， 在形态学方法的基础上采用分子方法对内生真菌进行鉴定。 我国对禾草内生真菌研究起步较晚，目前对禾草的研究仅限于抗旱方面 生理变化的研究【1 8 , 1 9 l ，对禾草内生真菌的分离以及特性研究基本处于空白状 态。本章从国外引进的多年生黑麦草和高羊茅的种子出发，部分商业品中种 子内生真菌感染率做统计。从感染率高的高羊茅交战植株出发，对内生真 菌进行分离，对分离的内生真菌从形态学和分子生物学两方面做鉴定，并对 内生真菌利用碳源的能力和水解蛋白的能力进行初步研究。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 植物内生真菌分离材料 牧草种子购自成都种子公司 高擎茅种子：交战( c r o s s f i r e l i ) 、全能( t o t a l ) 、会质科纳多( g o l d ) 、技巧 l l ( f i n e s s e l l ) 、双鹰( d o u b l ee a g l e l 多年生黑麦草种子：夜影( e v e n i n gs h a d e ) 、启蒙( e n l i g h t e n ) 8 四川大学硕士学位论文 1 1 2 培养基 1 ) 固体分离培养基( p d a ) ： 马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，琼脂l o g 。取马铃薯2 0 0 9 切 成小块煮3 0 r a i n ，用纱布过滤取清液，加入葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容 1 0 0 0 m l ，p h 自然，1 2 1 高压灭菌2 0 r a i n 。 2 ) 液体培养基( p d a ) ： 与固体分离培养基配制相同，不加琼脂，分装于1 0 0 m l 三角瓶中 3 ) 斜面培养基： p d a 培养基保存菌种。 4 ) m s 改良培养基： m s 基础盐，1 5 琼脂，1 或者3 糖源( 阿拉伯糖，蔗糖，木糖， 葡萄塘，乳糖等) ，p h 调7 。 5 ) l b 培养液： b a c t o t r y t o n e l o g 、b a c t o y e a s te x t r a c t5 9 、n a c l l o g 、p h 7 0 6 ) 石蕊牛奶琼脂培养基： 脱脂奶粉l o g ，水1 0 0 m l ，1 0 石蕊溶液o 6 5 m l ，琼脂1 5 2 0 ，1 1 6 灭菌1 0 r a i n 。 1 1 3 试剂 1 ) 苯胺兰溶液：苯胺兰0 3 2 5 9 ，水1 0 0 m l ，8 5 , l 酸5 0 m l 。 2 ) 乳酸棉蓝染色液：石炭酸( 结晶酚) 2 0 9 ，乳酸2 0 m l ，甘油，棉蓝0 0 5 9 ，蒸 馏水2 0 m l 。 3 ) 5 氢氧化钠溶液：常规方法配制。 4 ) 1 e 缓冲液：1 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 8 o ) ，l m m o l l e d t a ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 5 ) s t e 缓冲液：t r i s h c l 2 0 m m o l l ，e d t a l o m m o l l ，n a c l l 0 0 m m o l l ， p h 7 5 8 0 。 6 ) r n a 酶：将r n a s e a 以1 0 m g m l 溶于1 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 7 5 ) 和 1 5 m m o l l n a c l 中，1 0 0 。c 的沸水中煮1 5 m i n ，缓慢冷却到室温，分装，一2 0 c 保藏。 9 明川大学硕士学位论文 7 ) 1 0 s d s ：5 9 s d s + 5 0 m l h 2 0 ，常温保存。 8 ) 1 0 x t b e 缓冲液：1 0 8 9 t d s 碱，5 5 9 硼酸，4 0 m l 0 5 m o l l e d t a ( p h 8 o ) ， 加蒸馏水到1 0 0 0 m l ，使用时稀释1 0 倍。 