（动物学专业论文）初探昆虫视觉适应和视叶中5ht含量的关系.pdf

摘要 大多数动物都能应对外界变化巨大的光环境，而外界最大光强是最弱光强的1 0 1 1 倍。视觉系统能在巨大的光强范围内实施其功能，表明了视觉系统具有惊人的调节 其敏感度去与外界环境相匹配的能力。我们把视觉系统调节光敏感性适应外界光环 境的现象称为视觉适应现象。 实验表明，5 h t 的变化可能会影响昆虫视觉系统的视觉适应状态。该调节机制 现在认为有两种方式。首先，我们认为与视觉适应相关的神经递质应该只是在光强 变化的瞬间释放，从而改变相关神经元的视觉适应状态。当外界光强不变化时，神 经递质并不需要释放。其次，有的理论认为，视觉适应的状态是两种以上的递质相 互拮抗来决定相关神经元的视觉适应状态。一些递质使视觉系统倾向于明适应，另 一些递质则调节视觉系统倾向于暗适应状态。视觉系统的视觉适应状态取决于两种 递质的相对释放量。当明适应相关递质占优势时，视觉系统处于明适应状态，反之 亦然。该理论认为，明暗适应递质要持续释放才能够维持视觉系统正常的感光机能。 本研究主要是依照这两种可能机制来设计实验组。 在相同的免疫组织化学染色控制条件下，本实验比较了不同昆虫视叶中5 一h t 含 量的差别。，结果表明，不同的昆虫其脑中5 h t 的含量有着显著的差异。那些在暗光 下活动的昆虫( 如淡色库蚊) ，以及穴居的昆虫( 如日本弓背蚁) 脑中5 一h t 的含量 要明显高于那些在光强变化缓和环境中生活的昆虫( 如白斑迷蛱蝶) 。我们分析， 前者的生活环境光强变化幅度很大，昆虫需要频繁的，高强度的视觉适应调节，从 而需要大量相关递质的储备。而后者由于生活环境中光强变化幅度较小，变化很缓 和，所以不需要高强度，高频次的视觉适应调节，因此也不必储备过多的视觉适应 调节相关递质。根据以上分析，我们认为，5 h t 很可能和昆虫的视觉适应调节相关。 为了进一步验证这个假说，本实验根据以上两种可能机制把实验昆虫( 日本弓背蚁) 分成四组进行光刺激：一组用灯光持续光照9 天，一组持续黑暗9 天，一组明暗交 替刺激9 天，一组自然光照9 天。然后采用免疫组织化学的方法，比较四个实验组 之间相关神经元5 h t 含量的差异。运用i n l a g ep r 0p 测量四组问对应阳性区域的 灰度值，并对测量值进行了方差分析。结果表明，四个实验组间的灰度值差异不显 著。昆虫光刺激实验结果与预测不符。我们认为有可能是刺激条件不理想，未形成 可检测的5 h t 含量差异。另外，免疫组化结合图像分析的方法定量精度较差，可能 不足于揭示光刺激引起的5 h t 含量上的细微差别。 关键词：5 h t ；视觉适应；视叶；昆虫；日本弓背蚁 a b s 仃a c t a 1 t h o u 曲l i 曲ti n t e n s 时i na na n i r n a l se n v 的n m e n tm a yv a 巧b ye l e v e no r d e r so f m a 印i t u d e ，v i s u a l l yd r i v e nb e h a v i o r sc a ns t i l ld e a lw i t l ls u c hc h a n g i n ge n v i r o n m e n t a d a p t a t i o na l l o w s t 1 1 ev i s u a ls y s t e mt 0b e 如n c t i o n a li n 蛐c hl a 唱es p e c 饥蚰a n d s i g n i f i c a n n ys e l l s i t i v et om a t c hw i n lt h es u i t o l m d i n g w ed e f m e 也e 咖t a t i o no fm e v i s u a ls y s t e mt ot h el i 曲te n v 曲衄e n tb ya 由u s t i n gi t ss e n s i t i v 时a sv i s u a la d a p t a t i o n n e u r a ln e 似o r ka d a p t a t i o 璐t om e1 i g h ta