（光学专业论文）紫外线对细胞dna损伤与损伤中钙离子信号变化的荧光检测分析.pdf

摘要u v 是对生物体造成损伤的最基本的环境因r 之一。检测小鼠旰细胞经u v a 、u v b 、u v c 三种不同波段的紫外线处理后的细胞d n a 损伤程度j 损伤过程中的 c a 2 + 1 i ，旨在确定生物体损伤程度与u v 波长和照射剂量之间的天系，对于研究u v 损伤机理具有重要意义。本文论述了生物细胞的d n a 损伤的类型和成因，介绍了检测损伤的各种方法，探讨了细胞d n a 损伤过程中的c 赶2 + 信号的作用机理，并进行了大量的实验论证。实验中采用的是单细胞凝胶电泳法，分别检测了小鼠肝细胞经u v a 、u v b 、u v c 三种不同波段的紫外线处理后的细胞d n a 损伤程度、不同剂量的u v 对细胞造成的d n a 损伤程度，用比率荧光检测法测定了在u v 损伤过程中小鼠肝细胞 c a ! j i 。其结果表明：u v 能否对细胞d n a 造成损伤主要取决于u v 的波氏( 或频率) ；u v 的照射能量与其造成的细胞d n a 损伤程度呈止相关；对细胞造成d n a 损伤的u v 具有低能量闯值和高能昔平台；在u v 损伤过程中 c a 2 + 1 会升高，其随时问波动的振幅和频率会发生变化。上述结论在u v 诱导的细胞d n a 损伤与修复的机理研究与应用中具有实际意义。关键词紫外线光电效应能鼍辐射闽值小鼠肝细胞单细胞凝胶电泳比率荧光 c a 2 + 。a b s t r a c tt h r o u g he x a m i n i n gt h ed n ad a m a g ea n dt h ec a ”d e n s i t yo fr a th e p a t o c y t e ，w h i c hw a si r r a d i a t e db yt h r e ek i n d so f d i f f e r e n tw a v eb a n d so fu v , t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ed n ad a m a g el e v e la n dt h ei r r a d i a t i v ed o s a g eo fu vw a sd e t e r m i n e d c a 2 + 】id u r i n gt h ed a m a g ew a sd e t e c t e d t h e nt h em e c h a n i s mo fu vd a m a g ea n dr e p a i rw a sr e v e a l e d b e s i d e st h et y p e sa n dt h er e a s o n so ft h ed n ad a m a g e0 1 1b i o l o g yc e l l ，t h ev a r i o u sm e t h o d su s e dt od e t e r m i n et h ed a m a g ew e r ei n t r o d u c e d ，a n dt h em e c h a n i s mo fc a 2 +s i g n a l sa c t i o ni nt h ep r o c e s so ft h ed n ad a m a g ew a sa n a l y z e d u s i n gs i n g l e c e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t h ed n ad a m a g ew a ss t u d i e dw h e nt h es m a l lr a tl i v e rc e l lw a si r r a d i a t e db yd i f f e r e n tw a v eb a n d sa n dd i f f e r e n td o s a g eo fu v c a 2 + 】iw a st e s t e db yr a t i of l u o r e s c e n c ei m a g i n gs y s t e m a n a l y z i n gt h ed a t ao ft h et e s t s ，t h eg r a p ho fr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed e g r e eo fd n ad a m a g ea n dt h eq u a n t i t yo fd i f f e r e n tu v sw a v e l e n g t hw a sd r a w no u t t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ：( 1 ) w h e t h e rt h eu vc a nd a m a g et h ed n al i e so nt h eu v sw a v e l e n g t h ( o rf r e q u e n c y ) ；( 2 ) t h ei r r