9 ) 乙酸钠3 t o o l l ：将4 0 a g n a a c 3 i - h o 溶于水中，用3 m o l f l 乙酸调节到p h 5 2 ， 补加水至l l 。 1 1 4 试验用试剂盒工具酶 e x t a q 酶和d n a m a r k e r 购自t a k a r a 公司。 胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。 1 1 5 引物的合成 引物合成及测序由i n v i t r o g e n 公司完成。 1 1 6 试验设备 1 4 2 1 1 型高速离心机( 上海医疗器械有限公司手术器械厂) ，培养箱，净 化工作台，电热鼓风干燥箱，电子天平，台式离心机，高压灭菌锅，移液 枪( 量程2 0 0 - 1 0 0 0 9 i n 和4 0 - 2 0 0 9 m ) ，试管，烧杯，平皿，e p 管等若干( 包 括有刻度的试管) ，研钵，电子天平，水浴锅，4 c 冰箱，震荡培养箱，奥 林巴斯光学显微镜，琼脂糖水平电泳仪，凝胶成像系统等。 1 2 方法： 1 2 i 内生真菌的检测 将多年生黑麦草和高羊茅种子的每个品种中随机选出1 0 0 粒，采用l a t c h 等人的方法，用清水清洗干净，5 氡氧化钠浸泡6 8 h ，用自来水冲掉碱液， 将种子移入5 0 m l 烧杯内，加入苯胺蔓溶液，在电炉上加热煮沸3 - 5 m i n ，冷却 后每次取1 粒种子置于载玻片卜，用解剖针移去颖片，用盖玻片轻轻挤压盖 于上面，用吸水纸吸去多余的染掖，胃于光学显微镜下观察，计算感染率1 2 0 l 。 1 2 2 内生真菌的分离 1 0 婴型盔兰堡竺壁丝苎 将高羊茅交战的种子置于用水浸泡的蛭石上，2 5 c 培养【捌。待种子萌 发后将其种植于盛有营养土的直径为1 5 c m 的花盆中，每盆3 - - 5 棵。温室培 养( 1 5 - - 3 0 1 2 ，自然光照射) 。 将培养3 w k 的植株从盆中取出，先用自来水冲洗干净。用7 5 的乙醇处 理8 m i n ，无菌水冲洗3 次，再用2 5 次氯酸钠处理8 m i n ，无菌水洗涤3 次。 将表面消毒好的植株放入无菌研钹中并加入适量无菌水进行研磨，约5 m i n 。 吸取0 5 m l 浆液于加有浓度为1 0 0 z g m l 氨苄青霉素的p d a 培养皿中，均匀 涂布，2 8 c 恒温培养。每天观察1 次。待平板上长出的菌丝后，及时用接种 针挑取真菌尖端菌丝转到新的培养基中纯化，顺序编号纪录。p d a 培养基斜 面4 保存。 1 2 3 表面消毒效果的验证 表面消毒的效果验证用于检测分离到的菌株是否为内生菌，采用2 种方 法来验证。 采用组织印迹法1 2 l 】，把植株按上述相同方法用7 5 l 醇和2 5 次氯酸钠 消毒，置于p d a 固体培养基表面上，5 m i n 后将之移走。平板放于2 8 培养。 将分离得到的菌株孢子制成悬液置于e p 管中，离心弃上清，加入7 5 的乙醇处理8 r a i n ，离心弃上清，加入2 5 次氯酸钠处理8 m i n ，离心弃上清。 将处理好的孢子均匀涂布于p d a 平板上，取1 组未做消毒处理的孢子悬液做 对照，2 8 培养观察。 1 2 4 内生真菌的培养特性 将分离纯化好的内生真菌接种到p d a 琼脂培养基平板以及2 麦芽糖琼 脂培养基上，2 8 培养，观察菌落形态。 1 2 5 内生真菌显微观察和电镜扫描 内生真菌在p d a 上培养2 w k ，对营养菌丝进行观察。挑取营养菌缝，用 乳酸棉兰染色刺进行染色涂片，于光学显微镜下观察。培养5 w k 后对孢子进 行脱察，采取插片法，粘有菌丝的盖玻片从p d a 琼脂培养基平板中取出，用 四川丈学硕士学位论文 乳酸棉兰进行染色，光学显微镜下观察测量孢子大小。对菌丝和孢子载玻片 进行固定脱水处理，电镜扫描。 1 2 6 采用a p p c r 对茵i 进行分子鉴定 i j u 等人用3 0 个不同的随机引物对n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m 和 n e o t y p h o d i u ml o c i 的d n a 进行随机引物的扩增，筛选到1 条引物，它可以将 两者区别开，是一种快速鉴定这两种菌的方法【1 2 1 。