（微生物学专业论文）绿僵菌微循环产孢及相关基因分析.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 摘要 金龟子绿僵菌( m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ) 是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在 昆虫防治中起着重要作用。病原真菌主要以孢子侵染昆虫，菌株的产孢能力是菌 株选育时的重要参数迄今为止，对于杀虫真菌农药生产直接相关的产孢机制的 研究只有很少的报道。 包括绿僵菌在内的大多数的丝状真菌是在由菌丝分化出来的分生孢子梗上形 成分生孢子即正常产孢。本研究发现金龟子绿僵菌( 肛a n i s o p l i a e ) c q m a l 0 2 在 s y a 固体培养基上可以进行微循环产孢孢子萌发后不经过菌丝阶段直接产 孢这种微循环产孢的特点是接种后孢子在培养基上产生大量似酵母状粘性孢子。 为了研究微循环产孢的分子机制，本研究以金龟子绿僵菌( 膨a m s o p l i a e ) 菌 株c q m a l 0 2 为研究材料对微循环产孢进行了比较系统的研究。首先对绿僵菌 c q m a l 0 2 的微循环产孢培养基进行了筛选，确定了一种适合金龟子绿僵菌 c q m a l 0 2 微循环产孢的培养基在此基础上构建了绿僵菌微循环产孢时期的均一 化全长c d n a 文库和富集微循环产孢相关基因的差减文库，并对差减文库进行了筛 选。最后用生物信息学的方法对得到的e s t s ( e x p r e s s i o ns e q u e n t a g ) 进行了分 析 主要研究结果如下： 利用数码生物显微镜观察c q m a l 0 2 在不同培养基上的产孢过程在s y a 培养基上发现了微循环产孢现象。 对绿僵菌的这两种不同的产孢方式进行比较，发现无论是在产孢总量还是 产孢速度方面微循环产孢都优于正常产孢。 采用d s n ( d u p l e x - s p e c i f i cn u c l e a s e ) 均一化技术与s m a r t t m ( s w i t c h i n g m e c h a n i s ma t5 e n do f r n a t r a n s c r i p t ) 建库技术相结合的方法，成功构建了绿僵菌菌 株c q m a l 0 2 微循环产孢时期的均一化全长e d n a 文库。 以微循环产孢时期的绿僵菌为实验方( t e s t e r ) 以正常产孢时期的绿僵菌菌 丝为驱动方( d r i v e r ) ，利用抑制消减杂交( s u p p r e s s i o n 刚舡l c t i h y b r i d i z a t i o n , s s h ) 的方法构建了绿僵菌c q m a l 0 2 微循环产孢时期的差减文库。 对差减文库中的1 6 0 0 个克隆进行了斑点杂交筛选和r e v e r s en o r t h e r nd o t b l o t 筛选，得到4 0 0 个阳性克隆，测序后得到3 4 0 条质量较好的e s t s ，代表2 8 5 条非冗余e s t s 。 在g e n b a n k 上用b l a s t x 对其进行序列同源性比对。结果表明1 0 9 条e s t s 编码产物与己知蛋白质序列同源性较低或找不到任何同源序列，2 3 1 条e s t s 与数 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 据库中已知蛋白序列有明显的同源性，其中1 1 9 条e s t s 编码蛋白的功能未知。1 1 2 条己知功能的同源e s t s 涉及多种代谢和应答过程，如蛋白质合成加工、细胞代谢、 r n a 代谢、细胞周期相关蛋白、胁迫相关蛋白等 关键词：金龟子绿僵菌，产孢基因，微循环产孢，均一化全长c d n a 文库， s s h 文库 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 m e t a r t 舾u ma n 括o p l i a e ，ak i n do fe n t o m o p a t h o g e n i cf u n g u sa p p l i e dw o r l d w i d e , p l a y sf i l li m p o r t 粕tr o l ei nb i o l o g i c a lc o n t r o lo fi n s e c t s 1 ks p o r e 甜e o n i d i u mi st h e p r i m a r ym e a n sf o rb i o l o g yc o n t r 0 1 t h u s , t h ea b i l i t yo fs p o r u l a t i o ni s 瓶i m p o r t a n t f a c - t o ri ns e l e c t i n gm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a es l r g m h o w e v e l , l i t t l ei sk n o w na b