（微生物学专业论文）蛹虫草的家蚕人工培育及其its+dna序列分析.pdf

青州太学卫口咿届厦士j i f 竞t 毕业论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：娅日期：掣 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 槲蜘倒帆一 中文摘要 蛹虫草菌 c o r d y c e p sm i l i t a r j s ，( le xf r ) l i n k 也称北冬虫夏草、北 虫草，其药用价值与驰名中外的冬虫夏草( c o r d y c e p ss i n e n s i s ) 相似，为我 国名贵的药用真菌。因虫草野生资源不断减少，致使虫草价格不断上涨，在国际 市场上有很好的发展前景。目前，在国内外，对蛹虫草生物学特性、人工培育和 应用价值等都有所研究，但在感染家蚕幼虫并成功培养出子实体的报道中，方法 各异，子实体产率和稳定性不高，为此，我们作了如下研究： 1 人工培养基上的试栽试验：首先筛选出了适合菌丝生长的优化培养基为 加富p d a 培养基。再通过在人工培养基上试栽试验，筛选出了适合其生长 的较优条件和生长较好的菌株。 2 蛹虫草感染家蚕的试验：通过对五龄家蚕幼虫的感染试验，筛选出了较 优方法为表面消毒浸染法和孢子悬液注射法。同时对家蚕蛹进行了感染试 验，得出感染效果较佳的条件。通过此试验筛选出了对家蚕幼虫和蛹感染 效果较好的菌株为0 4 7 1 8 菌株。 3 退化菌株复壮试验及菌株的i t sd n a 分析：蛹虫草在试栽过程中经常会 出现菌种退化的现象，针对此现象我们一方面作了部分菌种复壮试验，得 出较好的方法为虫体回接法：另一方面采用核酸序列分析方法，扩增并测 序了1 6 个供试菌株的i t s 区段，系统分析表明，复壮菌株与退化菌株在 分子水平上发生了较大改变，复壮之后与未发生退化菌株具有较大相似 性。并通过系统树分析了各供试株之间的亲缘关系和系统演化。 关键词：蛹虫草家蚕人工栽培子实体i t s 贵州上学毒晴卯届曩士研究生平土静文 a b s t r a c t c o r d y c e p sm i l i t a r i si sa l s oc a l l e dn o r t hc o r d y c e p ss i n e n s i s 饵n o r t hc o r d y c e p s c o r d y c e p sm i l i t a r i si so o fp r e c i o u so f f i c i n a lf u n g ii no t l t c o i h l l y , o fw h i c h m e d i c i n a lv a l u ei ss i m i l a rt oc o r d y c e p ss i n e n s i st h a ta t ew e l lk n o w nb o t ha th o m ea n d a b r o a d i t sw i l dr e s o u r c ei sr e d u c i n gd a yb yd a yt h a tm a k e st h ep r i c eo fc o r d y c e p s h i g h e rt h a ni tw a s t h e r e f o r , i ti si nag o o dp o s i t i o ni nt h ei n t e r n a t i o n a lm a r k e t p r e s e n t l y , c o r d y c e p sm i l i t a r i s sb i o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，u r t i f i c a lc u l t i v a t i o na n dv a l u eo f a p p h c a f i o nh a v eb e e nr e s e a r c h e dd e e p l ya th o m ea n da b r o a d t h e r ea r eal o to f r e p o r t sa b o u tt h ed i f f e r e n tw a y so fi n f e c t i n gb o m b y xm o r il a r v u ew i t hc o r d y c e p s m i l i t a r i st oc u l t i v a t es p o r o p h o r e h o w e v e r , t h eo u t p u ta n ds t a b i l i t yo ff r u i tb o d yi s l o w e r s o ，i nt h i sp a p e rt h ea u t h o rd i ds o m es t u d i e sa sf o l l o w i n g ： 1 e x p e r i m e n t so na r t i f i c a lc u l t u