a d i a t e de n e r g yo fu vi s i nd i r e c tp r o p o r t i o nt ot h ed e g r e eo ft h ed n ad a m a g e ；( 3 ) t h e r ei st h ef e a t u r eo fh i g he n e r g yf l a ta n dl o we n e r g yt h r e s h o l dv a l u ei nt h eg r a p h ；( 4 ) c a 2 + 】iw i l lr i s ed u r i n gt h ed a m a g e t h ea m p l i t u d ea n dt h ef r e q u e n c yw i l lv a r yw i t ht i m e k e y w o r du v ；p h o t o e l e c t r i ce f f e c t ；r a d i a t i o ne n e r g yt h r e s h o l dv a l u er a th e p a t o c y t e ；s i n g l e c e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ；r a t i of l u o r e s c e n c e ； c a 2 + 】西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：扣f 。指导教师签名：兰叁塑易和f 年6 月孑日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：黼知万年6j j 帛1|第一章引言生物体的新陈代谢和生k 发育差要受遗传信息及环境变化信号的凋1 7 与控制。遗传基因决定代谢霸i 生长发育的基本模式，但这一基本模式如何形成却在很人群度j 一受控于环境的变化，其中，对二】二细胞而言，环境变化所构成的信息包括生物体的外界耶境和体内环境信息两个方面。在遗传密码破译及转录、翻译的基本规律获得突破之后，如何控制细胞的基因表达及细胞的增殖、分化与发育就成为生物学研究中的最大挑战，环境信息在这些过程中起着重要调节作用。1 0 0 多年前，法国生物学家c l a u d eb e r n a r d就对生物参数的稳定性有深刻的感悟，他认为：“内环境的恒定性是有机体自由和独立生存的基本条件”。当外界环境或有机体本身状态改变时，内环境的恒定即可能遭到破坏，如果细胞不能进行调节控制和恢复恒定，生物体就不可能生存下去【孙大业，1 9 9 l 】。细胞对内环境的调控过程依赖于细胞遗传信息的表达与调控。遗传信息贮存于d n a 分子之中，d n a 分子的碱基序列决定了生物的遗传性状。d n a 复制过程严格遵守了碱基配对规律，子链是母链的准确抄本。如果生物体的内外环境中存在着一些造成d n a 损伤的因素，将引起d n a 碱基序列的改变甚至链的断裂，即d n a 的损伤。这种突变事件将会造成生物个体的衰老、疾病以及癌症。对于单个细胞，这些损伤可以通过细胞的自我修复机制自行修复，以恢复正常功能，如果损伤严重，细胞将不能通过自我修复机制修复，结果导致细胞的凋亡或坏死。1 1 引起d n a 损伤的因素根据使d n a 损伤因素特点，可将其分为环境因素引起的损伤与自发性损伤两大类。1 1 1 环境因素弓l 起的损伤能够引起d n a 损伤的环境因素可归纳为物理、化学和生物三大类。1 1 1 1 物理因素1 紫外线波长在1 0 0 n m 4 0 0 n m 之间的电磁波被称之为紫外线，其中波长低于2 0 0 n m 部分为真空紫外，在空气中被迅速吸收，无法传播；波长为2 0 0 n m 4 0 0 n m 之间的紫外光按照波k 被分为三类，即u v a ( 3 2 0 n m 4 0 0 n m ) 、u v b ( 2 8 0 n m 3 1 9 n m ) 、u v c ( 2 0 0 n m l2 7 9 n m ) 。其中u v c 波长具有较强的杀菌作用，被广泛用于医院、生物实验室和学校等地方的消毒光源。日光中的紫外线主要在2 9 0 r i m 以上，低于2 9 0 r i m 的紫外线被臭氧层吸收而难以到达地面。紫外线能够引起细胞的光氧化损伤，产生疾病如非黑色素瘤皮肤癌、晒斑细胞和皮肤的光老化。日光中的致癌与凋亡效应主要由u v b 引起。实验表明，能龟仅为1 7 7 6 j m 2 的u v b 就能引起正常人成纤维细胞的凋c 二 郭坤，2 0 0 3 ，u v c 照射1 0 m i n能够引起体外培养的平滑肌细胞出现典型的凋亡形态学及细胞各类生化指标的改变，同时引起细胞内c a 2 + 浓度的快速升高【李晓丹，1 9 9 9 。1 2 5 , - - 6 2 5 j m 之的u v b 照射剂量可诱导人永生化角质形成细胞( m a c a t 细胞) 的凋亡以及引起细胞钙稳态的失衡李沛波，2 0 0 4 。从分子化学机制上看，紫外线可以引起d n a 链上两个邻近的胸腺嚏啶发生二聚化，生成胸腺嘧啶二聚体( 图1 1 ) ，其他的嘧啶碱也能形成类似的二聚体，但以胸腺嘧啶最易形成。嘧啶二聚体的形成将使r n a 转录在二聚体处中止，d n a 复制也可能在此受限。