为了保证内生真菌鉴定结果 的精准，采用这种简便的方法对j 2 1 、j 2 2 、j 2 5 、j 2 6 这4 种形态学与 n e o t y p h o d i u m c o e n o p h i a l u m 有很高相似度的内生真菌进行鉴定。 1 ) 基因组d n a 的提取： 采用酵母快速提取法提取丝状真菌基因组： 菌1 分别接种到p d a 液体培养基中，2 2 0 r p m 摇床培养大概1 w k 。将菌液 吸取到e p 管中，离心收集菌丝 菌丝重悬于2 0 0 z l b u f f e r 中，加入2 0 0 l 氯仿以及酸处理的玻璃珠，震荡 l o m i n 。 加入2 0 0 【lt eb u f f e r ，震荡，1 , 0 0 0 x g 离心5 m i u ，将上清液转移到一个 新的e p 管中，加入l m l 乙醇，震荡。 1 , 0 0 0 x g 离心5 r a i n ，弃上清液，沉淀重悬于t e 。 加入l m g m l r n a 酶，3 7 。c 温浴5 r a i n ，l 叽i a m o l l 乙酸胺，震荡，1 , 0 0 0 g 离心3 m i n ，弃上清液，沉淀风干，d n a 重悬于1 0 0 # l t e 。 2 ) 提取的基因组用g e n e q u a n t p r o 紫外分光光度计进行d n a 浓度和纯度进行 检测。 3 ) a p p c r 扩增 引物采用l i u 筛选得到的随机引物：5 c c g a g g t g a c g 1 a g t c 觚盯g 唧1 t c ( 3 ) 和 n s 6 ( 5 g c a t c a c a g a c c t g t t a t t g c c t c 3 ) p c r 反应体系如下【1 4 1 ： m g c l 2 钇l 1 0 x e x t a q b u t t e r 5 “l d n t pm i x t u r e ( 各2 5 m m ) 4 a l t a k a r ae xt a q o 5 # l n s l乱l n s 2锄l 3 四j 大学硕士学位论文 d n a d h 2 0 反应条件如下： 9 5 5 4 7 2 9 5 5 4 7 2 7 2 4 5 s ( 每个循环增加3 3 0 s s ) - j 弧，叫。 p c r 产物进行1 0 的琼脂糖凝胶电泳 胶回收产物并连接到载体p m d l 8 - - t 中，送出测序。 3 ) 系统发育分析 1 8 s r d n a 序列通过c l u s t a l x 程序来进行序列间的匹配排序，为了实 现排序最优化，在一些碱基位置进行必要的调整。这些被匹配排序后的数 据，在p h y l i p 3 6 软件中进行邻接法分析。 1 2 8 内生真菌碳源研究【捌 将内生真菌接种到m s 改良培养基中，每4 个重复。用p a r a f i l m 封口， 2 5 恒温培养1 0 d ，测量菌落直径。 1 2 9 内生真菌牛奶石蕊试验 将内生真菌接种到牛奶石蕊培养基中，每4 个重复。用p a r a f i l m 封1 2 1 ， 2 8 恒温培养7 d 观察。 2 结果与分析 2 1 种子内生真菌菌丝的检测 在显微镜下检测种子中内生真菌菌丝结果见图1 1 ，a 图可以在种子淀粉 颗粒问清楚地看到内生真菌的菌丝，b 图中的种f 未感染内生真菌，看不到 1 4 四川大学硕士学位论文 在这些商业品种中都可以检测到内生真菌的菌丝。其中交战的感染率 最高可以达到7 3 ，而全能的感染率最低为8 。种子里的菌丝弯曲并且分支 较少，常存在于种子的糊粉层细胞问，密度较高，与w e l t y 等人观察到的菌 丝形态一致。但是种子中的菌丝不能保证内生真菌是否具有活性。选择感染 率最高的种子交战作为研究对象，进行下一步的内生真菌的分离工作。 a ：显微镜f 观察受感染的禾草种子内生真菌凶丝 四川大学硕十学位论文 b ；显微镜下观察未感染内生真菌的禾草种子 图1 ，禾草种子内生真菌检测 2 2 高羊茅内生真菌的分离培养 将涂布浆液的p d a 平板放于2 8 c 培养。7 1 0 d 陆续出现白色菌落，将 菌落挑出，对之进行纯化、保种待用。