r em e d i u m ：f i r s t l y , a c t i v ec u l t u r em e d i u mw o u l d b es c r e e n e do u tf o rt h eg r o w t ho fh y p h ai no r d e rt oe n r i c hp d ac u l t u r em e d i u m t h e n t h r o u g hd o i n gt h ee x p e r i m e n t sw i t hd i f f e r e n ts t r a i n s0 1 1a r t i f i c a lc u l t u r em e d i u m ，w e w o u l df m dt h eb e t t e rc o n d i t i o nt h a ti ss u i tf o ri t sg r o w t h 2 e x p e r i m e n t s o i lt h ei n f e c t i o no fb o m b y xm o r iw i l hc o r d y c e p sm i l i t a r y i s ： t h r o u g hi n f e e t i n gf i f t hi n s t a rb o m b y xm o r il a r v a e ，s u r f a c es t e r i l i z a t i o na n di n f e c t i o n m e t h o da n ds p o r e sl i q u i di n j e c t i o nm e t h o dw e r es c r e e n e do u t i tp r o v e dt h a tt h i s m e t h o di st h em o s te f f e c t i v e m e a n w h i l e ，b o m b y xm o r ip u p a eh a v eb e e na l s o i n f e c t e d t h e nt h eo p t i m a lc o n d i t i o nc o u l db ef o u n d c o n s e q u e n t l y , t h es t r a i n0 4 7 1 8 w a ss c e e n e do u tb yi n f e c t i n gb o m b y xm o r il a r v a ea n d p u p a e 3 r e j u v e n a t i o ne x p e r i m e n to fd e g e n e r a t i v es t r a i n sa n dg e n e a l o g ya n a l y s i sb a s e d o ni t sd n ao ft e s t e ds t r a i n s ：d e g e n e r a t i v ep h e n o m e n o no fs w a i n so f t e na p p e a r s d u r i n gt h ep r o c e s so fu r t i f i c a lc u l t i v a t i o no fc o r d y c e p sm i l i t a r i s t od e a lw i t ht h i s p r o b l e m ，o no u eh a n d ，w eh a v ed o n e8 0 m er e i u v e n a t i o ne x p e r i m e n t so ft e s t e ds t r a i n s a n df o u n dt h ef i n em e t h o di sw o r n l b o d yi n o c u l a t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，n u c l e i ca c i d s e q u e n c ea n a l y s i sm e t h o d sw e r ea p p l i e di nt h ee x p e r i m e n t i t sr e g i o n so f1 6t e s t e d s t r a i n sw e r ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e d s y s t e ma n a l y s i si n d i c a t e dt h a tag r e a tc h a n g ei n 2 一 兰苎苎! 竺苎墨主竺兰! ! 兰竺苎 _ _ 。_ _ _ _ _ - _ _ - 。- _ _ _ _ _ 。- _ 。_ 。_ 。_ - 。_ 。- 。- - 。 。_ 。 