一、8 n ：。兰絮冬h “丽声一弋，、光复活奉科夕一、：划图1 1 嘧啶二聚体的形成和解聚2 电离辐射电离辐射( 包括q 、1 3 射线和x 射线) 引起的d n a 损伤是多方面的，大剂量时可引起链中磷酸二酯键的断裂或脱氧核糖与碱基的共价键的断裂，而使碱基脱落。1 1 1 。2 化学因素1 烷化剂如硫酸二甲酯、芥子气、氮芥和甲基硝基亚硝基胍( m n n g ) 等都属于烷化剂，它们都是亲电子化合物，其分子中都带有一个或多个活性烷基( 活性甲基或乙基) ，可2转移到d n a 分子中的碱基上或主链的磷酸基上。4 种碱基中最易被烷化的是鸟嘌呤。磷酸基团被烷化的后果是生成不稳定的磷酸三酯，致使糖基和磷酸之间的酯键水解而造成d n a 链的断裂。2 碱基或核瞢类似物如5 氟尿嘧啶、6 巯基嘌呤等，它们由于竞争性的抑制而阻断了正常嘌呤或嘧啶核苷酸的生物合成：另一方面它们变成相应的核苷酸后可以掺入到d n a 或r n a 链中，从而干扰了复制，转录和翻译。3 亚硝酸盐和亚硝胺亚硝酸盐可使胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤脱氨，分别成为尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤，于是发生碱基错配。例如胸嘧啶原与g 配对，脱氨成为尿嘧后则将与a 配对。亚硝酸盐还可以和一些仲胺化合物作用生成亚硝胺，亚硝胺在体内经混合功能氧化酶的作用可生成烷化剂，例如二甲基亚硝胺再生成重氮甲烷和自由甲基。4 代谢活化的化学物质有些化学物质本身并不引起d n a 的突变，但进入体内经过代谢后，可转变成能够和d n a 起反应的物质，即能造成d n a 损伤而引起突变的物质，例如n 2 乙酰2 氨基钳( n 2 a c e t y 一2 一a m i n o f l u o r e n c e ，a a f ) 、苯并芘( b e n z p y r e n e ) 以及黄曲黄毒素( a f l a t o x i n ) 。1 1 1 3 生物因素主要是d n a 肿瘤病毒和r n a 肿瘤病毒，它们可以插入宿主细胞的基因组d n a 中而引起细胞癌变。1 1 2自发性损伤自发性损伤是指目前尚未找到的特异环境因素所致的d n a 损伤，主要有以下几种类型。1 1 2 1d n a 复制时的碱基错配即使在正常生理条件下，d n a 复制也会发生碱基的错配。正确配对所需自由能约为& 3 6 k j m o l ，非互补的错配则为1 2 4 k j m o l ，按计算错配频率可达约l 。但实际l ：测得大肠杆菌d n a 复制时的错配频率要低得多，仅为1 0 。1 ，这说明生物体内有着增加复制精确性的机制。1 1 2 2 互变异构现象构成d n a 的四种碱基有环外一n h 2 或c = 0 ，这些基团均位于杂环上n 原子的邻位因此有n h 2 与= n h 和c = 0 与c o h 的互变异构现象。在生理条件下，d n a 中的碱基主要以n h 2 和c = o 形式存在，但有时也会出现其互变异构体而导致错配。1 1 2 3 碱基脱氧构成d n a 的4 种碱基除胸腺喻啶外，其他3 种都有环外一n h 2 ，容易自发丢失。胞嘧啶脱- n h 2 成为尿嘧啶，腺瞟呤脱- n h 2 成为次黄嘌呤，鸟嘌呤脱氨成为黄嘌呤，这样便可能在d n a 复制时产生错配，例如腺嘌呤本应与胸腺嘧啶配对，而当因脱氨成为次黄嘌呤时，却与胞嘧啶配对丽造成突变。1 1 2 4 碱基丢失指d n a 链上的脱嘌呤或脱嘧啶作用。据测定，每个大肠杆菌基因组每代约丢失一个嘌呤，哺乳动物细胞的基因组比原核生物大得多，复制时间也长得多，估计每个细胞每代约可能丢失1 0 0 0 0 0 个左右的嘌呤。嘧啶与脱氧核糖之间的糖苷键比嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键要稳定得多，因此嘧啶的丢失率只有嘌呤的丢失率的1 2 0 ，不过每个哺乳动物细胞每代也要丢失数百个嘧啶。1 2 检测d n a 损伤的常用方法1 2 1 细胞的形态学评价细胞因受到外界环境的刺激而导致d n a 损伤后，无论是被细胞自身修复，还是走向凋亡或坏死，都会在细胞形态上与正常细胞有所差异。凋亡最初就是在形态学评价的基础上定义的。例如，在凋亡期间，细胞线粒体通常保存完好，而细胞核发生染色质凝聚和边缘化，染色质断裂，细胞收缩，与相邻细胞分离，细胞膜出现小泡，最后整个细胞如出芽般产生大小不同的凋亡小体。有实验表明，经u v 处理后贴壁培养的人类肌纤维细胞由梭形变为圆形，而且细胞悬浮率升高【倪建华，2 0 0 4 3 。该方法一般需采用染色和光学荧光显微术。常用的染色有：l e u k o s t a t 染色、h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色和吖4啶橙溴化乙锭( a o e b ) 染色。该方法简单、快速、但主观性较强，检测灵敏度低可靠性较差，同时高度依赖于操作者的经验。1 2 2 微核技术微核由无着丝点的染色体断片组成，由于缺乏着丝粒，这种染色体断片在有丝分裂后期不能向两极移动而游离于细胞质中，在细胞分裂末期细胞核重建时，可在核的附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1 2 0 1 5 ，染色特征与细胞核相似，此即为微核。