n dd k l f i 【n e s sa r et h o u g h tt 0b ec o n 仃o l l e db y 1 i g h t d e p e n d e n tc h a i l g e si n5 - h tl e v e l s i no t l l e rw o r d s ，5 一h tm a ym o d u l a t em ev i s u a l a d a p t a t i o ns t a t eo fi n s e c tv i s u a ls y s t e m t h i sm o d u l a t i o ni sr e c o 印i z e dt oh a v e 魄o m e c h a n i s m s f i l s t ，n 吼o 仃a n s m i t t e r sr e l a t e dt ov i s u a la d a p t a t i o nm a yo n l yr e l e a s ew h e n l i 曲ta n dd 破n e s sc h a n g e t h e 打a n s m i t t e r sn e e dn o tt ob er e l e a s e d ，w h e nl i 曲ti n t e n s i t ) ， d o e s n tc h a n g e s e c o n d ，妇ka d a p t a t i o na r i dl i g h ta d a p t a t i o no fm er e l a t e dn e u r o n si 1 1t i l e r e t i n a ln e 觚o r ka r ei i lad y n a m i cp u s h a n d - p u l le q u i l i b r i u m ，w h i c hi sm o d u l a t e db yt h e 1 e v e l so f 锕ok i n d so ft r a n s m i t t e r s o n el 【i n do ft r a 咀s m i t t e r sm a ys h i f tt h eb a l 锄c ei nf a v o r o fd a r ka d 印谢o n ，h o w e v t h eo t h e ro n ed i s p l a y e dc o n 舰巧缸1 c t i o n t h es t a t eo fv i s u a l s y s t e mi sd e t e n l l i n e db ym e i rr e l a t i v ec o n t e n t st h a tt w ol 【i n d so f 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0 b e ；i n s e c t ；c | 口 妒d 刀d 觚却d 刀把淞 东北师范大学硕士学位论文 经节 交 交 眼髓 视 形 形体 体细 央上 央下 刖 后 维 角 辅 觉纤维 道下神 髓 节 缩略语 o p t i cl o b e 1 a m i n a m e d u l l a l o b u l a o u t e rc h i a s m a i n n e rc h i a s m a o c e l l u s o c e ll a rt r a c tn e u r o p il e a n t e r i o ro p t i ct u b e r c l e p r o t o c e r e b r u m m u s h r o o mb o d y t h el a t e r a lc a l y x t h em e d i a nc a l y x p e d u n c u l u s 1 i p c o l l a r b a s a lr i n g q 一1 0 b e b 一1 0 b e k e n y o nc e l l s t h eu p p e rc e n t r a lb o d y t h el o w e rc e n t r a lb