一 t h el e v e lo fm o l e c u l ew a sc a u s e db e t w e e nr e j u v e n a t i v es t r a i n sa n dd e g e n e r a t i v e s t r a i n s r e j u v e n a t i v es w a i n sa n du n d e g e n e r a t i v es t r a i n sh a v eag r e a tc o m p a r a b i l i t y a f t e rr e j u v e n a t i o n k i n d r e d s h i pa n ds y s t e me v o l v e m e n ta m o n gt h et e s t e ds w a i n sw e r e a n a l y z e db yp h y l o g e e e s i sf r e e k e yw o r d s ：c o r d y c e p sm i l i t a r i s ；b o m b y x m o r l ；a r f i f i c a lc u l t i v a t i o n ；f r u i tb o d y ；i t s 3 童i 土学肋7 届厦士研竟生牛土语文 第一章前言与综述 蛹虫草( c o r d y c e p sm i l i t a r i s ) 又名北冬虫夏草，是指真菌的茵丝通过各 种方法侵染鳞翅目昆虫，以昆虫体内的物质行寄生生活，通过不断的发育和分解 后最终伸出昆虫体表，而形成的一种真菌与虫体外壳共存的生物体。其主要功效 成份虫草素明显高于冬虫夏草( 贡成良，1 9 9 4 ) ，以蚕蛹为培养基质生长的蛹虫草 中氨基酸总量及人体必需的八种氨基酸总量均高于野生型及其它人工培育的蛹 虫草( 刘建华，1 9 9 8 ) 。家蚕在医学上的有许多新的用途，是一种非常重要的药用 昆虫，有广阔的开发前景。因此，利用蚕作为宿主接种蛹虫草菌进行人工培育以 及药化等方面的研究，具有较强意义，为传统的养蚕业开辟了_ 条效益更好的新 途径，也为虫草生产提供了新的资源。 1 蛹虫草的分类及分布 蛹虫草c o r d y c e p s m i i t a r i s ( l ) l i n k 隶属于真菌界( f u n g i ) 、子囊菌门 a s c o m y c o t a 、子囊菌纲a s c o m y c e t e s 、粪壳菌亚纲s o r d a r i o m y c e t i d a e 、肉座菌 目h y p o c r e a l e s 、麦角菌科c l a v i c i p i t a c e a e 、虫草属c o r d y c e p s ( k i r k 等， 2 0 0 1 ) 。蛹虫草的子座棒状，极少分枝，扁形或圆柱形，往往具有纵沟，高0 8 7 c m ，上部宽2 6c m ，橙黄色，因子囊壳项部突起而上部不平，具有粗1 5 3m m 长的柄；子座单生或2 3 ( 1 2 ) 个成丛地从寄主前端或近中部长出。 在自然界，蛹虫草主要分布在吉林、河北，安徽、广西、陕西、四川、云南、 贵州等省区，大部分分布于距土表3 - 1 0 c = 的较为疏松的浅土层中。它的自然发 生季节一般为5 - 8 月份，气温为1 0 2 3 ，空气相对湿度不低于7 0 。蛹虫草菌 的寄主很广，鳞翅目中的舟蛾科、天蚕蛾科、大蚕蛾科、蚕蛾科、刺蛾科、尺蛾 科、冥蛾科、鞘翅目中有金龟科、花金龟科、双翅目中有大蚊科。 4 童州土学萱扭卯届囊士研览生牛土话文 2 蚕蛹虫草的人工培育 2 1 菌种 菌种的选育是蛹虫草菌接种蚕体成功的关键，现己报道蛹虫草菌株繁多，其 人工栽培虽已获得成功，但是有许多种类在人工培养基上不易于栽培，有的即使 可以栽培但其稳定性不是很高。而在蚕体上接种蛹虫草进行人工培育更具有一定 的困难。对于菌种的选择，除菌种本身外，其培养基类型和菌种剂型对于成功培 育都有影响。蛹虫草对母种培养基碳源的要求不严格，葡萄糖或蔗糖均可采用， 且浓度以2 0 9 l - 的常规水平为好。蛹虫草是虫生真菌，生长过程需要优质蛋白， 母种培养基的氮源以牛肉膏最佳，氮源水平以l o g u 1 为佳，麸皮是适合多种真 菌的良好氮源，但却不适合蛹虫草，在配制蛹虫草培养基时不宜采用麸皮作氮 源( 张以俭，2 0 0 5 ) 。虫草生长需要动物氮源，因此菌种活化时培养基中若放有足 量的动物性氮源，可以提高人工培育的成功率。在没有动物性氮源的条件下，虫 草菌也可以利用对其有利的各种因子，生长同样较好，说明虫草菌并非一定要动 物源营养成分( 温鲁，2 0 0 4 ) 。菌丝长势、转色深浅、孢子数量和接种效果之间的 相关性，可用来作为判断母种优劣的重要依据，菌丝旺、转色深的母种，接种效 果将优于菌丝不旺或转色浅的母种( 张以俭，2 0 0 5 ) 。 菌种剂型的不同对感染效果也是不一样的，温鲁等人研究了斜面菌种、液体 菌种和菌悬液对感染效果的影响，结果利用菌悬液感染的效果最好。菌悬液的制 各，温鲁等人是利用无菌水刮洗斜面菌种而得，但是用无菌吐温- - 8 0 溶液刮洗斜 面菌种制取孢子悬液的方法会更好。 2 2 接种方法 虫草菌在虫体上产生的毒素没有其它昆虫病原菌产生的毒素那么强，而且蚕 肠道消化液呈强碱性，虫草菌孢子不易存活，因此通过肠道感染不太可能。