细胞中的微核有两个来源，一是断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中；二是有丝分裂器的变化使个别染色体或带着丝粒的染色体环、断片在细胞分裂后期滞留在原位。微核是常用的遗传毒理学指标之一，显示染色体或d n a 的损伤。由于该损伤会因外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又与诱变因子剂量的强弱成比例，因此可以用微核出现频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。微核实验方法是一种不需要特殊试剂及设备的快速而简便的遗传环境毒理的检测方法。因此微核实验是目前国内外评价化合物和空气、士壤、水质等环境中污染物遗传毒性的必测项目，也是监测职业暴露人群遗传性损害的重要指标。微核实验方法的缺点是灵敏度较低。1 2 3 单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳又称彗星电泳，是在单细胞水平上快速、灵敏地检测d n a 损伤的荧光成像技术 o s t l i n g ，1 9 8 4 ；s i n g h ，1 9 8 8 】。包埋在低熔点琼脂糖胶体里的细胞在高盐溶液中被裂解后，在碱性条件下通过解旋使d n a 螺旋双链被打开，在碱性溶液中电泳，带负电荷的d n a 断片在电场中向阳极移动，采用荧光染料染色并通过荧光显微镜观察，受损伤的细胞呈彗星样，具有一个较亮的彗星头部和弥散的彗尾，彗尾部分代表了d n a单链断片、碱性不稳定点以及与切除修复后的d n a 单链碎片。通过计算和分析彗星的相关参数，可检测d n a 的损伤程度。该方法被广泛的应用于细胞毒性、基因毒性和d n a 与蛋白质交联的检测以及环境监控。1 3d n a 损伤中的钙信号1 0 0 多年前，人们已经开始注意到c a 2 + 在生物学上的重要性。1 9 4 0 年c u t t m a n 提出c a 2 + 对生物膜起稳定作用，认为c a ”在较高浓度时，起到稳定膜结构的作用。h e r i b r u n n 提出c a 2 + 的细胞效应有：促进细胞长期黏合和胞间通讯；影响酶活性，如a t p 酶，乙酸酶；调节细胞膜的透性；调节细胞分裂；控制细胞的代谢活动：调节细胞溶质中溶胶。凝胶状态转变；细胞内高浓度的c a ”可能造成细胞死亡。从1 9 6 7 年美籍华人张槐耀在动物细胞中发现钙调素，即c a ”的多功能受体蛋白质后，人们才真正开始对c a 2 + 的作用机理有了深刻的认识，提出了c a ”也可以像c a m p 一样作为细胞内的第二信使起作用，参与调控许多细胞和组织的生理活动，包括肌肉收缩，新陈代谢，分泌及细胞分裂等【c h a n g d ce t a l ，1 9 9 5 ；x u ne ta l ，2 0 0 3 。在静息生理状态下，细胞内的钙离子浓度总是保持在极低的水平，约为1 0 一1 0 7 m o l l 。细胞内外的钙离子浓度差值约l o 倍。当遇到相应的刺激时，细胞会通过多个途径瞬间提高胞内局部或全部的钙离子浓度。1 9 7 4 年f l e k e n s t e i n 等提出钙离子参与某些重要的细胞死亡过程，随后的研究中，人们进一步证明了细胞内钙离子浓度的增加可能导致细胞死亡，但钙离子浓度升高所导致的细胞死亡究竟是坏死( n e c r o s i s ) 还是凋亡( a p o p t o s i s ) 当时并不清楚。其后，随着人们对细胞凋亡理解的不断深入，逐渐意识到钙离子可能参与凋亡的进程。m e l o n k e y与o r r e n i u s 的研究小组在早期用多种凋亡诱导荆和细胞模型所进行的工作表明，核酸内切酶的激活与细胞凋亡依赖于细胞质中持续的钙离子浓度升高f m c c o n h e y ，2 0 0 0 。他们的工作报道后不久，在许多其它细胞凋亡实验中也得到了类似的结果【s z o n d yz ，1 9 9 4 ：k o b a y a s b in ，1 9 9 7 ；k i m u r ac ，t 9 9 8 。2 0 0 1 年，张东才等人为了说明细胞内的钙离子是否参与了凋亡调控这一问题，采用不同类型的钙离子信号阻滞剂对紫外线和过氧化氢所诱导的凋亡进行研究，结果表明，阻止细胞质内钙离子浓度的升高可以显著抑制细胞凋亡，表明细胞质中的钙离子浓度升高可能是细胞凋亡的原因【p uy ，2 0 0 1 ；郭静，2 0 0 5 。钙信号参与了广泛的细胞生理过程的调控，其在细胞中的可变性与多样性由时空区域的分隔造成z a e e o l oe ta 1 ，2 0 0 2 。胞内钙离子浓度的时空变化形成了钙信号，而钙离予浓度的变化是质膜或内质网膜上钙通道激活的结果。膜上钙通道的激活能造成【c a 2 + 】i 突然增加，细胞质中的游离 c a 2 + 】i 因为钙泵和交换因子迅速降低。胞浆内游离 c a 2 + 1 i 的升高可激活邻近内质网上的钙离子释放通道，然后形成可传播的钙波。钙波的空间形式，即其振幅、频率与持续时间对于细胞功能的凋控而言十分重要。