o u tt h e g e n e t i cm e c h a n i s m sc o m o l j i n gt h ep r o c e s so f s p o r u l a t i o nu n t i ln o w i ti sw e l ll c n o w l l1 h 砒m o s t 丘i l l m c i i i o u sf u n g ii n c l u d i l a gm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e f o r me o n l d i au p o nd i f f e r e n t i a t e ds t a l kc e l l ss e p a r a t l x lf r o mm y e e l i a ( n o r m a le o n i d i a t i o n ) i nt h i ss t u d y ，w es u c c e s s f u l l yi n d u c e dt h ea s c o m y e e t em e t a r h i z i u ma n i s o p l i a es t r g m c q m a l 0 2i n t o am i e r o e y e l e e o n i d i a t i o n ( s p o r u l a t i o n o c c u r sf i o mt h e s p o r e s i m m e d i a t e l ya t t e rg e r m i m t i o nw i t h o u t , 0 i w i t hg r e a t l yr e d u c e dm y e c l i a lg r o w t h ) 0 1 1 1a s y as o l i dm e d i u m s u e l am i e r o e y e l ee o n i d i a t i o no f m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e 把s u l t e di n am a s so f y e a s t - f i k es r l l n es p o r e s i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rn 撕x 出a n i 锄o fm i e r o e y e l ee o n i d i a n t i o n , a e o m l 础a t i v e l ys y s t e m a t i cs t u d y 啊旧sc a r r i e do u t f i r s t l y , o x p e r i l l l e n t s 撇d e s i g n e dt o 翻焖as o l i di n e d i l l l nt r t t i n gf o rm i e r o e y l c ee o n i d i a f i o n s e c o n d l y , an o 玎n a l i z e d f u l l - l e n g t he d n al i b r a r yo fc q m a l 0 2i nm i e r i e y e l oc o n i d j a l i o ns t a g ea n da s u b t r a c t e d l i b r a r yw e r ec o n s t n l c t e 正t h i r d l y , am a c r o a r r a ys c 扣珊f r o mt h es u b t r a c t e dl i b r a r yf o r e d n a su p - r e g u l a t e di nt h em i e r o e y e l ee o n i d i a t i o nt h a ni nt h en o l m a lc o n i d i a t i o n 啊，a s l , e r f , , r m c d f i n a l l y , t h es e q u e n c e de s t sw 骶a n a l y z e du s i n gt h eb i o i n f o r m a t i e s m e t h o d s ， 1 km a i nr c s t t l t s 黼嬲f o l l o w s ： 1 _ h es p o r u l a t i o np r o c e s so fc q m a l 0 2o nd i f f e r e n tl l l 烈 i aw 鹤o b s e r v e dw i t ha d i g i 切lm i c r o s c o p e t h es p o r e sg r o w no na $ y as o f i dm e d i u mh a dam i e r o e y c l e e o n i d i a f i o n - a s e x u a ld i f f e m a t i a t i o n - ( 函1 ke o n i d i ap r o d t m