o d y p r e c e r e b r a lb rid g e p o s t c e r e b r a lb r id g e n o d u l i a n t e n n a ll o b e t h e1 a t e r a la c c e s s o r y1 0 b e o l f a c t o r yg l o m e r u li d o r s a l1 0 b e t r i t o c e r e b r u m s u b o e s o p h a g e a lg a n 9 1io n l a t e r a ln e u r o p i l e 1 6 0 p l a m e l o 0 c h i c h o c 0 n a o t u p r o 船 l c m c p l i c 0 b r a 1 b 1 k c c b u c b l p r b p o b n a l l a l g d l t r i s o g l n 叶层髓髓叉叉眼区突脑体冠冠柄区区环叶叶胞体体桥桥球叶叶球叶脑经 视神外内外内单单前前蕈侧中蕈唇领基q b球中中脑脑纤触侧嗅背后食侧 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学 技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：塑孟盟l 指导教师签名： 日 期：逊垒垒! 马卜i i l 日期汹：6 ：! 皇 学位论文 工作单位 通讯地址 专求奄晒聿蚤 台；鸯蜥 基铆冷够 东北师范大学硕士学位论文 己i言 丁l目 大多数动物都能应对外界变化巨大的光环境，而外界最大光强是最弱的光强的 1 0 倍。视觉系统能在巨大的光强范围内实施其功能，表明了视觉系统具有惊人的调 节其敏感度去与外界环境相匹配的能力。我们把视觉系统调节光敏感性适应外界光 环境的现象称为视觉适应现象( v i s u a la d 印t a t i o n ) 。暗适应( d a r ka d a p 切【t i o n ) 是视 觉系统调节到全暗或较低水平的过程；明适应( 1 i 曲ta d a p t a i o n ) 是其逆过程【l 】。视 觉适应的研究有助于治疗视觉适应相关的疾病( 如夜盲症) ，其相关机制能够应用 于感光装置的设计。同时视觉适应的研究有助于人们了解神经系统的反馈调节回路。 对于脊椎动物而言，视觉视觉适应涉及几个方面的作用，其中最明显的参与明、 暗适应的机制是瞳孔的直径因光强而变，从而调节到达视网膜的光量。人的瞳孔直 径变化范围是2 8 衄，即使瞳孔面积改变1 6 倍，也只能解释视觉系统巨大的适应光 强范围中极小的一部分。适应的主要机制显然在视网膜和视觉神经通路本身【l 】。视觉 适应既发生在细胞水平也发生在神经网络水平。在细胞水平，发生在从复眼到中枢 神经的各级神经元【2 】2 5 。目前，视觉适应研究集中于感光细胞，主要检测分析单个感 光细胞响应光强变化的过程和特点【3 鼬】。脊椎动物的感光细胞，其视觉适应机制被认 为有两种可能。在视杆细胞外段的各层中，排列着视紫红质，可在光的作用下漂白， 这是视杆细胞暗适应和明适应的光化学基础。因此，有人下结论说，明适应等同于 用漂白来减低视紫红质的浓度，而暗适应则是在无光的条件下重新合成视紫红质。 于是，任何给定的适应水平都代表着漂白和恢复反应之间的一种稳定的平衡状态。 在每一个感光细胞中，该漂白与恢复反应的平衡都将因落在它上面的光量的增减而 被移动【1 ”6 】。然而上述的传统观点到2 0 世纪4 0 - 5 0 年代已不再被人们所接受了。克 劳福特等人指出，很大的阈限变化可能是神经性的而不是光化学性的，因为它们可 以在适应光呈现或消失后不足1 0 0 微秒的时间内发生【7 1 。进一步研究认为，视觉适应 主要是由另外一种机制神经反馈来调节。从感光机制上来看：光照条件下，光 量子为膜盘膜上的视色素分子( 视紫红质) 吸收，遂激活与其偶联的g 蛋白。后者 进一步激活磷酸二酯酶( p d e ) ，p d e 使c g m p 裂解为非活性产物g m p ，结果降低 了c a 旧的水平，导致钠通道关闭，感光细胞超极化。