虫草 菌孢子靠牙管的力量又不能穿过体表，因此，目前对蚕体接种的有效方法主要有 注射法、浸渍法和穿刺法。注射法即是将孢子悬液注射到蚕的血淋巴组织中，浸 渍法是将蚕体浸入到孢子悬液中令其自行感染，穿刺法是将蚕体浸入到孢子的溶 5 贵州土学l 叨届厦士竹竟生平_ 土话文 液中利用无菌针刺破体壁进行感染。但是对于这些方法，各研究者又提出了不同 的具体操作，所报道的感染效果也不同。刘勤等人在柞蚕上接种冬虫夏草时，采 用了添食法，浸渍法和穿刺法( 注射法) 三种不同的方法，结果只有注射法效果 明显，添食和浸渍没有明显效果。温鲁等人采用五种不同方法试验，即液体菌 种喷洒蚕体；液体菌种喷洒桑叶喂蚕；液体菌种喷洒蚕体加桑叶；固体菌 种接触蚕体；液体菌种注射蚕体；液体菌种穿刺蚕体；菌悬液穿刺蚕体。 结果只有穿刺蚕体时得到的效果最好，其它的没有明显效果。 2 3 消毒方法 蚕体表面附生有一定量的微生物菌群，它们起到正常的防护作用，避免其它 病原微生物的入侵，因此，蚕体接种虫草菌前要进行消毒工作。主要有紫外线消 毒和利用常规的消毒剂体表消毒。l 漂白粉的稳定性差，利用7 0 一7 5 酒精 消毒要控制好时间，因为每头蚕的体质状况不同，因此对酒精的敏感度也不一样， 要求做到消毒充分又不会杀死蚕儿。1 0 蚕用消毒净是一种新型高效广谱消毒剂， 效果好、价格低、无毒害、无残留，是消毒剂首选品种( 温鲁，2 0 0 4 ) 。 2 4 接种蚕龄 不同的蚕龄对接种虫草菌的意义和成功率具有较大差别。1 - 3 龄的蚕体较小， 对接种于其体内的虫草菌提供的营养有限，不利于以后虫草菌子实体的生长，形 成的菌核也较小。4 _ 5 龄的蚕是接种的首选，但是4 龄蚕的龄期只有4 - 5 天，休 眠2 天，感染的蚕不能正常蜕皮，容易因体表破裂感染其它病原菌。5 龄期的蚕 不再休眠，龄期长，正适合虫草菌的感染历程，而且此时的蚕体最大，积累的营 养最多，可以为以后虫草子实体的茁壮生长打下基础，是感染的最佳时期。5 龄 晚期蚕接种虫草菌，虽然成功率很高，但是由于此时感染的蚕能够正常结茧，所 以其体内的丝腺蛋白没有被虫草菌所利用。 3 蚕蛹虫草的成分分析 分析表明，家蚕蛹虫草与冬虫夏草在化学成份种类和含量上大致相同，现今 6 青州土学卫盼卯届厦士竹竞t 牛主论文 已有许多研究认为蛹虫草可以作为冬虫夏草的替代品。蛹虫草菌粉中谷甾醇、麦 角甾醇、甘露醇、虫草素、腺嘌呤、尿嘧啶的含量与冬虫夏草类似：马冰如等研 究认为柞蚕蛹虫草的化学成份与冬虫夏草大体相同。柞蚕蛹虫草含3 0 多种元素。 其含量类似于冬虫夏草( 张甲生，1 9 9 1 ) ；贡成良等报道活性成份虫草素、腺嘌呤。 家蚕蛹虫草明显高于冬虫夏草 c o r d c e p ss i n e s i s ( b e r k ) s a c e 3 ，是冬虫夏草的3 倍，暗示家蚕蛹虫草在抗肿瘤、抑制病毒方面的性能优于冬虫夏草。有意义的是 家蚕蛹虫草的子实体部分与蛹体部分在氨基酸组成及含量上有明显差异，这可能 导致这两部分的药用功能不同( 贡成良，2 0 0 2 ) 。 3 1 虫草素( c o r d y c e p i n ) 1 9 5 1 年，c u n i n g h a m 等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从 中分离到一种腺苷类活性物质，命名为虫草菌素( c o r d y c e p i n ) ，确定其结构式 为3 一脱氧腺苷( 3 - d e o x y a d e n o s i n e ) 。之后k a e a k a 等从无冠构巢曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 中亦分离出这种物质。这是迄今在虫草属真菌以外惟 一报道分离出虫草菌素的菌种。此后在虫草属其它一些种中也检测到虫草菌素的 存在( 刘东泽，2 0 0 4 ) 。虫草素又称虫草菌素，是一种核苷类抗生素，具有多种生 理活性，如抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制病毒作用，以及增强免疫功能、防治心 脑血管疾病等( 李祝，2 0 0 2 ；张平，2 0 0 3 ) 。蛹虫草是虫草素的主要产生菌，其 虫草素含量为冬虫夏草的数十倍，是获得虫草素的主要来源。b e n t l y 等相继证 实虫草素是由腺苷和有着碳支链的脱氧戊糖组成的一种核昔酸，因此它也被称为 3 一脱氧腺苷( 3 - d e o x y a d e n o s i n e ，3 - d a ) ，是从真菌中分离出来的第一个脱 氧核苷类抗生素。虫草素的分子式为c 。扭。3 n 5 0 3 ，分子量为2 5 1 d ，熔点2 3 0 2 3 1 c ， 紫外光最大吸收波长为2 5 9 n m ( 抗菌素生物理化特性，1 9 7 7 ；焦彦朝，1 9 9 0 ) 。 虫草素能溶于生理盐水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，因此多数实验 采用无菌生理盐水或p b s 液作为溶剂( 李婧，2 0 0 5 ) 。