i o n 啪sc o m p a r e db e 拥，e 蛐t h et w od i f f e r e n ts p o r u l a t i o n p a t t e r n s i ts h o w e dl t l a tb o t ht h es p o r ep r o d u c t i o n 锄dt h e8 p o l t l l a t i o ns p e e do f m i e r o e y e l ee o n i d i a t i o nw 啪g r e a t e rt l a a nt h o s eo f n o r m a le o n i d i a t i o n an o l m a l i z e df u l l - l e n g t he d n al i b r a r yo fc q m a l 0 2i nm i e r o e y c l ee o n i d i a t i o n s t a g e 删e , o m m l e t e ds u c c e s s f u l l yu t i l i z i n gd s n ( d u p l e x - s p e c i f i cn u d e a s e ) n o r m a l i z a t i o nm e t h o dc o m b i n e dw i t hs m a r t t m ( s w i t c h i n gm e c h a n i s ma t5 e n do f r n a t r a n s c r i p t ) l i b r a r yc o n s t r u c t i o nm e t h o d 1 1 1 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 as u b t r s l t e dc d n al i b r a r yw a sc o n s u - u c t e db y s u p p r e s s i o ns u b t r a c f i v e h y b r i d i z a t i o nb a s e do nt h em i c r o c y c l ec o n i d i a t i o nc u l t u r e sa sa t e s t e ra n dt h en o r m a l c o n i d i f i a o nc u l t u r e sa sad r i v e r at o t a lo f 1 6 0 0c l o n e sf r o mt h es u b t r a c t e dw e r es c r e e n e d 面n gb o t hd o tb l o ta n d r e v e r s en o r t h e r nd o tb l o tm e t h o d s ，a n d4 0 0p o s i t i v ec l o n e sw e r ev e r i f i e d t h e s e q u e n c e d4 0 0c l o n e sr e s u l t e di n3 4 0h i 啦q u a l i t ye s t sw h i c hr e p r e s e n t e d2 8 5 u n i e s t s e s t ss m l a r t ya n a l y s i sv i ab l a s t x f h 张糟s h o w e dt h a t1 0 9e s t sh a dn o h o m o l o g yt os e q u e n c e sw i t hk n o w ne s l 1 1 9 e s t se n c o d e dp r e d i c t e dp r o t e i n sa n dt h e r e s t1 1 2e s t sr e p r e s e n t e dab r o a ds p e c t r u mo fb i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，i n c l u d i n gp r o t e i n m e t a b o l i s mp r o t e i n s ，r n am e t a b o l i s mp r o t e i n s ，c e l lm e t a b o l i s mp r o t e i n s , c e l lc y c l e r e l a t e dp r o t e i n sa n ds t r e r i sr e s p o n s ep r o t e 斌e t c k e y w o r d s ：m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e , s p o r u 蜥o ng e n e s , i 垭c r o c y c l ec o 柑d i m i o n , n o n n a l i z 撕o nf u u - l e n g 山u b r m y , s s hh b r a r