c a 2 + 也是一种光电换能信使， 也可以激活p d e ，进而降低c g 的合成。当光照引起钠通道关闭时，胞内c a 2 + 水 平随之降低，致使p d e 水平降低、g c 活力增高，结果导致c g m p 水平增高。这种 神经负反馈作用可能对感光细胞明适应机制具有重要意义【5 6 s 】。在神经网络水平， 视觉系统的视觉适应状态被认为是受光依赖的神经递质所调节。一部分递质主要调 控视觉系统倾向于明适应，而另一部分递质则调节视觉系统的敏感性倾向于暗适应。 因此，受外界光强变化的影响，相互拮抗的明适应相关递质和暗适应相关递质此消 彼长地释放，引起了视觉系统在明适应和暗适应状态间定向移动。也就是说明暗适 1 东北师范大学硕士学位论文 应状态被光依赖的明暗相关递质所调节【9 1 。研究表明，在斑马鱼的视网膜中加入外源 的多巴胺( d o p a m i n e ) 能引起视网膜的明适应，而褪黑素( m e l a t o i l i n ) 则相反，引 起了视网膜向暗适应方向移动【9 ，1 0 ，1 1 1 2 ，1 3 1 。 昆虫的视觉系统由两个亚系统组成，包括由复眼、视叶构成的主要视觉系统和 单眼( 一般有两到三个) 感光辅助系统，它们的视觉纤维投射到中央神经系统的多 个不同区域。昆虫脑中研究得最为透彻的就是复眼和视叶【1 4 ，1 5 ，1 6 1 7 1 。视叶由三个主要 的神经纤维网区域构成，包括最远端的神经节层，外髓，和离脑中部最近的内髓复 合体。从视网膜到内髓的近端层的神经纤维网都存在清晰的视网膜拓扑图。视觉神 经纤维网中，数根不同的神经纤维组合成柱状或桶状与视网膜中的小眼相联系。这 便构成了神经纤维网的柱状结构( c o l u 衄) 。与视叶中的柱状神经纤维组织结构相 垂直的是神经纤维网的层状结构( 1 a y e r ) ，这些层状结构使得所有的视神经纤维网 都呈有序的分层【1 8 ，1 9 2 0 1 。一般认为柱状结构的神经元主要起传递视觉信号的作用，而 层状结构的神经元则发挥视觉信号的调节功能。在细胞水平，各级神经元均和视觉 适应相关【2 】。视觉适应机制研究得最为透彻的仍然是感光细胞2 1 2 2 2 3 洲。从早期研究 蜻蜒复眼中的感光细胞和二级中继神经元能改变自身敏感性响应光强变化【2 5 1 ，到近 期的研究表明果蝇感光细胞的视觉适应被p l c 下游和钙离子依赖的卸通道抑制介 导的p k c 独立所调控阱】，研究一步步深入。在神经网络水平，暴学祥等研究昆虫 5 h t ( 5 羟色胺) 在昆虫脑中的分布时，观察到不同昆虫视叶中的5 h t 含量有差别。 暗处活动的昆虫( 如蛾) 以及光环境明暗变化频次较高的昆虫( 如蚂蚁) ，其脑中 的5 h t 含量要高于经历明暗变化次数少的昆虫( 如蝴蝶) ，从而推测5 h t 是视觉 适应相关递质。但这个比较并没有在严格控制免疫组化的条件下进行 2 6 2 7 ，2 引。5 一h t 是昆虫中枢神经系统中一种重要的神经递质，由吲哚和乙胺两部分合成，属吲哚胺， 于1 9 4 8 年首次被r 印p o r t 等人从血清中分离出来。其生物合成是以色氨酸 ( 廿y p t o p h 观，t p ) 为前体，在色氨酸羟化酶( 咖t i 叩h 趾h y d r o x y l 勰e ，t p h ) 的作用下生 成5 羟色氨酸( 5 h y d r o x y 奶，p t o p h 跹，5 h t p ) ，然后在5 h t p 脱羧酶 ( 5 h t p d e c a r b o x y l a s e ，5 h t p d c ) 的作用下，脱羧基而生成5 一h t 【2 9 1 。对于5 一h t 在 昆虫脑中的分布，人们已经做了大量的研列3 0 ，3 1 ，3 2 ，3 3 1 。现已证实5 h t 在昆虫中与学 习、唾腺分泌和控制昼夜节律有关【3 2 1 。本实验主要想探究5 h t 和昆虫视觉视觉适应 的关系。 5 h t 的变化可能会影响昆虫视觉系统的视觉适应状态，或者说在昆虫视觉系统 内，5 h t 可能能够调节昆虫视觉系统的明暗适应状态。已有的研究表明，该调节机 制可能有两种方式。首先，我们认为与视觉适应相关的神经递质可能只是在光强变 化的瞬间释放，从而改变相关神经元的视觉适应状态。