最近的研6究表明钙通道与钙泵在转换器与靶目标之间的共定位对细胞增殖而言是基本条件之一【b a d i n ge ta 1 1 9 9 3 ；d o l m e t s e he ta 1 ，1 9 9 7 ：d o l m e t s c he ta 1 ，2 0 0 1 ；g o m e ze ta 1 ，2 0 0 2 ：s t e v e n s o ne ta 1 ，2 0 0 1w e s te ta l ，2 0 0 i 】。1 4 研究目的及意义紫外线是造成细胞损伤最常见的物理因子之一，其波长范围介于致电离辐射与非致电离辐射之间，它的不同波段对生物体能造成不同影响。在日常生活中，太阳光、水银灯、目光灯、白炽光源、电焊、电脑显示器、医院和实验室的消毒粒置都会产生不同波段的紫外线，这些紫外线都会或多或少的对人类及地球生物造成影响。就日光而言，当臭氧层减少1 0 时，将使波长小于3 0 0 n m 的紫外线到达地球的量增加一倍。随着人类经济的高速非理性的发展，臭氧层变得越来越稀薄，日光中的紫外线含量将大幅增加。因此，研究不同波段的紫外光对生物细胞的损伤度、损伤的能量闽值以及损伤后的细胞修复机制具有非常重要的理论与实践意义。单细胞凝胶电泳是一种检测细胞d n a 微量损伤的方法，其灵敏度高、需时短、花费少、能够精确检测到细胞中d n a 断片的含量以及d n a 碱性不稳定点等细胞中的d n a 损伤。用单细胞凝胶电泳技术检测u v 对细胞d n a 损伤能够比较精确地渊定小同波段的u v 对细胞的d n a 造成的损伤程度、u v 的照射强度与细胞d n a 损伤程度的关系，以及被u v 照射的细胞经孵育后的损伤修复情况。细胞受到外界刺激后，能够产生一系列信号，引起相应的细胞生理反应和诱导基因表达。钙离子作为细胞中最重要的一种信号物质在细胞凋亡与修复机制中参与调控。目前对于钙离子通道的受体、钙信号转导机制的研究是细胞生物学前沿领域的一个研究热点。在u v 诱导的细胞d n a 损伤与修复过程中，钙离子信号具有不容忽视的作用。通过对细胞内钙离子信号的捡测，可了解u v 对细胞d n a 损伤及损伤修复的内在机理。本文通过单细胞凝胶电泳技术检测原代培养的小鼠肝细胞经不同波段的u v 处理后d n a 的损伤程度以及损伤过程中伴随的钙信号，企图了解紫外线对细胞的影响和作用机制。第二章单细胞凝胶电泳技术简介许多检测d n a 损伤的技术大多针对细胞的生物效应，例如微核、突变，结构性染色体畸变等。最常用的方法有单细胞d n a 修复合成的检测( u d s ) 技术和用来检测d n a 单链断裂( s s b ) 和碱性不稳定点( a l s ) 的多细胞碱性洗提分析( a l k a l i n ee l u t i o na s s a y ) 。由于这些技术本身会导致d n a 损伤，因此其应用受到很大限制，其中u d s技术能够检测某些类型的d n a 损伤的切除修复以及d n a 修复情形，这一技术也能提供单细胞水平的信息，但是检测灵敏度不高，且需使用同位素，给环境造成潜在的污染。碱性洗提法分析检测的是细胞群体，该方法对细胞有很高的同质性要求，这种细胞群体很难获得，且该技术无法检测同类细胞中不同细胞问的差异。单细胞凝胶电泳( s i n g l e c e l lg e le l e c t r o l p h o r e s i s ，s c g e ) 技术的出现克服了以上缺点，因为电泳过程中带有负电荷的不同大小的d n a 片段向阳极移动的位移不同，使得经荧光染料染色后获得的图形状如彗星，所以该技术又名彗星电泳( c o m e t a s s a y ) 。2 1 单细胞凝胶电泳发展历史1 9 8 4 年，o s t l i n g 和j o h a n s o n 首先发明了微电泳凝胶技术，该技术主要用于单细胞水平的d n a 损伤检测。人们将溶在胶体中的细胞凝固在载玻片上，用去垢剂和高盐溶液裂蠢翠细胞通过裂解使束缚于细胞核中的d n a 在中性溶液中电泳。如果d n a 双链有断裂，电泳中的d n a 断片就朝其中一个电极移动，形成尾巴( 彗尾) ，通过溴化乙啶( e b ) 染色后用显微荧光光度计测量荧光强度，从而检测d n a 双链的损伤程度。该技术常常受限于分析工具的灵敏度【o s t l i n g 1 9 8 4 】。1 9 8 8 年，s i n g h 等人改进了上述的中性电泳技术，发明了碱性微凝胶电泳技术，该技术是在碱性溶液中( p h 1 3 ) 电泳，在单细胞水平上检测d n a 单链断裂( s s b ) 、与修复切除相关的s s b 和碱性不稳定位点【s i n g h ，1 9 8 8 。碱性彗星电泳能够很灵敏地检测细胞d n a 损伤【o l i v e ，1 9 9 0 】。2 2 单细胞凝胶电泳特点与其他d n a 损伤检测的方法相比，该技术的优点包括：( 1 ) 检测灵敏度高，能够很灵敏地检测到低水平的d n a 损伤嚣( 2 ) 需要的细胞样品数量少；( 3 ) 实验中操作步骤较灵活，可以通过调整某一步骤中的参数值来检测不同的d n a 损伤，实现不同的检测目的；( 4 ) 实验花费少；( 5 ) 操作容易；( 6 ) 完成实验所需要的试剂种类少：( 7 ) 检测所花费的时间短，一般在一天内就可得到实验结果。