y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重鏖太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：z 长刀扣签字日期：如7 年莎月i 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重麽太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重庞太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：j i 锭万柏 i 签字日期：如0 7 年6 月j 日 导师签名： 签字日期：办口7 年6 月i 】日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 研究的背景与意义 由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因 素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的1 4 】，而目前对农作物害 虫的防治主要依赖于化学农药。尽管化学农药见效很快，但其广谱、高毒和难降解 的特性给非目标昆虫、天敌以及人类带来很大危害，同时害虫对化学农药易产生抗 药性。开发一种高效、低毒、无残留、无公害的新型农药成为当务之急目前世 界范围内研制比较成功的是生物农药，主要包括微生物农药和植物源农药微生 物农药具有持效期长、易降解、不杀伤天敌、对人畜安全以及不易使昆虫产生抗 药性等优点1 1 , 1 1 在微生物农药中，以昆虫病原真菌为主的杀虫荆在昆虫的生物防 治中起着重要的作用 昆虫病原真菌是昆虫病原微生物( 细菌、真菌和病毒) 中最大的一个类群， 由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的6 0 0 o 【4 1 昆虫病原真菌具有 无公害，无残留，害虫不易产生抗性等特点，正日益受到人们的广泛关注虫生 真菌具有独特的侵染方式，即可通过宿主体壁侵染害虫。这在防治刺吸式口器害 虫上是其它微生物杀虫剂( 如细菌、微孢子虫等) 无法替代的。如经常给农业生产带 来很大损失的蚜虫和叶蝉，它是刺吸式口器害虫，其它病原细菌、病毒等主要经 口传染，因此很难侵染这些害虫，但昆虫病原真菌，如绿僵菌( m e t a r h i z i u ms p p ) 和 白僵菌佃缸w b r 缸s p p ) 却比较容易从害虫的体表侵入，很好的控制了害虫。在这些 昆虫病原真菌中，那些易于培养和宿主范围广泛的种类，如绿僵菌和白僵菌等，倍 受人们关注【5 日 目前，昆虫病原真菌中的绿僵菌和白僵菌已在生产上得到比较广泛的应用。比 如白僵菌，在我国已广泛用于防治松毛虫、玉米螟、水稻叶蝉等多种农、林、牧、 卫生害虫，其中用于防治松毛虫应用面积居世界首位啊。绿僵菌目前也被广泛工厂 化生产用于防治地下害虫、天牛、飞蝗等在巴西绿僵菌也大规模用于防治草原和 甘蔗害虫，比如沫蝉等。在一些发达国家昆虫病原真菌用作生物控制剂已获得了许 可证，比如美国环境保护署批准了将绿僵菌用于蟑螂( 1 9 9 3 ) 、白蚁( 1 9 9 5 ) 的控制等。 由于昆虫病原真菌在害虫防治中的巨大潜力，国际上加快了对昆虫病原真菌 基础研究和应用技术的研究。统计表明，近年来对昆虫病原真菌的研究已经超过 了细菌，一些大型研究计划也在发达国家启动，如美国的“昆虫病原基因组资源” ( t h ee n t o m o p a t h o g e ng e n o m er e s o u r c e ) 研究计划，以绿僵菌为模式，开展表达 序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 研究项目，利用e s t s 制造绿僵菌基因芯 重庆大学硕士学位论文1 绪论 片以分析在侵染等病理过程中全基因组的表达变化，理解昆虫病原真菌对环境变 化的反应、启动侵入寄主过程、在昆虫体内繁殖和战胜寄主免疫反应等机制 ( h t t p ：t e g r u m d e d m 昆虫病原真菌主要以孢子侵染昆虫，菌体的产孢能力是影响杀虫真菌农药生 产的重要性状，但是目前对于杀虫真菌产孢及孢子特性形成机制的研究几乎是空 白。这种局面与昆虫病原真菌在害虫防治中的巨大潜在作用极不相称。因此，加 强对昆虫病原真菌产孢机制的研究对理论和现实都有重要意义 1 2 绿僵菌的研究概况 1 2 1 分类与寄主范围 绿僵菌属( m e t a r h i z i u m ) l 扫s o r o k l 于1 8 8 3 年建立的i t l ，其分类地位隶属于真菌 i - j ( e u m y c o t a ) 、有丝分裂孢子真菌类删t o 印鲥商m g i ) 、丝孢纲( i - i y p h o m y c e t e s ) 、丝 孢日饵y p h o m 雠t a l e s ) 、丝孢科( h y p h o m y c e t a c e a e ) 随着戴氏虫草( c o r d y c e p s t a i z l ) 的发现，其真正的系统分类地位应为真菌门叫删、子囊菌亚( a s c o m y c o t i n a ) 、 核菌纲( p y r e n o - m y c e t e s ) 、球壳菌目( s p h a e r i a l e s ) 、麦角菌科( c l a v i c i p 协啪a e ) 例 绿僵菌是虫生真菌，它通过菌丝侵入虫体使其致死后长出绿色分生孢子而得 名。