药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析.ppt

药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析,抗体-生物体自造的“magicbullet”,医疗直接或与毒素连结攻击病变細胞研究各种免疫分析,抗体药物销售趋势图,国际抗体药物,2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。,国内抗体药物,目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数2011年国内市场规模超过10亿元我国抗体药物产业化的主要限制因素：动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓QbD（质量源于设计）理念的应用,抗体偶联药物(AntibodyDrugConjugates，ADC),结合单克隆抗体的靶向性和小分子药物的高度细胞毒性，可以有效地杀伤肿瘤细胞，在临床前研究、甚至人体临床研究中，取得了良好的抗肿瘤效果，成为生物药物研究的热点领域之一;ADC药物为疾病的“精准医疗”提供有效的武器。,抗体-药物偶联剂（ADCs）的研究进展与产业现状:,Antibodyandstructure,特点：2个基因决定一个蛋白质与抗原的结合力强，高度专一性,抗原和抗原决定簇,一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇每個抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸,。,克隆选择学说,单抗和多抗,多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。单克隆抗体（monoclonalantibody）指由一种B细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。,Preparationofpolyclonalantibodies,传统抗血清,抗原,免疫,混合抗体,1,2,3,4,免疫前要先把抗原作成乳剂,约在两月內注射五到八次,Preparationofmonoclonalantibodies,Preparationofrecombinantantibodies,淋巴细胞,总RNA,抗体轻、重链文库,重组单链抗体基因,轻、重单链基因,大肠杆菌表达体系,单链抗体,单链抗体,在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链如果仅是两条链的可变区，称为ScFv连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是GGGGS3,Abasantigen-Primaryandsecondaryantibody,PrimaryAb,SecondaryAb,PrimaryAb,ProteinA,二抗针对一抗的物种特异性,ProteinA针对所有动物抗体Fc,Immunoassays,Themostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy,抗体的标记方法,放射性同位素标记酶标记荧光标记有机分子荧光标记绿色荧光蛋白标记稀土荧光标记通用标记,放射性碘标记,HRP酶标记,简单化学偶联方法：1过碘酸钠法：仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRPCH2NHIgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的和氨基。2戊二醛交联标记法：戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。,NaHB4,HRP,LabelingwithisoFITC,GFPlabeling,GFPgene,ScFvgene,expression,GFPgene,ProteinAgene,expression,Ab-Fc,通用标记,+,Avidin/streptA,+,Anti-digoxinAb,2ndAb,ProteinA,PrimaryAb,PrimaryAb,Importantassays,ImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIAcompetentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA-homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA,Immunostaining,Fluorescence/luminescence,Colorization,or,组织切片或培养细胞单层,细胞/组织固定,免疫染色,（荧光）显微镜观察,免疫荧光标记的c-Myc,phalloidin荧光标记的微丝,荧光染色的细胞核,合成图像,Immunoblot-WesternBlot,Electroblotting,gel,PVDFmembrane,Immunostaining,封闭,分析抗体,显色抗体,显色,数字化灰度图像分析,0.51246812162430(h),c-myc,p53,CyclinD1,Actin,CaN,CaM:La3+,HRP,StreptAvidin,Biotin,RIAAssay,免疫竞争结合分析-小分子抗原分析的基本方法,Ag+AbAgAb+Ag+*Ag*AgAb+*Ag,*AgAb:Precipitant,放射性计数,常用分离沉淀技术,盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠聚乙二醇法（w=6000）特点：快速，价廉，来源方便，受环境影响大抗体免疫沉淀法特点：分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高固相吸附剂,RIA测量步骤,恒量的*Ag、Ab加入反应管中加入待测样品、或标准品（已知浓度）37或4温育加入分离剂分离结合及游离部分测定以总放射性为分母，测定*AgAb为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度,Calibrationcurve,ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）,SandwichELISA,竞争法（略）,HighConvenienceHighSensitivity,96-wellplate,包被,封闭,结合,显色,酶标仪测定,hv,洗涤,洗涤,洗涤,终止,酶的底物,HRP的底物,氧化产物(橙红色),492nm吸收,2mol/L硫酸终止反应,AP的底物硝基苯磷酸酯对硝基酚(黄色)NaOH终止反应405nm吸收峰,磷酸4-甲基伞酮（荧光底物）,荧光偏振免疫分析,Principleoffluorescencepolarization,emittingdipole,absorbingdipole,excitationlightpolarizedalongz,x,z,y,I,I,detector,Fluorescencepolarizationimmunoassay,Ag+AbAgAb+Ag+*Ag*AgAb+*Ag,Highpolarizedfluorescence,Lowpolarizedfluoresce