在过去的十几年中，彗星电泳已经成为检测基因毒性的最基本的工具之一。其应用主要包括：一种很有潜力的高通量的图像分析方法；在机理上能够区分基因毒性和细胞毒性诱导的染色体损伤；研究基因毒性和非基因毒性之间的区别【t i c e ，1 9 9 1 ：m c k e l v e ym a r t i n ，1 9 9 3 ；f a i r b a i m ，1 9 9 5 ；a n d e r s o n ，1 9 9 8 ；r o j a s ，1 9 9 9 ；s p e i t t1 9 9 9 】彗星电泳能用做梭测可能存在的人类基因诱变剂和致癌剂 a n d e r s o ne ta l ，1 9 9 8 。例如，采用彗星电泳检测牙科材料中的树脂分子对人类淋巴细胞的基因毒性和细胞毒性 n o r b e r th k l e i n s a s s e r ，2 0 0 4 、7 射线诱导的人类白血球细胞的d n a 损伤 r a m e s hc c h a u b e y ，2 0 0 i 、x 射线对人类淋巴细胞的基因毒性【j l - h e ，2 0 0 0 】、甲苯对人类外周血淋巴细胞的d n a 损伤【i s m e t ，2 0 0 4 、电磁波诱导的人成纤维细胞的d n a 链断裂 s a b i n e ，2 0 0 3 】等。这些实验都利用彗星电泳检测到了损伤的阳性结果，尽管还无法从这些诱变剂和致癌物质的化学特性上正确解释它们对生物不同损伤程度的原因。按照电泳时溶液的p h 值的差别，彗星电泳可以分为几种，每一种都有其独特的检测窗口，目前最常用的为p h 1 3 的碱性单细胞凝胶电泳。这是因为在p h 1 2 时d n a双链之间的氢键能被打开而使其解旋；在p h 1 2 6 时，d n a 链上的碱性不稳定点( a l s ) 能够迅速断裂【k o h n ，1 9 9 1 1 。因此，p h 1 3 的碱性彗星电泳除了能够像中性电泳一样检测到双链d n a 断裂，还可以检测到d n a 单链断裂、碱性不稳定点、与切除修复相关的d n a 断裂、d n a d n a 交联和d n a 一蛋白质交联等。2 3 单细胞凝胶电泳主要步骤彗星电泳的步骤主要包括细胞胶片的制作；细胞裂解：细胞d n a 的碱性解旋( p h 1 3 ) ；碱性电泳( p h 1 3 ) 1 中和：脱水：( z ) d n a 染色和图像采集，9彗星图像数据分析与计算。这些步骤中，每一步都很重要，改变其中任何一步的实验条件或实验参数，都可能得到不同实验结果，因此在实验中必需严格控制每一步操作。2 3 1 细胞胶片的制作该操作步骤是将含细胞的低溶点琼脂糖稳定的凝固在基质材料上，使细胞胶片在裂解、解旋、电泳、中和，脱水到图像采集的整个过程中不会脱落，并尽可能降低背景的信号噪声。目前常用的基质材料为普通的载玻片、磨砂玻璃的载玻片和特制的彗星电泳专用载玻片【k l a u d ee ta l ，1 9 9 6 。胶体的层数可以是一层、二层或三层，其中一层胶体的制作中，被检测的细胞均匀溶于低溶点琼脂糖后直接涂在载玻片上，使之凝固；二层胶体制作流程是先在载玻片上镀一层常熔点琼脂糖以加大载片的吸附力，凝固后再把溶有细胞的低熔点琼脂糖凝结于其上；三层胶体的做法又叫三明治制胶法，它是在二层胶体的上面再加一层常熔点琼脂糖，填住第二层胶体中存在的空穴。细胞胶片的制作是彗星实验的难点，实验中采用的是两层胶体的方法。首先采用镀膜法在载玻片上镀第一层常熔点琼脂糖，即把清洗干净的载玻片浸没在常熔点琼脂糖溶液中，然后慢慢匀速提出载片，使载片上均匀的吸附一层常熔点琼脂糖，镀好常熔点琼脂糖的载片需要在室温下使之凝固，也可在4 0 5 0 的烘箱中使之凝固。第二层胶体由细胞悬液和低熔点琼脂糖构成，我们使用适当大小的3 张盖玻片在上述镀膜的载片上搭建一个模具，把第二层胶液灌入模具中，放入4 c 冰箱使之凝固后小一t l , 移去盖片，使第二层胶体平整而光滑的凝固在镀膜的载片上。胶的浓度是一个很重要的参数，若浓度太低会影响其凝固，而浓度太高会影响电泳时d n a 的迁移，低溶琼脂糖的浓度常选用0 5 一1 0 0 6 ，常熔点琼脂糖的浓度一般为1 5 。细胞在胶体中的密度也是一个很重要的参数，密度太大会导致彗星图像互相重叠而无法采集数据，适当的细胞密度需要预实验来确定。2 , 3 2 裂解( l y s i s )胶体凝固之后，载片需要放置在裂解液中裂解至少1 个小时，其目的是为了裂解细胞以除去与d n a 紧密结合的蛋白质，使断裂的d n a 小片段从核中游离出来。裂解液的主要成分是高盐和去垢剂，它们使蛋白质发生变性，膜脂被抽提，维持膜结构稳定性的作用力丧失，细胞膜发生破裂，并且细胞内的大部分物质溶解，扩散到裂解液中。与d n a 相结合的蛋白质在高盐作用下与d n a 分离，也扩散到裂解液中。早期裂l o解液的成分包括：e d t a1 0 0 m m ( 乙胺四乙酸) ，氯化钠( n a c l ) 2 5 m ，i 肌苷酸钠( n 1 a u r o y l s a r c o s i n e ) ，1 0 m mt r i s ，把p h 值调至1 0 0 ，临用前加入1 t r o n x 1 0 0s i n g h ，1 9 8 8 。