蚕虫草及其子座、菌核的 虫草素含量都很高，其中菌核最高，为1 3 2 8 m g 矿。k r e d i c h 等( 1 9 6 1 ) 首先 对虫草菌素的生物合成机理作了研究，表明虫草菌素的合成是以腺苷为直接前 体。1 9 6 0 年。t o d d 和u l b r i c h t 首先完成了3 一脱氧腺苷的全化学合成：1 9 6 4 年我国南京药学院也人工合成了虫草菌素( 南京药学院中草药学，1 9 7 6 ) 。 7 贵州土学置研届硬士竹竟生牛生论文 3 2 核苷类化合物 蛹虫草子实体及发酵液中含有虫草素( 3 脱氧腺苷) 、腺嘌呤、脱氧胸苷、 尿嘧啶、腺苷、次黄嘌呤、鸟苷、尿苷、n l 甲基腺苷、n 6 _ b2 ( 乙酰胺甲酰) 氧 乙基 、0 5 _ 乙酰基虫草素等核苷类化合物，为蛹虫草的主要活性成分之一。其 中虫草素( c o r d y c e p i n ) 是1 9 5 1 年c u m i n g b a m 等从蛹虫草的培养物中分离到 的一种腺苷类活性物质，它是一种抗菌素，具有抗菌、抗病毒、干扰人体r n a 及 d n a 合成，明显抑制多种肿瘤生长的作用，其在蛹虫草中的含量明显高于冬虫 夏草，且人工培养的蛹虫草中的含量也远高于天然蛹虫草。蛹虫草腺苷含量以子 座最高，为6 8 2 m g 9 4 。腺昔具有改善心脑血液循环、防止心率失常等活性， 液体培养蛹虫草菌丝中的腺嘌呤、腺苷、鸟苷、尿苷的含量均高于固体培养的蛹 虫草子座( 刘静明，1 9 9 4 ；汪宇，2 0 0 3 ) 。 3 3 多糖 虫草多糖含量以蚕虫草最多，为8 6 4 9 m g g - i ( 温鲁，2 0 0 5 ) 。蛹虫草多 糖被认为是一种活性物质，近代研究发现多糖对网状内皮系统及巨噬细胞有明 显的激活作用，能促进淋巴细胞转化，是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激 活机体的免疫活性细胞，特别是淋巴细胞及淋巴因子、单核巨噬细胞系统和n l 【 细胞等，从而攻击靶细胞发挥抗肿瘤作用，同时具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、 降血糖、降血脂等作用，能提高免疫力，改善肝功能，延缓衰老等( 柴建萍， 2 0 0 3 ) 。关于其结构和生物合成已有一定的研究。y u a 等( 2 0 0 4 ) 从子实体水 提液中分离得到3 种蛹虫草多糖，其组成分别为：c p s - i 为鼠李糖一木糖一甘 露糖一葡萄糖一半乳糖；c p s - 2 为鼠李糖一葡萄糖一半乳糖；c p s - 3 为只含葡 萄糖的均一多糖。3 种多糖的分子量分别为2 3 1 0 4 d 、i 2 9 1 0 4 d 和5 0 l o a d ；c p s - i 主要含有p 糖苷键，c p s - 2 和c p s - 3 主要含有a 糖苷键。y u 等 ( 2 0 0 4 ) 又分离到一种分子量为2 3 1 0 4 的多糖，并证明有生物活性。由于 分析手段的限制及多糖结构复杂性等闯题，对蛹虫草多糖结构的认识仍有待深 入。蛹虫草多糖的生物合成已经得到了初步的研究，尤以胞外多糖为多。来永 童州土学卫昀卯届嘎士竹览t 牛主论文 斌等( 2 0 0 1 ) 报道不同培养方式的多糖产率有一定的差异，可以通过优化培养 条件来提高多糖的产量。蛹虫草多糖产业化生产已成了研究的热点之一。 表1 1 野生蛹虫草子座与人工培育蛹虫草子座氨基酸含量比较 3 4 氨基酸 刘建华等( 1 9 9 8 ) 对野生蛹虫草子座与人工培育蛹虫草子座和菌丝体问氨基 酸成分进行比较( 见表1 1 、1 2 ) ，结果发现与野生蛹虫草1 号所具有的十七种氨 9 童i l f 土学盘钎届礓士碍竞生丰童话文 基酸相比，2 6 号人工培育蛹虫草中除5 号样品未测出胱氨酸之外，其它 几种人工培育蛹虫草样品中均含有与野生蛹虫草相同的氨基酸。而且在以蚕蛹为 培养基质生长的蛹虫草中氨基酸总量及人体必需的八种氨基酸总量均高于野生 型及其它人工培育型的蛹虫草。 表1 - 2 野生蛹虫草子座与人工培育蛹虫草菌丝体间氨基酸含量比较 青叫土学2 9 0 7 届嘎士j i f 竟t 牛鼻论文 贡成良等( 2 0 0 2 ) 将虫草6m o l lh c l 水解样品经氨基酸分析仪分析来研 究蛹虫草中氨基酸含量，结果表明：家蚕蛹虫草中除无组氨基酸外，其它氨基酸 基本与冬虫夏草含量一致，如表1 3 所示。 表1 3 家蚕蛹虫草与冬虫夏草氨基酸含量比较 t a b l e1 3c o m p a r i s o no f a m i n oa c i dc o n t e n tb e t w e e ns i l k w o r mc m i l i t a r i # a n dcs i n e s i # 贡成良等也对家蚕蛹虫草蛹体与子实体中氨基酸含量进行了比较，测定结果 如表1 4 所示，予实体中氨基酸含量高于蛹体部分，特别是g i u 、l y s ，而g 1 y 则明显低于蛹体部分。 