绿僵菌的寄主范围比较广，它能寄生直翅目、鞘翅目、半翅日、同翅目、双 翅目、膜翅目、鳞翅目等8 个目4 2 个科约2 0 0 种昆虫、螨类及线虫【埘，利用它 防治害虫的研究与实践已愈百年。由于绿僵菌的致病力较强，防效好，对人畜和 环境安全，使人们对其寄予了厚望。多年来，国内外学者对绿僵菌的生物学特性 及致病机理进行了大量研究，并广泛应用于农林害虫的防治。从防治规模看绿僵 菌己发展成为仅次于白僵菌的真菌杀虫剂。 1 2 2 营养要求 虫生真菌对营养的要求，主要是碳源和氮源及少量微量元素。碳水化合物作 为虫生真菌的生长能源，其碳源是生物合成的骨架，氮源是合成氨基酸、细胞蛋 白及核酸物质的重要元素。含淀粉和糖类等物质的农副产品，也可提供碳源营养 和能量来源。绝大多数虫生真菌对氮源的要求不甚严格，无机氮源如硫酸氨、硝 酸氨、硝酸钾和有机氮源如蛋白胨、酵母膏、玉米浆、大豆饼粉等都能提供其生 长和产抱所需的氮源。无机氮源培养基，在一定含氮范围内产孢数随浓度的增加 而增加，超过一定范围又随着浓度的增加而降低 u l ，但不及有机氮源好。国内外 对金龟子绿僵菌营养要求的报道多见于其液体深层培养，不同碳、氮源对液生分 生抱子的形成具有显著的影响。在温度为2 8 条件下，适合菌丝生长的培养液c 肘 为l 2 5 ：1 。培养液c n 为3 ：l ，p h 为6 8 时液生分生孢子的产量最大【1 2 1 在固 体发酵研究方面，通气量对绿僵菌产孢影响不大，含水量为5 7 5 8 效果最型1 3 1 重庆大学硕士学位论文1 绪论 矿物质也是虫生真菌生长过程中不可缺少的，其主要功能是用作细胞构成的主要 成分，作为酶的组成都分，并维持酶的活性，调节细胞的渗透压、氢离子浓度及 氧化还原电位等，一般所需的矿物质包括硫、磷、镁、钾、钠、钙、铁等【1 1 1 1 2 3 生长发育的环境条件 环境条件对绿僵菌的生长影响较大，不同菌株要求的环境条件不同，通常在 1 5 3 5 条件下都能生长，其中以2 0 3 0 为生长适温，最适生长和孢子形成的 温度为2 5 。在温度高于4 0 和低于8 时，分生孢子不萌发。菌丝在3 0 条 件下生长虽快，但不能很好地形成分生孢子【1 4 1 绿僵菌对湿度的要求更严格，生 长发育要求空气相对湿度在9 3 以上，以9 8 1 0 0 为最适。在离体条件下孢子 发芽要求有饱和的湿度，而孢子形成亦要求相对湿度在9 3 以上【”l q 。强烈的阳 光照射对绿僵菌分生孢子的发芽和菌丝的生长都有较强的杀伤和抑制作用。一般 情况下，植物叶面上沾着的孢子经日晒1 0 0 小时后，只有2 3 发芽，日晒1 5 0 小 时后，则完全失去发芽力。但是，阳光对孢子的形成亦有缓阻作用，交替光照对 孢子形成最理想。此外，氧气和酸碱度对绿僵菌的生长发育均有较大的影响，其 中氧气对孢萌发和菌丝生长均有促进作用在开放培养中，氧气对分生出孢子的 形成显得更加需要【1 7 】绿僵菌在p h 4 7 - 1 0 0 的环境中，均能生长最适p h 为6 9 - 7 2 ，在微碱微酸的条件下生长良好，形成的分生孢子置多 1 2 4 生物化学和分子生物学研究 国内外对绿僵菌的生物化学和分子生物学研究主要集中在入侵机理以及在寄 主体内与寄主的相互作用方面 昆虫的表皮主要由蛋白质、几丁质和脂等构成，其中蛋白质约占7 0 ，几丁 质镶嵌于蛋自质中。研究发现绿僵菌穿透体壁时常产生附着胞，附着胞上再产生 穿透钉，同时分泌昆虫表皮降解酶类，在这些酶的共同作用下，将虫体局部体壁 溶解，穿透钉依靠机械压力穿透昆虫表皮，伸入体腔内【嘲r a y m o n d 等【1 9 】把绿僵 菌接到含有蟑螂表皮的培养基内，试图揭示绿僵菌在寄主体表时的胞外蛋白质的 合成及分泌情况，通过实验发现，绿僵菌分泌到培养基中的蛋白质至少有4 2 种。 从绿僵菌侵染的昆虫表皮上，发现和分离得到一系列昆虫表皮降解酶，包括蛋白 酶、几丁质酶、脂酶和酯酶等其中研究最多的是类枯草杆菌蛋白酶( c h y m o e l a s t a s e s , p r l ) 、类胰蛋白酶( t r y p s i n s , p r 2 ) 和p r 3 三类内切蛋白酶。p r l ( c h y m o e l a s t a s e s ) 是一组碱性蛋白酶，口i _ l o 3 ，分子量2 5 k d a ，具有水解s u c - a l a - p r o - p h e - n a 多肽 的活性。其链上一些位点，能与昆虫表皮中的谷氨酸和天冬氨酸中的羧基相结合， 在合适的条件下结合位点被激活，蛋白链断裂为多肽，多肽链继续降解直至5 肽。 p r l 在绿僵菌侵染过程中具有重要作用。它是人工培养或寄主表皮上绿僵菌产生侵 染机构时合成蛋白质的主要成分 2 0 , 2 1 1 。从患病昆虫体壁中能够分离到p r l 且从超微 重庆大学硕士学位论文1 绪论 结构上定位于水解区圆。p r l 被专化蛋白酶抑制剂抑制后或与p r l 免疫家兔制备 的特异性抗体中和后可以延缓烟草天蛾发病并降低死亡率。s tl e g e r 等刚采用基因 工程技术增加p r l 基因的拷贝数，使金龟予绿僵菌蛋白酶p r l 组成性超量表达，从 而极大地提高了菌株毒力与野生菌株( 出发菌株) 相比，基因工程菌株对寄主 昆虫的致死时间缩短2 5 ，感病昆虫食物消耗减少4 0 n , 4 。