后来，t i c e 在其中增加了1 二甲基亚砜( d m s o ) 用来阻止在裂解过程中溶液中的金属( 阳) 离子对d n a 引起的辐射损伤【t i c ee ta l ，1 9 9 1 】。也有文献报道裂解液中不需要肌肝酸钠因为t r i t o nx 一1 0 0 已经可以让细胞裂解【m c k e l v e y m a r t i ne ta l 。1 9 9 3 。为了保证胶体的凝固状态，裂解液在使用前应存放在4 c 冰箱中。裂解时间根据细胞的类型有所不同，为了使d n a 充分摆脱细胞核的束缚，每种细胞需要一个最短的裂解时间，但是裂解时间过长会给d n a 造成损伤，增大背景噪声，通常1 个小时的裂解比较合适，在裂解液中加入广谱蛋白酶k 能够降解裂解下来的蛋白质。2 3 3 水洗裂解完的胶片上残留着大量的裂解液，如果在裂解后不及时除去，实际上等于延长了裂解时间，在电泳时会影响电泳液中的离子浓度，从而影响电泳时电泳槽中的电场分布。由于裂解液粘稠度较高，载片上残留的裂解液会影响最终图像的清晰度，最终影响实验结果。鉴于以上原因。我们在实验中加入了水洗这一步骤。把裂解后的载片用三蒸水漂洗三次，每次5 r a i n 。因为裂解液中氯离子是主要成分，对每次清洗完胶片的废水作氯离子检测发现，经过三次水洗后，胶片上基本不再含有裂解液的成分。尽管在1 9 9 9 年举行的国际基因毒性检测会议上制定的彗星电泳流程中没有水洗这步骤，但是我们的实验结果发现，加入水洗这一步骤后，实验获得的胶片干净程度明显提高，给图像采集带来方便，更重要的是，不再出现同一张载玻片上的彗星图像尾部方向不一致的现象，该现象可能与电泳时残留裂解液离子所造成电场分布不均匀有关。2 3 4 碱性解旋( p h 1 3 )当d n a 置于强碱性溶液( p h 1 3 ) 时，d n a 双螺旋区的氢键断裂，互补碱基对被破坏，d n a 双螺旋链快速解离成单链【汪困仁，1 9 9 0 ，使被检测细胞中断裂的d n a碎片游离出来。1 9 8 8 年s i n g h 等人第一次使用碱性缓冲液进行解旋，这一作法现在仍然被广泛使用。解旋时间在各个实验室有所不同，s i n g h 等人一般用2 0 分钟。然而有人认为，经y 射线处理后的淋巴细胞，其彗星电泳中d n a 迁移率与解旋时间在2 0 - - 6 0分钟内成正比【v i i a y a l a x m ie ta l ，1 9 9 2 。因此，解旋时间这个电泳参数应该根据实际的实验目的提前筛选。2 3 5 电泳碱性解旋后胶体中的单链d n a 带负电荷，将胶体放置于盛有碱性电泳缓冲液的电泳槽中，在静电场力的作用下，带负电的d n a 将向阳极运动，其中d n a 断片与k链d n a 相比在电场中运动较快因而形成彗星尾部。电泳缓冲液与解旋时的解旋液是同一种液体。电泳参数主要有电场强度( 电压) 、电流、电泳时间和电泳时的环境温度。1 9 8 8 年s i n g h 等人采用的电场强度为o 8 v c m ，电流为3 0 0 m a ，电泳时间为2 0 分钟。典型的电场强度一般为0 7 1 0 v c m 。电泳时的温度也是一个不容忽视的实验参数，从o 到室温各不相同。有文献报道，温度能够影响实验结果，实验中的温度越高，彗星实验结果中尾部迁移率就越大【g u n t e rs p e i t ，1 9 9 9 。电泳时温度越低，其结果越容易分析。文献报道的电泳时间从5 - - 4 0 分钟都有，具体电泳的时间需要依赖试验的目的与检测的细胞而定。有文献报道，为了提高检测灵敏度，需要在电泳液中加入d m s o 和肌苷酸钠，采用低电压，长时问电泳 s i n g he ta l ，1 9 9 4 。利用长时间的电泳可以检测d n a d n a 交联、d n a 一蛋白质交联，d n a 变联使彗星电泳的尾部d n a 含量减少，通过与对照组尾部含量比较，检测交联的现象。例如电泳时间为2 天的长时间电泳实验检测到丝裂霉c 能够引以d n a d n a 交连，甲醛能够诱导d n a 蛋白质交联f p f u h l e ra n dw 州h ，1 9 9 6 ：d e e l a nj ，2 0 0 3 。电泳时电场强度在空间或时间上是否一致也是影响实验结果的一个重要因素，电泳槽采用两根平行铂金属作为电极，从电场分布理论分析，电泳槽内放置样品的平台上电场不可能完全一致，但可以通过调节电泳槽尽可能的水平，样品尽可能放在平台的中心，采集图像时尽可能舍弃样片边缘的细胞等方法减少电场不均匀带来的差异。2 3 6 中和电泳后为了除去胶片上残留的碱性物质，便于染色和观察，胶片需要放在中和液中中和。中和液的主要成分是三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 和盐酸，p h 值为7 5 。中和一般需要3 次，每次5 m i n ( s i n g he ta 1 ，1 9 8 8 ，增加中和的次数或延长中和的时问，在不影响背景噪声的前提下有利于染色和观察【r o j a se t a l 。1 9 9 9 】。中和后的胶片可以直接染色而后观察，也可用酒精梯度脱水后在任何时候进行染色分析。染色后的胶片应在2 4 小时内进行图像分析，避免d n a 在凝胶中进步扩散【g u r u g u m ae ta 1 ，1 9 9 6 ；k l a n l ee ta l ，1 9 9 6 。