1 1 责，f f 土学皇矗簖届曩士辑宪生丰土话文 表1 4 家蚕蛹虫草蛹体与予实体氨基酸比较 t a b l ei 4 c o m p a r i s o n o f a m i n oa c i d c o n t e n t b 剖h r c c n p u p a ea n d s p o r o p h o 地o f s i l k w o r m cm i l i t a r i s 3 5 无机元素 蛹虫草中已检出3 6 种无机元素，人工培养的蛹虫草中无机元素的种类与 冬虫夏草基本一致，含量十分丰富。世界卫生组织公布f e 、c u 、z n 、妇、c r 、 s e 、c o 为人类营养所必备。研究认为虚证与f e 、c u 、z n 、有关。虫草的补 肺益肾，滋补强壮，f e 、含量高可能是个原因。人体神经系统中含有大量的 磷脂，虫草富含磷，可能与临床上的催眠、镇静等神经调节有关：柞蚕蛹虫草磷 的含量为冬虫夏草的3 5 倍硒为微量元素中的抗癌之王，柞蚕蛹虫草中的硒 贵州土学卫研届曩士研竟生牛业论文 含量为0 5 4 p p m ，比富硒抗癌药物黄芪还要高5 8 倍。文献记载当人体内z n c u 达到1 ：1 4 时，体内胆固醇增高，易患冠心病。被认为有利于预防和治疗冠 心病的蛹虫草z n c u 为4 5 5 o ( 张显科，1 9 9 7 ；马冰如，1 9 9 4 ) 。 4 蚕蛹虫草的毒理特性 天然野生的蛹虫草始载于新华本草纲要，现代中医学巨著中华药海 也有记载，此外，全国中药汇编：“蛹虫草( 北虫草) 的子实体及虫体也可作 为冬虫夏草入药”，蛹草及其人工培育的蛹虫草与名贵中药冬虫夏草为同属真菌， 其化学成分基本相同，最有希望成为冬虫夏草的替代品。近3 0 多年来，国内外学 者对虫草进行了大量研究，证明了天然虫草与人工培养虫草的药理作用的相似性 ( 包天桐，1 9 9 8 ) 。虫草属中一部分种类因毒性较大而难以作为冬虫夏草的替代 品。家蚕在本草纲目中被称之谓“神虫”，自古以来就被人们所食用；而且 已有许多试验证明蛹虫草菌丝发酵体的安全性较好，据此可以推测家蚕蛹虫草是 安全的。此外，贡成良等人对家蚕蛹虫草的毒性研究结果也证明了其安全性，家 蚕蛹虫草根据急性毒性分级标准，其大小、小鼠急性经口毒性属于实际无毒类； a m e s 试验结果为阴性，小鼠微核试验结果为阴性，小鼠精子畸形试验结果为阴性； 家蚕蛹虫草大鼠3 0 d 喂养试验各项指标均未见明显毒性反应，其最大无作用剂量 为4 1 0 9 k g 体重。曾用家蚕蛹虫草对4 8 位乙肝患者进行3 个月的治疗，未见一例有 毒副反应，这一结果同样表明家蚕蛹虫草的安全性较好。( 贡成良，2 0 0 4 ) 5 蚕蛹虫草的药理作用 5 1 蚕蛹虫草的延缓衰老作用 虫草是我国珍贵的中草药，具有多种生物活性物质，被我国中医推崇为治 疗“虚症、虚痉、虚痛”的圣药，既补肺阴，又补肾阳。王宝贵等人的研究表明， 柞蚕蛹虫草能够明显延长果蝇存活的时间( 王宝贵，2 0 0 2 ) ；李信等人的研究显 示，蛹虫草具有较好的抗氧化活性( 李信，1 9 9 7 ) ；王琦的研究表明，蛹虫草具 有清除0 h 自由基的作用( 王琦，2 0 0 2 ) ；张桂英等研究了柞蚕蛹虫草对老龄 贵州土学盘囊卯届曩士研宪生毕业论文 大鼠脂质过氧化物( l p 0 ) 含量和超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( g s h - p x ) 活性的影响，显示柞蚕蛹虫草具有明显的抗氧化和清除自由基的作用 ( 张桂英，2 0 0 1 ) 。超氧化物歧化酶作为抗衰老药物超阳离子清除剂显示了重要 的生物活性，它在机体抗辐射、防衰老、抗肿瘤和抗炎症等方面起着重要作用， 作为衡量机体天然免疫水平的重要参考指标( m c c o r dj m ，1 9 6 9 ) 。脂质过氧化 物( l p 0 ) 能通过活性氧引发细胞膜的脂质过氧化，从而引起细胞和机体损伤 ( v i g y a nb ，1 9 9 8 ) 。江晓路和孙月采用超声波破壁法和甲苯破壁法提取s o d 。 结果表明，超声波破壁法的效果优于甲苯破壁法，不同虫草的s o d 活性有较大差 别，蚕蛹虫草的s o d 活性最高，为每毫克蛋白1 8 8 2 活性单位。新鲜虫草及发酵菌 丝体中含有抗衰老因子一超氧化物歧化酶，尤以新鲜蚕蛹虫草的s o d 活性最高 ( 江晓路。1 9 9 9 ) 。贡成良、潘中华、郑小坚等通过给予老鼠不同剂量的家蚕蛹 虫草试验，表明家蚕蛹虫草有抗氧化作用，果蝇饲养试验表明，蛹虫草处理的雄 性、雌性果蝇的平均寿命、最高寿命、半数死亡时间都明显延长，且呈较明显的 剂量效应，据此可以认为家蚕蛹虫草具有延缓衰老的作用( 贡成良，2 0 0 5 ) 。 5 2 家蚕蛹虫草的抗肿瘤作用 中药治疗肿瘤越来越受到医学界的重视，蚕蛹虫草作为一种新的中药，其在 抗肿瘤方面发挥着越来越重要的作用。刘洁等研究表明，蚕蛹虫草对小鼠s - 。洧 明显抑制作用，延长荷瘤小鼠寿命：可明显抑制小鼠l e w i s 肺癌原发灶生长和自发 性肺部转移( 刘洁，1 9 9 7 ) 。郁利平等采用u d s 检测法研究发现强癌诱变剂甲基 甲烷磺酸酯( 删s ) 与蛹虫草同时作用b a l b c 小鼠脾淋巴细胞时。其u d s 反应性明显 低于_ 啷单独作用时u d s 的反应性，提示蛹虫草具有对癌诱变剂m 晒所致b a l b c 小 鼠脾细胞d n a 损伤的拮抗作用( 郁利平，1 9 9 4 ) 。