分离得到的6 株内生真菌十分相似， 菌落都呈白色，在培养过程中，内生真菌在2 8 c 恒温培养条件下培养2 - 4 w k 可以产生孢子。 2 3 表面消毒验证结果 用滤纸片法测试了升汞、甲醛、酒精和次氯酸钠几种常用的消毒剂，发 现用酒精8 m i n 和次氯酸钠8 m i n 可以彻底除去表面菌。所以在分离过程中采 用这种方法。表面消毒效果的验证可以确定所分离的真菌是否为内生。采用 组织验证法的平板经过培养无菌落长出，此外对于所分离到的真菌孢子进行 灭活试验结果平扳无菌落长出，这衷明用所述方法分离到的真菌并非组织表 面的真菌，证明表面消毒非常有效。 2 4 形态学鉴定结果 根据形态学的不同将6 株菌分为2 个形态群，j 2 1 、j 2 2 、j 2 5 、j 2 6 为菌 i ，j 2 3 、j 2 4 为菌1 1 。菌l 和菌i l 相点足菌落中央突起，不同点在于菌比 1 6 四川大学硕士学位论文 菌i 的生长速率大很多。形态学鉴定参照文献【珏2 4 l 进行。 菌i 在p d a 琼脂培养基中培养。生长速度十分缓慢，2 8 培养4 w k 菌落 直径达到l l m m 。菌落成白色棉状，背面呈褐色，无气味，见图1 2 a 。营养 菌丝透明光滑，见图1 3 a ，电镜观察孢子形状呈肾状，长度为范围在 6 4 - 1 1 0 p m ，与n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m 十分相似，见图1 4 a 。为了进 一步确定，在网页上搜索得到n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m 菌丝和孢子图片 做比较，见图1 3 c ，这与图1 3 a 十分相似。 菌在2 麦芽糖琼脂培养基中培养l o d 菌落直径达到1 5 n u n ，菌落呈白 色粉状，菌落背面呈亮棕色，无气味。随着时间延长，菌落逐渐长大直至长 满整个培养皿，见图1 2 b 。营养菌丝透明，光滑，0 6 - - 1 劬m 宽，见图1 3 b 。 瓶梗从气生菌丝中分生，1 5 2 印m 长，分生孢子长卵形，4 1 7 2 xl 2 - - 1 5 m ，见图1 4 b ，与a c r e m o n i u ma l t e r n a t u m 十分相似。 菌i 在p d a 培养基菌落形态 四川大学硕七学位论文 b 菌在麦芽耱琼脂培养基菌落形态 图1 2 内生真菌的菌落形态 a 菌i 菌丝和分生孢子 b 菌h 菌丝和分生孢子 cn e o t y p h o d i u r a c o e n o p h i a l u m 萄丝和分生孢千( 网啊蚓片) 图1 3 显微镜下观察内生真菌菌丝和分生孢子 1 8 四川i 大学硕士学位论文 a 菌1 分生孢子电镜扫描 b 菌分生孢子电镜扫描 图1 4 电镜扫描观察内生真菌分生孢子( 5 0 0 0 x o 7 ) 2 5a p - p c r 鉴定菌i a p - p c r 扩增方法检测菌i ，发现它们在0 7 ，0 9 ，2 1 k b 处出现条带，见 图1 5 ，与l i u 等人的结果一致。综合形态学鉴定方法，判断菌i 是内生真菌 n e o t y p h o d i u mc o e n o p h i a l u m 。 1 9 佃川大学硕+ 学位论文 霭15 一内生毫菌l p 寸豫结票 k - a k e z - 1 矾“j 2 1 jl a n 2 ij 2 2 1l a n 3 ij 2 5 jl a n 4 , j 2 6 2 61 8 s r d n a 对菌的分子鉴定 2 6 1j 2 3 和j 2 4 基因组d n a 的提取( 酵母快速提取法) 基因组d n a 浓度为7 9 8 z g m l ，2 6 0 n m 2 8 0 n m 为1 8 2 5 ，2 6 0 n m 2 3 0 n m 为 1 9 0 6 ，可以满足下一步p c r 扩增所要求的浓度和纯度。 2 6 2l g s r d n a 的p c r 扩增 参照文献f 1 4 】条件进行1 8 s r d n a 的p c r 扩增，扩增产物电泳检测，得到 约为1 8 0 0 b p 的产物，即为1 8 s r d n a 的序列。结果见图1 6 ，从图的检测电泳 图可以看出，1 8 s r d n a 的扩增效果很好，无非特异性扩增。