当外界光强不变化时，神经 递质并不需要释放( 理论一) 。其次，有的理论认为，视觉适应的状态是两种以上 的递质相互拮抗来决定相关神经元的视觉适应状态。使视觉系统倾向于明适应的递 质称为明适应递质，调节视觉系统偏向于暗适应状态的递质称为暗适应递质。视觉 系统的视觉适应状态取决于两种递质的相对释放量，当明适应递质占优势时，视觉 2 东北师范大学硕士学位论文 系统处于明适应状态，反之亦然【12 1 。该理论认为，明暗适应递质要持续释放才能够 维持视觉系统处于适合的视觉适应状态( 理论二) 。总之，这两种理论都表明，视 网膜的视觉适应状态是被光依赖的神经递质改变来调节的。也就是说存在调节视觉 适应状态的递质。日本弓背蚁的光刺激实验主要是依照这两种可能的机制来设计实 验组。 本实验将在相同的免疫组织化学染色条件下，比较不同昆虫视叶中5 一h t 含量的 差别，分析昆虫脑中的5 一h t 是否存在规律性的种间差异，从而验证5 h t 和昆虫的 视觉视觉适应调节相关的假说。为了进一步验证这个假说，我们根据上述两种可能 机制把实验昆虫( 日本弓背蚁) 分成四组分别进行光刺激，然后采用免疫组织化学 结合图像分析的方法，比较各组之间对应神经元的5 h t 含量。根据各组的差异情况 来分析5 一h t 是否和视觉适应有关。同时也期望能够找到一部分可能与视觉适应相关 的神经元。本研究旨在为5 一h t 是与视觉适应相关递质的假说提供支持证据。 3 东北师范大学硕士学位论文 1 1 材料 1 材料和方法 1 1 1 药品 自制c p 包埋剂( i 、i i 、v 、) 、多聚甲醛、叔丁醇、免抗5 h t ( 一 抗) 、免疫组织化学s p 试剂盒，d a b 、多聚赖氨酸、p b s 、苏木精及石蜡切片常规药 品。 1 1 2 设备及用具 手摇切片机、1 0 个5 0 m l 烧杯、冰箱、孵育盒、免疫组化板( 实验室发明) 、石 蜡切片所需的其它设备及m o t i c 显微照相机。 1 1 3 实验动物 黑腹果蝇( 伽s 印办妇朋p 厶聊d g 琊而们、榆紫叶甲m 6 ，f d 朋口g “砌玎坼，陀蟠姗z ) 、异 色瓢虫刀m d 行肠哑矿砘，) 、淡色库蚊( 白概p 勿f g 凇p 口抛珊) 、白斑迷蛱蝶( 朋砌口咖榭口 s 如陀甩c 砌) 各1 6 只，日本弓背蚁( c 口坼，d 刀d 凇7 l 印d 甩f c 淞) 1 3 6 只。黑腹果蝇为东北师范大 学生命科学学院遗传实验室培养，叶甲、异色瓢虫采于东北师范大学校园内。马铃 薯瓢虫、白斑迷蛱蝶采于吉林省辉南县金川镇。日本弓背蚁采于长春市净月潭。 1 2 光刺激比较实验中实验昆虫的分组及光刺激 日本弓背蚁1 2 0 只，分为四组，分别放入细口瓶中用面包饲养。细口瓶用棉花 塞好，保证通气良好。分组情况：1 ) 饲养瓶放在6 0 瓦白炽灯l o 厘米远处，持续光 照射9 天。称为持续光照组。2 ) 饲养瓶放在密闭的大纸箱中，持续黑暗9 天。称为 持续黑暗组。3 ) 饲养瓶放在密闭不透光的大纸箱中，每隔3 0 分钟用放在距饲养瓶 1 0 厘米处的6 0 瓦白炽灯照射3 0 分钟，共持续9 天。称为明暗变化组。4 ) 饲养瓶放 在窗台上，自然光照。称为自然光照组。 1 3 免疫组化及相关条件的控制 1 3 1 前处理 取活体实验昆虫，将其去头后迅速置于4 多聚甲醛( 溶于0 1 m 的p b ) 中，在4 0 c 下固定2 小时( 黑腹果蝇、淡色库蚊) 、3 5 小时( 白斑迷蛱蝶、异色瓢虫、榆紫叶 甲、日本弓背蚁) 。然后用o 1 m 的p b s q h7 4 ) 漂洗三次，每次十五分钟，目的是 将组织表面多聚甲醛充分洗干净。标本在梯度酒精中( 7 0 ，8 0 ，9 0 ，9 5 ， 1 0 0 ) 依次脱水后，将其转移到叔丁醇( t e r t b u t 舳0 1 ) 中3 0 0 c 透明三十六小时。采用 c p 包埋剂( i i ， + ，i i i ，i i n 在5 3 0 c 下进行包埋，时间为2 5 小时( 淡色库蚊、 黑腹果蝇) 、4 小时( 异色瓢虫、榆子叶甲) 、5 小时( 白斑迷蛱蝶、日本弓背蚁) 4 东北师范大学硕士学位论文 【3 4 】。手摇切片机进行连续切片( 6p m ) 并连续展片于涂有多聚赖氨酸( p 0 1 y l l y s i l l e ) 的 载玻片上，晾干备用。 