也有文献报道晾干后的胶片用甲酸浸泡1 25 m i n ，有利于氏时间保存【t i c e ，2 0 0 0 。2 3 7d n a 染色与彗星图像采集中和后晾干的胶片经d n a 染料染色后在相应波长激发光激发下可产生受激辐射荧光用荧光显微镜观察并采集彗星图像后经图像分析软件进行数据采集分析。目前用于d n a 染色的染料有很多种，具体选用哪一种要根据实验室的荧光显微镜的模块配制以及实验灵敏度的要求。表2 l 是常用的荧光染料及其特性【o s t l i n g ，1 9 8 4 ：s i n g h ，1 9 8 8 ；o l i v e ，1 9 8 9 ：g e c l i k e ，1 9 9 2 ：t i c e ，1 9 9 8 ；o表2 1 常用的荧光染料及其特性激发波跃发射波长染料名称荧光颜色( n m )( n m )滨化乙啶( e t h i d i u mb r o m i d e ，e b )4 8 86 1 0红色碘化丙啶( p r o p i d i u mi o d i d e ，p i )4 8 86 2 0红色4 6 二脱脒2 吲哚苯( 4 3 7 24 5 6蓝色6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e y , d a p l )y o y o i ( b e n z a x a z o l i u m - 4 一q u i n o l i n u m4 9 05 1 0绿色o x a z o l ey e l l o wh o m o d i m e r )吖啶橙( a o )4 0 55 3 0 6 4 0黄绿桔红h o e c h s t3 3 3 4 23 5 24 0 0 5 0 0蓝光h o e c h s t3 3 2 5 83 5 24 0 0 - 5 0 0蓝光s y 8 rg o i d4 9 55 3 7绿光彗星电泳中使用的荧光染料要求在测量时间内不会出现明显的荧光淬灭，不会因染料的光漂白而产生荧光信息衰减【t e b b se ta l ，1 9 9 9 ，也可以在彗星电泳实验中采用硝酸银作为染料 k i z i l i a ne ta l ，1 9 9 9 1 。采集图像时使用的荧光显微镜放大倍数一般在1 6 0 到6 0 0 之间。被测细胞的大小，彗星长度的可能范围和显微镜成像系统的配制情况，最经常使用的放大倍数为2 0 0和4 0 0 。2 3 8 图像分析与彗星参数随着高分辨率c c d 器件和高速图像采集卡的问世，彗星图像采集从普通摄像方式过渡到数码时代，直接在荧光显微镜上采集图像传输到计算机上进行分析，既保证了信息的准确性，又使实验时间大大缩短。从采集的彗星图像中定量的提取d n a 损伤信息，其最直接的方法就是使用计算机辅助分析系统检测彗星的参数。这些软件有商业软件和免费软件。其中，商业软件功能较全，使用灵活性好，缺点是价格一般比较昂贵，无法得到软件源代码，而且大多只适用于苹果计算机和l i n u x 操作系统。从网络免费获取的软件功能较差，但可以对源代码适当修改后使用【c h r i s t o p hh e l m ae ta 1 ，2 0 0 0 。用来分析d n a 损伤的彗星图像参数主要有：彗星长度、彗星头部面积、彗星头部平均荧光亮度、彗星头d n a 含量( ) 、彗星尾部长度、彗星尾部重心、彗星尾部d n a含量( ) 、彗星尾部面积、彗星尾部距离、彗星尾矩、o l i v e 尾矩、彗星尾部惯量、这些参数的定义如下：l 、彗星长度c l ( c o m e tl e n g t h ) ：整个彗星图像在彗尾方向上的最大长度。2 、彗星头部面积h a ( l e a d a r e a ) ：彗星头部的总面积。删= a r e a ，i = la r e a ，为彗星头部第i 个单位元的面积3 、彗星头部平均荧光亮度h a l ( h e a d a v e r a g ei n t e n s i t y ) ：( a r e a ，a i ，)h a l = j = ! 一删一五为彗星头部中第i 个单位元的亮度4 、彗星头部直径h r ( r a d i u so f t h ec o m e th e a d ) ：把彗星头部的图像近似为一个圆，其对应的直径即为头部直径。5 、星尾长t l ( t a i ll e n g t h ) ：彗星尾部在彗尾方向投影的长度。6 、彗星尾部面积t a ( t a i la r e a ) ：t a i = a r e a ，a r e a l 为尾部第i 个单位元的面积7 、彗星尾部的平均荧光亮度t a i ( t a i la v e r a g ei n t e n s i t y ) ：( a r e a ，a 1 ，)t a i = 上生一t aa r e a ，为尾部第i 个单位元的面积，爿正为尾部第i 个单位元的亮度8 、彗星头部d n a 百分含量h d n a ( ) ( p e r c e n t a g eo f d n ai nh e a d )hdna=瓦丽hax雨ha瓦lx厕100tat a ih ah a lii + (l9 、彗星尾部的d n a 含量t d n