而且，他们还将1 1 1 的 基因导入杆状病毒，p r l 同样得到高效表达，大大提高了病毒的侵染力，使杀虫时 间比对照缩短5 0 。 病原真菌使寄主昆虫致死有三方面原因：组织的机械损伤、丧失营养物质和 毒素作用【1 0 1 其中真菌毒素是重要的毒力因子，绿僵菌进入昆虫体内后产生一系 列称为破坏素( d e s t r 既i n s ，d 1 ) 的环缩肽，迄今为止，已从绿僵菌培养液中分离 出2 3 种破坏素，其结构中都含有5 种氨基酸和一个羧酸h y 出瞩y 扯i d 群瑚。其中 d 1 xa 和d t xb 占主要，而d t xe 通常具有最强的杀虫活性。破坏索通过影响 许多细胞器如：线粒体、内质网和核膜来发挥其作用。研究发现d t xb 对液泡样 a t v a $ e 具有专一性、剂量依赖性不可逆抑制作用，而液泡样a t p a s e 对保持真核细 胞膜结合的细胞器中的酸平衡具有重要作用咧，对液泡样a t p a s e 的抑制作用可能 是大部分破坏素发挥毒性作用的方式k 硎a a w 等删研究发现绿僵菌菌株破坏素 滴度与菌株对3 种昆虫烟草天蛾m a n d u c as e x t a ( l e p i d o p t e r a ) 、沙漠飞蝗 s c h i s t o c e r c ag r e g a r i a ( o r t h o p t e r a ) 和o a o r h y n c h u ss u l c a t u s ( c o l e o p t e r a ) 的毒杀能力 星显著相关，因此认为破坏素是绿僵菌的重要毒力因子之一。研究同时发现，一 些绿僵菌菌株不能产生破坏素，但同样对烟草天蛾具有高毒力性，这种菌株在侵 染进入昆虫血淋巴后能迅速生长，产生大量菌孢体。因此，绿僵菌侵染进入昆虫 血淋巴后，至少存在2 种对寄主的毒性“战略”，即“毒素战略( t o x i ns t r a t e g y ) ” 和“生长战略( g r o w t hs t r a t e g y ) ”s a m u c l s 等【3 l 】把破坏素混合物注入烟草天蛾幼 虫体内，发现可立即引起虫体瘫痪及肌肉松弛，因此认为破坏素有致病作用。破 坏素在致病过程中的作用机制尚不清楚，只发现纯的破坏素对寄主有免疫压力 ( i m m u n o s u p p r e s s i o n ) 、肌肉麻痹( m u s c u l a r p a r a l y s i s ) 和损害马氏管c i m p a i r m e n l o f m a l p i g h i a n ) 的功能。 1 3 微循环产孢的研究现状 a n d e r s o n 等研究黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 时在真菌中首次提出了微循环产 孢( m i c r o c y c l ec o n i d i a t i o n ) 这个术语 3 2 1 。其含义是丝状真菌在( 有性或无性) 孢子 萌发后无营养菌丝生长或仅有极微弱菌丝生长而直接重复产孢的现象。近年微循 环产孢的含义已更加扩大，它包括有如迭代产孢、早熟产孢、幼体产孢、二次产 孢和次生子囊孢子等3 0 余个异名1 3 3 】。 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 循环产孢是真菌绕过正常生活史的一种无性产孢方式。在实验室条件下通过 各种措施，如变温处理能诱发黑曲霉、某些青霉、粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r a c r a s s a ) 微 循环产孢。这对提前产孢时间、增加产孢量和孢子形成的同步控制以及确定虫草 无性型等是一种有用的工具p 4 在自然条件下，不少真菌可自发进行微循环产孢。如 在虫霉目( e n t o m o p h t h o r a l e s ) 、外囊菌目( t a p h r i n a l e s ) 、麦角菌目 ( c l a v i e i p i t a l e s ) 、锈菌( o r e d i n a l e s ) 、黑粉菌目( u s t i l 删e s ) 、银耳目( t r e m e l l a l e s ) 和外担子菌日( e x o b a s i d i a l e s ) 等菌类中，是它们生活史的正常组成部分。在这些 真菌中微循环产孢是适应不良环境的一种保护机制【3 3 1 b a c o n 等嗍首次报道了 柱香菌( e p i c h l o eo p h i n a ) 子囊孢子发射于寄主植物小花和叶片上会立即进行微循 环产孢，子囊孢子不直接参与侵染的过程。这种独特的微循环产孢与前述能在实 验室诱发进行兼性微循环产孢真菌的主要区别是，柱香菌子囊孢子的微循环产孢 是一种自然发生的专性产孢过程，而无其它的无性产孢方式。作为一种病原真菌， 微循环产孢不仅可增加感染机遇，快速扩大感染范围而且可延长感染时阎，是病 原真菌缺乏寄主和对不良环境的一种保护反应瞰阐。微循环产孢在克氏尾孢 ( c e r c o s p o r ak i k u c h i o 引起的大豆落叶病的流行过程中起着重要作用。