1 3 2 免疫细胞化学 首先将干透的标本切片进行复水，依次经过： 二甲苯室温1 5 分钟 二甲苯室温1 5 分钟 1 2 二甲苯+ 1 2 无水酒精室温5 分钟 无水酒精室温5 分钟 9 5 酒精室温5 分钟 9 0 酒精室温5 分钟 8 0 酒精室温5 分钟 7 0 酒精室温5 分钟 5 0 酒精室温5 分钟 蒸馏水室温5 分钟 p b s ( 0 1 m o ，p h 7 4 ) 室温5 分钟3 次 然后使用s p 试剂盒( 福州迈新生物技术开发公司，不包括一抗和显色剂) ： ( 1 ) 过氧化物酶阻断溶液( 试剂a ) 室温孵育1 0 分钟；( 2 ) 非免疫性动物血清( 试剂 b ) 室温孵育5 分；( 3 ) 1 ：3 0 0 0 免抗5 h t ( s i 肿a 公司，n o s 一5 5 4 5 ) ，用于种间比较实 验或l ：5 0 0 0 兔抗5 h t ( s i 9 1 m 公司，n o s 5 5 4 5 ) ，此抗体浓度用于日本弓背蚁不同 光刺激实验组的比较试验。4 。c 过夜；( 4 ) 次日生物素标记的二抗( 试剂c ) 室温孵育1 0 分钟；( 5 ) 链亲和素一过氧化物酶溶液( 试剂d ) 室温孵育1 0m i n ；( 6 ) d a b ( 3 ， 3 。d i 距血o b e n z i d i i l e ) h 2 0 2 ( 试剂盒d a b 0 0 3 1 1 0 3 1 ，福州迈新生物技术开发公司) 显色 5 1 0 分钟，以上除2 3 步间p b s 洗一次5 分钟外，其他各步间p b s 洗3 次，每次5 分钟。 显色后的标本用蒸馏水洗去多余的显色液，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性 树胶封片，m o t i c 显微镜检片及照相。 1 3 3 对照实验 用p b s 代替一抗同步进行上述免疫细胞化学染色过程，结果为阴性。 1 3 4 免疫组织化学染色相关条件控制 为了进行半定量比较不同昆虫间的5 h t 的相对差别，需要在免疫组化操作过程 中保证各项条件相同。 试剂剂量的控制：每张切片只采用一滴。 试剂作用时间：保证每张切片均相同，时间精确到秒。 采用免疫组化板( 实验室发明) 染色：保证了同一染色批次的所有实验标本都 浸润在等量的试剂中。 5 东北师范大学硕士学位论文 1 4 光密度测量及统计分析 切片在同样的条件下( 相机软件采用相同的参数设置) ，采用m o t i c 显微照相 系统照相，采用i n l a g ep r op l u s6 0 测量切片照相相应区域的灰度值。该灰度值是此区 域所有阳性区域的平均灰度值 d e n s i t ) ，( m e a n ) 】，也就是所有阳性像素的灰度值之和 除于所有的阳性区域像素数。灰度值越小，染色程度越高，也就是5 h t 的含量越高。 灰度值测量的具体程序 打开i m a g ep r op 1 u s6 o ，点击菜单m e a s u r e c a l i b r 撕t i o n i n t e n s i t y 校准 并选择灰度值。点击s y s t e m 按钮，设定此灰度值为系统默认测量单位。 导入需要测量的切片照相，转换切片照片为灰度模式，利用a o i 选择 需要测量的区域( 比如说视叶和前脑中部之间的阳性神经元所在的区域) ， 打开菜单m e a s u r e c o u n t s 也e ， 在打开的对话框中打开m e a s u r e s e l e c tm e a s 唧e m e n t s ，选取 d e n s i 哆( m e 趾) ，点击o k 。点击s e l e c tc o l o r s 按钮，在打开的对话框中点击 h i s t o 斟a mb a s e d 标签，调节要测量的灰度范围使仅覆盖阳性区域。点击c 1 0 s e 按钮关闭此对话框。关闭后上一个对话框( 即c o l l n 以i z e ) 出现。 点击c 0 u n t 按钮，点击v i e w m e 硒u r e m e n td a t a ，此时程序打开 m e a s u 彻n e n td a t a 对话框。