p r i c e 等发现虫草素可以保护 费希尔鼠胚胎细胞( h 4 3 ) 免于化学性致癌物3 一甲基胆蒽引起的转化( p r i c ep 3 ， 1 9 7 5 ) 。孙科峰、石伟等用s 。小鼠肉瘤为动物模型，对沈阳地区培育的蛹虫草 子实体的抗肿瘤作用进行了药效学研究。实验结果显示：3 0 0 m g d 和6 0 0 m g d 剂量 的蛹虫草子实体对s ，。腹水型荷瘤小鼠的生存有明显的延长作用( k 0 1 0 1 ) ，其生 命延长率为1 8 0 和1 9 3 ，与环磷酰胺对照组作用相似。实验结果还显示：蛹虫草 子实体对s 。荷瘤小鼠的肿瘤免疫活性因子孙b 一9 和i l - 2 有明显的促进作用，并 1 4 责州土学a 鲫届嘎士唧竞生牛业话文 优于中药复方制剂对照药强力康免疫升白冲剂( p ( o i o i ) ( 孙科峰，2 0 0 4 ) 。 5 3 蚕蛹虫草对免疫调节的影响 n k 细胞和巨噬细胞是细胞免疫中的非特异性部分，n l ( 细胞可直接作为杀伤细 胞发挥作用，是细胞免疫的重要组成部分，在机体抗肿瘤作用中处于第一道防线， 先于t 细胞发挥作用。孙艳、官杰等研究显示，蛹虫草子实体可以明显的提高n l ( 细胞的活性( 孙艳，2 0 0 2 ) 。贡成良等研究也表明家蚕蛹虫草能显著提高小鼠n l 【 细胞活性，表明家蚕蛹虫草有增强机体非特异性免疫能力，可能也具有抗肿瘤的 作用( 贡成良，2 0 0 4 ) 。蛹虫草中的虫草菌素能够提高机体单核巨噬细胞系统的 吞噬功能，激活巨噬细胞产生细胞毒素直接杀伤癌细胞( 凌建亚，2 0 0 2 ) 。2 0 世 纪6 0 年代就有报道证实蛹虫草的主要成分之一虫草素可延长艾式腹水瘤小鼠的 存活时间，具有抗肿瘤作用( j a g g e r d v ，1 9 6 1 ) 。贡成良等在用家蚕蛹虫草治疗 乙型肝炎的研究中，发现治疗后外周血t 淋巴细胞亚群c d 3 、c d 4 、c d 4 c d 8 有显著 升高，c d 8 较治疗前降低，说明蚕蛹虫草有较好的免疫调节作用( 贡成良，1 9 9 5 ) 。 而柞蚕蛹虫草在中低剂量时对机体的非特异性免疫功能具有明显的增强作用，在 高剂量时对机体的非特异性免疫功能无明显作用，甚至会出现抑制作用( 刘海燕， 2 0 0 4 ) 。周小夏等研究结果表明虫草菌素极大地提高了人外周血液单核细胞 i n t e r l e u k i n - l o 的分泌和i n t e r l e u k i n - l o m r n a 的表达，同时虫草菌素对诱导产生 i n t e r l e u k i n 的植物血球凝集素和外周血液单核细胞的扩增都有抑制作用。抗 i n t e r l e i k i n - l o 中性抗体也不能完全阻止虫草菌素对i n t e r l e u k i n 产生的抑制作 用。上述结果表明虫草菌素有自身免疫调节作用( 周小夏，2 0 0 2 ) 。 5 4 其它作用 蛹虫草具有调节神经系统的作用，对植物神经系统具有外周抗胆碱作用，能 降低副交感神经兴奋性，使蛹虫草具有镇静作用，并且对心悸、失眠有较好的治 疗效果。陈桂宝等对蛹虫草水煎液的药理作用进行了研究，结果显示蛹虫草具有 明显的镇静、增强戊巴比妥的睡眠作用( 陈敬民，1 9 9 7 ；陈桂宝，1 9 9 7 ) 。蛹虫 草提取物可通过调节机体组织的免疫功能，缓解由于内毒素或类似物质造成的肺 部炎症，对肺有一定的保护作用( 戴瑛，2 0 0 4 ) 。还可以促进雄性激素的合成和 贵州太学昌幼届硬士研究t 牛土论文 分泌，从而促进睾丸生精细胞生长发育及精子形成，发挥其补肾助阳益精之功效 ( 徐维蓉，2 0 0 1 ) 。赵鹏等研究表明蛹虫草菌丝体还具有降血脂的作用( 赵鹏， 2 0 0 4 ) 。 6 展望 随着人们对虫草认识的不断加深，国内外市场的需求量日趋扩大。由于自然 资源的限制，对虫草的滥挖乱采，致使市场上冬虫夏草供不应求。蛹虫草作为冬虫 夏草的代用品，人工栽培己获得成功，尤其在新药研究和保健品开发方面还很有 潜力可挖。而且与冬虫夏草相比，家蚕蛹虫草在抗肿瘤、抑制病毒方面的能力优 于冬虫夏草( 陈国刚，2 0 0 5 ) ，故对其进行研究和开发具有直接的现实意义和较 高的经济价值。 但是，耳前对蚕蛹虫草研究还有很多地方有待深入，蚕蛹虫草有效成分和药 理学及作用机制的研究还很有限。相信随着研究技术和研究方法的不断发展，蛹 虫草会更好、更充分的为人类服务，为人类做出新的贡献。 贵州文学罩口胃届硬士唧窀t 羊主语文 第二章蛹虫草人工培养基和培育条件的研究 第一节蛹虫草菌丝生长的研究 蛹虫草 c o r d y c e p sm i l i t a r i s ( l ) l i n k 无性世代为p a e c i o m y c e s m i l i t a r i sl i a n g s p n o v ( 梁宗琦，2 0 0 1 ) 隶属子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、 虫草属，是虫草属的模式种，为虫生药用真菌。