按照以上扩增条 件扩增1 8 s r d n a ，采用试剂盒进行回收，回收d n a 取m l 进行电泳检测， 见图1 7 ，从图中可以看出来回收的d n a 片段浓度很高，可以直接用来测序。 四川大学硕士学位论文 图1 6 菌h 1 8 s r d n a d n a 序列p c l l 扩增检测 m ：m a r k e r ；l a n l 、1 a n 2 ：j 2 3 ：1 a n 3 、l a n 4 ：1 2 4 图1 7 菌1 8 s r d n a d n a 序列p c r 回收检测 m ：m a r k e r ；l a n hj 2 3 ；l a n 2 ：j 2 4 2 6 31 8 s r d n a 的序列测定 对j 2 3 和j 2 4 菌的1 8 s r d n a 的p c r 回收产物直接送删卞，i l jl n v i t r o g e n 公司完成。测出序列总长为1 7 9 6 b p 。测得j 2 3 和j 2 4 删源r l 为9 9 2 。 四川大学硕士学位论文 3 4 株用于分析，g e n b a n k 的序列号见表1 2 。 表1 2 试验涉及g e n b a n k 序号 分别以j 2 3 和j 2 4 的1 8 s r d n a 基因为靶序列，用b l a s t 程 k n 一 a b n e 一一 茫 序 四j i i 大学颂士学位论文 中进行d n a 序列相似性搜索，结果显示与粪壳菌纲( s o r d a r i o m y c c t e s ) 的肉 座菌亚纲( h y p o c r c o m y c e t i d a e ) 的肉座目( h y p o c r e a l e s ) 的菌株有更高的碱 基序列相似性。从g e n b a n k e m b l 中下载肉座目( h y p o c r e a l e s ) 不同科代表 菌株的1 8 s r d n a 基因序列，用于进一步的系统发育关系的分析。 通过1 0 0 0 步重复获得的自展检验( b o o t s t r a p ) 数值标记在分支上。见图1 8 ， j 2 3 和j 2 4 分别与a c r e m o n i u ma l t e r n a t u m 聚合在一起形成一个具有1 0 0 支持 强度的分支。 c 抽q ，协 如6 m ￥z 如m 5 曲函_ 曲础 f j 锄m 细h f l o 蛔- 删 c r 口t z a d c a x l h m 朋4 妯 c o w 4 mw h m g r 印h l t o n m 嘲 h d o m “口_ 月r w “m k d k m m4 a l c o 自i c l t a d m f 4 t o m s k 6 血m 咖 a a c a m c k a f _ m “础 a 日h d d 埔t ，b 删 | a 聊口 蛐n 聃w “嚼 a c r c m a n l a nr a t l h a n a t a w p k m f t l a n # , 矗廿cs p b a l a n 出c l 姗c e m 向 d _ m 辅j $ 1 1 j a p 呻碍嗣”码即删 j n a d l 自蝴t d k n h 皤”， “ 删月f 删曲e r t u t r m t 2 1 6 a h 岫厶w _ 纰 4 _ c m m m h m m a r m t , m e 自x 盈哪t e e t t c o l 4 点, r , e r i c e l l a 柏a “盹， a 朋啪蛳4 函m 啊t j o 日哪埘l 出擅“耐 m “m 腑j a 日n 硎删d a d d 口 c a r & f 0 3c r 呦r a ， 嘲“口”口“嘛 ，r i 嘲a ，# m 图1 8 根据1 8 s r d n a 序列得到的系统发育树，显示j 2 4 与参考菌种的系统发育关系。 2 7 内生真菌利用不同碳源的情况 j fw h i t e 等人i 矧研究了a c r e m o n i u ms p 尉碳源利用的情况，本试验在此基 础上增加了2 种碳源，麦芽糖和乳糖，对分离得到的6 株内生真菌做了碳源 的研究。结果见表1 3 ，可以看出j 2 3 和j 2 4 与文献报道的a c r e m o n i