选择f i l c d a t at oc l i p b o a r d ，打开s p s s1 4 0 ，粘贴 数据到数据表进行统计分析。 数据以均数士标准差( x 士s ) 表示，运用s p s s l 4 o 进行处理数据和方差分析( 多 重比较l s d 法) 分析数据。显著性检验均于5 水平。 6 东北师范大学硕士学位论文 2 结果 昆虫脑的基本结构大致相同，均由前脑( p r o t o c e r e b m m ) 、中脑 ( d e u t o c e r e b m m ) 、后脑( 订i t o c e r e b m m ) 及咽下神经节( s u b o e s o p h a g e a lg a n g l i o n ) 构成。前脑由前脑叶和视叶构成。视叶是昆虫复眼的基本视觉中心，由神经节层 ( 1 锄i i l a ) 、外髓( m e d u l l a ) 和内髓复合体( 1 0 b u l ac o i n p l e x ) 三个神经区域构成。 前脑叶包括蕈形体( m u s h r o o mb o d y ) 、中央复合体( c e n 仃a lc o n l p l e x ) 及其邻近的 脑区。5 h t 阳性神经元主要分布在视叶和前脑之间，脑中部后背方，以及咽下神经 节等位置( 插图1 ) ，总体数量不多。但5 一h t 阳性神经纤维的分布比较广泛，几乎 分布在整个脑中。视叶中分布非常丰富，在神经节层以及视叶的其他结构中呈层状 分布，反应异常强烈。本实验主要检测的是神经节层中的5 h t 阳性纤维( 插图1 ) ， 视叶和前脑之间的以及前脑中部后背方的阳性神经元。 2 1 六种昆虫脑中特定阳性区域的灰度值比较 在同样的实验条件下，本实验采用免疫组织化学染色技术结合图像分析技术， 测量了六种昆虫脑中神经节层阳性纤维、视叶和前脑之间阳性神经元、前脑中部后 背方阳性神经元的灰度值。昆虫脑中某区域的5 h t 免疫组化染色灰度值能够间接反 映该区域中5 h t 的含量。灰度值越高表明该区域中5 h t 的含量越低。通过对灰度 值进行的多重比较，我们分析了不同昆虫脑中5 h t 的含量差异。 2 1 1四种昆虫脑中神经节层阳性神经纤维的灰度值比较 从图表1 可以看出，不同昆虫的神经节层中5 h t 的含量存在差异。图中不同字 母标记表示相邻两组之间的灰度值在本实验条件下差别达到显著水平。从图1 - 4 中也 可以直观地看到这四种昆虫神经节层灰度值的明显差别。相同的字母标记表示相邻 图表l 不同昆虫视叶孓h t 阳性纤维的平均灰度值比较 7 东北师范大学硕士学位论文 p l 一一 e d l 一豫 插图l白斑迷蛱蝶( a ) 、黑腹果蝇o ) 的水平切脑部结构模式图以及异色瓢虫( c ) 、榆紫叶甲 ( d ) 、马铃薯瓢虫( e ) 、日本弓背蚁( f ) 的额切脑结构模式图。 “x ”示我们所检测的5 - 耵阳性纤维所处位置，即视叶的神经节层中分布的5 一h t 阳性纤维。 第一部分要检测的阳性神经元分布在视叶和前脑之间，第二部分是分布在前脑后背方的阳性神经 元。阳性神经元的大小未按比例绘制，只是标明其大致分布位置。 缩略词：l a ：神经节层( l 觚l i n a ) ；m e ：外髓( m e d u u a ) ；l c ：内髓复合体( i ，0 b u l ac o m p l e x ) ； l 0 ：内髓( l o b u l a ) ；l p ：内髓板( l o b u l ap l a t e ) ；a l 嗅叶( 衄t e 皿a ll o b e ) ；d l ：背叶( d o r s a ll o b e ) ； m b ：蕈形体( m u s h r o o mb o d y ) ；p b ：前脑桥( p r o t o c e 陀b m lb r i d g e ) ；c a ：冠( c a l y c e s ) ；p r 0 ：前脑 0 r o t o c e 他b 砌咖；p ：柄( p e ( h m c u l u s ) ；a l ：a - 叶( a 1 0 b e s ) ；b l ：p - 叶( p l o b e s ) ；c b u ：中央上体( 廿1 eu p p e r d i v i s i o f t l l ec 即觚lb o d y ) ；c b l ：中央下体( t 1 1 e1 0 w e rd i v i s i o no f t h ec 锄仃a ib o d y ) ，f b ：扇形体 ( 果蝇的中央上体) ；e b 椭圆体( 果蝇的中央下体) 模式图a 、c 、d 、f 比例尺：l o o 肛m ；模式图b 、e 比例尺：2 5 “m 。 