集颈假壳 ( f e n e s t e l l ap r i n c e p s ) 子囊孢子直接形成分生孢子和克氏尾孢的微循环产孢被认为 是这些真菌在生活史中的一种异时性机制口7 l 。 1 9 9 3 年樊美珍等发现绿僵菌在液体深层培养中某些菌株能以微循环产孢方式， 不经营养生长阶段，直接从液生芽孢子上形成液生分生孢子网而这种微循环产 孢现象的发生与培养液成分和培养条件密切相关，并与菌株有一定的相关性1 3 9 , 4 0 ， 但对微循环产孢的机理及其与培养参数的关系没有做进一步的研究。目前对微循 环产孢的研究主要集中在对其形态的描述，培养基的筛选和环境因素的影响，对 其发生分子机制一直没有深入系统的研究。 1 4 抑制性扣除杂交技术( s s h ) 及其研究进展 1 4 1s s h 的原理 扣除杂交技术最早应用是在2 0 世纪8 0 年代初，其目的是为了构建e d n a 文 库【4 1 1 和制备差异表达基因的特异探针【4 2 】。差异表达的基因通过检测e d n a ( t e s t e r ) 和过量的对照样本m r n a ( d r i v e r ) 的相互杂交而得到。在检测样本e d n a ( t e s t e r ) 和 对照样本m r n a ( d r i v e r ) 同时表达的基因会形成m r n a e d n a 杂交分子，而检测样 本特异表达的基因则保持单链状态。单链分子和双链分子通过羟基磷灰石层析丽 分离，分离得到的单链分子是检测样本特异表达的基因。差异表达的e d n a 可以 直接被克隆或通过e d n a 文库筛选而得到。这个方法后来又得到改进，包括用生 重庆大学硕士学位论文i 绪论 物素标记1 4 3 | 和o f i g o ( d t ) 3 口1 a t e x 标记c d n a 4 q 以增加单双链分子的分离效率。后来 p c r 选择性c d n a 扩增技术被应用到扣除杂交中，以克服以往扣除杂交中需要大 量起始m r n a 的缺点，并可以同时提高基因克隆的效率扣除技术的进一步发展 是在1 9 9 6 年，g u r s k a y a 等 4 5 1 和d i a t c h e n k o 等 4 6 1 同时发表了扣除杂交豹改进方法， 其主要的技术方法类似，这个技术叫抑制性扣除杂( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n ，s s i i ) 。s s h 的基本原理是以抑制p c r 为基础的d n a 扣除杂交方法。 所谓抑制p c r 是利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定，从而使非目的 系列片段两端反向重复系列在退火时产生类似于“锅柄”的结构，无法与引物配 对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。同时，该方法运用了杂交二级动力 学原理，即丰度高的单链c d n a 在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单 链e d n a ，而使原来在丰度上有差别的单链e d n a 相对含量达到基本一致。该方 法通过酶切、接头连接、两次扣除杂交和两次p c r 特异扩增，使假阳性率大大降 低，消除了e d n a 群体内各分子问丰度的差异，使分离低丰度表达的基因成为可 能s s h 技术主要过程如下图( 图1 1 ) 所示。 1 4 2s s h 技术评价 s s h 技术的主要优点： 该方法的最大优点是降低了假阳性率。因为s s h 方法采用接上接头和两步 1 差减杂交，以及两轮抑制性p c r ，保证了差异表达的c d n a 片段具有较高的特异 性。s t e i n 等在检测两种胰腺肿瘤细胞差异表达基因中发现s s h 阳性率高达9 4 4 7 1 ； s s h 方法具有高度敏感性。由于t e s t e rc d n a 经由r s a i 等酶切后产生多个 片段，通过均等化和目标片段的富集作用，确保了低丰度表达的e d n a 有被检测 的可能： 在一次s s h 反应中，可以同时分离出成百个差异表达基因，极大地提高了 检测效率。此外，该技术还具有背景低、重复性强等优点。 主要缺点： s s h 技术的最大障碍是所需的m r n a 量较大( 一般为几微克) ，若是m r n a 量不够，低丰度的差异表达基因c d n a 可能检测不到； s s h 技术依赖于p c r 技术，差减库中的e d n a 经过r s ai 等限制酶消化后， 不再是全长c d n a ： 不能同时在数个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺 失也不能被有效检测。 6 重庆大学硕士学位论文l 绪论 d d v l r c d i i a ( i n q _ 畸t w 船c o n a w t a 4 0 i m r m ：= = i 雹= = = = - 啊 _ 仁，_ l _ _ 。 i r - l n 。i i = = = _ 三三 霉。+ 【= ：= 鏊一 l m i a b a d s 亡) _ _ _ _ _ 囱昏_ _ _ 一 b 三三 d r o 口盎，。 