具现代医学分析，蛹虫草富有虫 草素、多糖、氨基酸、超氧化物与微量元素等多种成分( l i uz h e n g x i a n g ，2 0 0 4 ) 。 蛹虫草在功能食品、医药和生物学技术方面有很好的实用价值，在营养价值、活 性成分和医疗保健功效等方面，都和冬虫夏草相似( 纪朋艳，2 0 0 5 ) ，但不像冬虫 夏草那样需要特殊生境和专一寄主，因此，蛹虫草在国内外倍受人们的关注( 粱 月，2 0 0 5 ) 。为了后期蛹虫草的人工培育，首先，本研究对几种不同的人工培养基 进行了筛选，得出在加富p d a 培养基上，菌丝生长速度较快，产分生孢子的数量 较多。 l 试验材料 1 1 供试菌株：7 1 7 2 、0 4 7 1 8 、0 4 、0 2 均由本实验室提供。 1 2 供试培养基： 1 2 1p d a 培养基：马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 m l 。 1 2 2 加富p d a 培养基( 黄清荣，2 0 0 5 ) ：马铃薯2 0 0 9 ，麦麸5 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ， 蛋白胨5 9 ，髓2 p 0 。3 9 ，u g s o 。2 5 9 ，维生素b , o 0 1 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 m l 。 1 2 3 察氏培养基：硝酸钠3 9 ，磷酸氢二钾l g ，硫酸镁( m g s 0 4 7 h 2 0 ) 0 5 9 ，氯 化钾0 5 9 ，硫酸亚铁0 o l g ，蔗糖3 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 1 2 4 沙氏培养基：蛋白胨l o g ，葡萄糖4 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 2 试验方法 2 1 培养基制各 2 1 1p d a 培养基：马铃薯削皮后切成碎块，煮沸后维持约3 0 r a i n ，纱布过滤后 1 7 责碍土学置明届硬士j i 竟生丰土语文 向滤液中分别加入各药品，定容，分装入三角瓶，1 2 l 灭菌3 0 r a i n 。灭菌后在 无菌操作台上倒平板。 2 1 2 加富p d a 培养基：马铃薯削皮后切成碎块，与麦麸一起放入水中煮沸后维 持约3 0 r a i n ，纱布过滤后，商滤液中分别加入各药品，定容，而后分装入三角瓶， 1 2 1 。c 灭菌3 0 r a i n 。三角瓶内培养基灭菌后在无菌操作台上倒平板。 2 1 3 察氏培养基：分别加入各药品，定容，分装入三角瓶，1 2 1 灭菌3 0 r a i n 。 灭菌后在无菌操作台上倒平板。 2 1 4 沙氏培养基：同2 1 i3 。 2 z 接种将保存的蛹虫草菌种7 1 7 2 、0 4 7 1 8 、0 4 、0 2 于无菌操作台中分别接种 至p d a 培养基上，放于2 6 培养箱内培养。待菌丝长满培养皿时，用无菌打孔 器在菌落边缘半径相同处取0 5 c m 2 菌块转接到上述准备好的四种培养基中培养 ( 肖建辉，2 0 0 4 ) 。每两天记录一次其生长情况。 2 3 分生孢子的测定2 6 培养箱内培养1 4 天后，用5 0 m l 吐温- - 8 0 洗脱分生 孢子，制成孢子悬液，用血球计数板显微计数。 3 结果与分析 3 1 蛹虫草菌丝生长的研究 3 1 1 不同蛹虫草菌株在p d a 平板培养基中生长1 4 天的对比，如表2 1 所示。 t a b l e2 1c o m p a r i s o no fd i f f e r e a tg 扛a i n so fc o r d y c e p sm i l i t a r i sg r o w i n go hf i a tc u l t u r em e d i u m o f p d ao n t h c1 4 t hd a y 气生菌丝白色，较多，菌落绒毛状，致密，边缘整齐，产分生孢子约为2 5 x1 0 ” 7 1 7 2 个，_ l ，菌落直径5 2 5 4 c m 。背面橘橙色。 气生菌丝白色，较多，菌落绒毛状，致密，边缘整齐，产分生孢子约为3 5 x1 0 ” 0 4 7 1 8 个- l ，菌落直径5 5 5 8 c m ，背面橘橙色。 气生菌丝白色，较少，菌落绒毛状，略疏，边缘整齐，产分生孢子约为1 8 1 0 ” 0 4 个i l ，菌落直径5 3 5 4 c m ，背面橘红色。 气生菌丝白色，较少。菌落绒毛状，略琉，边缘整齐，产分生孢子约为3 3 x 1 0 ” 个s l ，菌落直径4 8 5 0 c s 。背面淡橘红色，菌落表面有皱褶。 童州史学昌晴万届曩士唧竟t 牛 论文 在p d a 培养基上0 4 7 1 8 生长最快，7 1 7 2 与0 4 相似，0 2 生长相对较慢。0 4 与0 2 虽然菌落略疏，但是基内菌丝转色较快，颜色较深。该培养基上产孢都较 多。 3 1 2 不同蛹虫草菌株在加富p d a 培养基中生长1 4 天的对比，如表2 2 所示。 t a b l e2 2c o m p a r i s o no fd i f f e r e n ts w a i n