8 东北师范大学硕士学位论文 两组之间的灰度值在本实验条件下差别不显著。白斑迷蛱蝶神经节层的平均灰度值 显著高于其他三种昆虫，说明白斑迷蛱蝶神经节层的5 一h t 含量在四种昆虫中最低。 榆紫叶甲的灰度值则显著高于日本弓背蚁，说明榆紫叶甲神经节层的5 h t 含量应该 低于日本弓背蚁。异色瓢虫和日本弓背蚁的灰度值差异不显著，说明这两种昆虫神 经节层中的5 h t 含量无差别。 2 1 2 六种昆虫视叶和前脑之间阳性神经元灰度值比较 从图表2 中可以看出，不同昆虫脑中视叶和前脑之间阳性胞体的灰度值存在差 异，从图5 1 0 的比较也能直观地看到此差异。白斑迷蛱蝶的灰度值显著低于其他昆 虫，说明其视叶和前脑之间的阳性神经内5 h t 的含量最低。榆紫叶甲、异色瓢虫和 黑腹果蝇脑三者差异不显著，说明三者视叶和前脑之间的阳性神经内5 h t 的含量无 差异。淡色库蚊和日本弓背蚁两者之间差异不显著，但是它们都高于其他四种昆虫。 说明淡色库蚊和日本弓背蚁视叶和前脑之间的阳性神经内5 h t 的含量最高。 2 1 3 六种昆虫前脑中部后背方阳性神经元的灰度值比较 从图表3 中可以看出，不同昆虫脑中部的阳性神经元的灰度值存在差异，肉眼 观察图1 1 1 6 也能看到该群阳性神经元染色深度不同。白斑迷蛱蝶的灰度值依然最 高，说明白斑迷蛱蝶脑中部5 h t 阳性神经元内5 一h t 的含量显著低于其他六种昆虫。 榆紫叶甲和黑腹果蝇差异不显著，但榆紫叶甲的灰度值显著高于异色瓢虫，说明榆 紫叶甲脑中部阳性神经元中5 h t 的含量显著低于异色瓢虫。日本弓背蚁的灰度值仅 高于淡色库蚊，说明日本弓背蚁脑中部阳性神经元中5 h t 的含量仅少于淡色库蚊。 淡色库蚊脑中部阳性神经元内5 h t 的含量最高。 2 2 各实验组日本弓背蚁脑中特定阳性区域的灰度值比较 日本弓背蚁分成四组，分别测量四组昆虫视叶神经节层的5 h t 阳性纤维的灰度 值，以及视叶和前脑之间5 h t 阳性胞体的染色深度，前脑中部后背方的5 h t 阳性 9 东北9 币范大学硕士学位论文 胞体的灰度值。从图表4 中可以看出，同一个系列中5 h t 的灰度值统计上差异不显 著，肉眼观察图1 9 2 8 也看不到差别。也就是神经节层阳性纤维、视叶和前脑之间阳 性神经元胞体以及前脑中部后背方阳性神经元胞体的5 h t 浓度在各组间差别不显 著。 图表4日本弓背蚁不同刺激组之间5 - h t 染色深度比较分析。 1 0 东北师范大学硕士学位论文 3 讨论 昆虫的视觉系统由两个亚系统组成，一个是复眼和复眼内侧的视叶，另一个是 大多数物种中存在的两到三个单眼。昆虫脑中研究最为透彻的就是复眼和视叶 【1 4 ，1 5 1 6 】。复眼和视叶分布在前脑的两侧，占据了整个脑很大的比重。其结构比较复杂， 其中分布着种类很多的神经递质，共同承担着复杂的功能【2 9 】。5 h t 是昆虫视叶中的 一种重要递质，在视叶的神经纤维网中呈现分层分布。这说明5 h t 在视觉信息的加 工和调节过程中起重要作用【3 0 1 。已有的研究表明5 一h t 可能参与调节昆虫视觉的精确 性或视觉中间神经元的活性，并与昼夜节律的调整有关【3 5 1 。近年来，暴学祥等用免 疫组织化学技术标记昆虫脑中5 一h t 分布时，比较了不同昆虫脑中5 h t 的差别，提 出5 h t 可能与昆虫的视觉适应有关。但此假说的提出并非基于相同的免疫组化控制 条件【2 6 2 7 2 踟。本实验在相同的免疫组化染色条件下，通过测量阳性区域的平均灰度值， 分析比较六种昆虫脑中特定区域5 h t 含量的相对差别；为了进一步验证次假说，我 们设计了日本弓背蚁的光刺激实验。 3 1种间比较支持5 h t 是一种视觉适应相关递质 种间比较数据表明，六种昆虫脑中5 - h t