a n d 3 亡) _ _ l _ 鼋嗣f _ a d d p d m e r s - 翩甲嘶钾p c r n e 眦唾n 啊曲睢 n o a m p i n c e t l o n b a r 嗣喇删靶柏稿 f m 出，“，瑚l 椭 ( a l t h o u g h m 伸i s np f 蛔甜b k 坩l n g 嘲啪懈o l l b o l h e n d s o f 世l e 婶呻4 1 嗽o k t t 抽s i 协_ 咖怕r o v i ”a l 呐o l 明y 蘸时掩铆oe n d sp m 甜隐_ y 帕啦瞄h s p p m s s m np c r g f f e d ：一- e x c e m f o r v e i ys h o r t m 幽c i 酗埔b 却p 4 l l o m f o r m a t e d e t a i l 明“p 即翻o n 雕i 图1 1s s h 流程图 7 詈一 重庆大学硕士学位论文l 绪论 1 4 3s s h 技术的应用 高等生物个细胞中仅有1 5 的基因表达，表达的变化是调控细胞生命活动 过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶 段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究真核生物基因差 异表达常用的方法基本上都是 a m r n a 角度入手，利用共同引物将不同的m r n a 反 转录成c d n a ，以c d n a 为研究对象研究基因的差异表达。如差示筛选、m r n a 差 异显示、c 【i n a 代表差异分析等。这些技术在研究少量基因的差异表达时有一定优 势，但对大规模基因组功能的研究则不能满足需要，所以基因差异表达分析技术 正在向差减文库构建、表达系统分析( s a g e ) 、c d n a 微阵列和d n a 芯片等大规模、 高通量的方向发展。s s h 方法是通过两次差减杂交使目的基因得以富集，在差减杂 交过程中采用了基因表达丰度均一化与抑制p c r 技术，使得低丰度的目标基因也 可被获得，非目标基因的扩增得到抑制用该方法构建的文库目标基因占有较大 的比例，假阳性率大大降低。s s h 技术特别适合在整体水平上探讨胁迫诱导的分子 机制，同时，还可以作为一个平台或称一种丰富的资源深入研究个别基因。目前 的研究大多沿着这两个方向进行因此，s s h 技术为研究细胞生殖、发育、分化、 衰老等生命过程有关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆提供了有力的工 具。 1 5 均一化技术的研究进展 1 5 1 常用的均一化技术 全长c d n a 是功能基因组学和比较基因组学研究的基础嗍，筛选全长c d n a 文 库是高效获得全长c d n a 的有效途径。但直接建立的c d n a 文库中各基因的丰度相 差很大难以获得低丰度基因。均一化c d n a 文库( n o r m a l i z e dc d n at i b r 龇y ) 是克服 基因转录水平上巨大差异得有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。现在 构建均一化的e d n a 文库至少有2 种主要的方法 4 9 ，5 0 1 ：一种是复性式均一化技术， 高丰度的c d n a 在退火条件下复性的速度快，而低丰度c d n a 复性要很长时间聊l ， 从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组d n a 在拷贝数上具 有相对均一化的性质，通过c d n a 与基因组d 1 姒杂交而降低在文库中高拷贝存在 的e d n a 的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多 次摸索才能找到最适条件：而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学 的原理也提出了其不利因素，即采用基因组d n a 饱和杂交的方法会因为低拷贝的 表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化c d n a 文库多是根据第 一种原理构建的，常用策略有基于p c r 技术利用c d n a 多次复性 8 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 【琊3 1m r n a - c d n a 杂交【5 ”5 】等。有研究报道针对各自选择的高表达靶序列进行分 析后，均一化处理后文库的高丰度达e d n a 是处理前的0 3 - 2 5 ，基本满足节 约筛选的要求。 1 5 2 基于d s n 的均一化技术 d s n ( d u p l e xs p e c i f i ce n z y m e ) 是最近发现的一种热稳定核酸酶。该酶能够特异 的降解双链d n a 和d n a - r n a 的杂交体中的d n a 而对单链d n a j l 乎没有作用吲 d s n 的均一化技术是应用d n a 复性的二级动力学原理来实现的，变性的d n a 分子 在复性的过程中高丰度基因形成双链分子的速度要比低丰度基因的快，随着复性 时间的延长反体系中各种d n a 单链的浓度趋于一致，这时加入