（微生物学专业论文）重组毕赤酵母生产人生长激素的发酵条件研究.pdf

摘要 本研究首次采用基因工程菌重组毕赤酵母表达人生长激素( h u m a ng r o w t h h o r m o n e ，h g h ) ，通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵 培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据 优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。实验结 果如下： 1 以b s m 培养基为发酵培养基并对其进行改良：对基本碳、氮源进行了选择并 对实验数据进行了分析处理，结果显示分别以甘油、葡萄糖作为碳源时，甘油优 于葡萄糖：以酵母粉、( n h 4 ) 2 s 0 4 作为氮源时，酵母粉远优于( n h 4 ) 2 s 0 4 ；对甘油、 酵母粉、磷酸盐缓冲液、m g s 0 4 7 h 2 0 等进行了单因素分析后做正交试验，得到 了改良b s m 培养基的最佳配比为：甘油3 0 9 l 、酵母粉1 4g l 、k 2 s 0 41 2g l 、 m g s 0 4 7 h 2 01 3g l 、c a s 0 40 3g l 、p t m l4 4m l ，0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液5 0 m l ( p h = 6 6 ) 。 2 考察了影响外源蛋白表达的因素，包括接种量、种龄、诱导时间、甲醇浓度、 p h 等，得到最佳培养及诱导条件为：接种量为8 ，最佳种龄为2 4 h ，诱导时间 为3 0 h ，甲醇浓度为2 ，p h 为6 3 6 9 。 3 对摇瓶实验结果进行了放大，用瑞士b i o e n g i n e e r i n g 公司l 1 5 2 3 型1 2 8 l 发 酵罐进行了补料分批发酵，方法为：当甘油耗尽( 表征为d o 陡然上升) 时， 开始补加5 0 甘油( 含1 2 m u l p t m l ) ，并间歇补加酵母液，控制流加速度维持 d o 在3 0 - - 4 0 ，当发酵液的o d 6 0 0 值达到3 0 0 左右时，开始以3m l ( l h ) 的 速率加入甲醇( 含1 2 m l lp t m l ) 诱导，而甘油补加速率由1 3 3m l ( l h ) 逐渐 降低至0m l ( l h ) ，甲醇补加速率由3m l ( l h ) 逐渐升高到1 0m l ( l h ) ，该过度 阶段约维持4 一 6 h ，此后甲醇补加速率根据溶氧变化及尾气分析仪在线检测到的 c 0 2 的变化情况及时调整。发酵结束后，细胞光密度( o d 6 0 0 ) 达到3 5 0 ，r h g h 表达量最高达到0 5 4 9 l 。 4 通过s d s p a g e 凝胶电泳法对表达产物进行了定性分析，结果表明表达产物 与r h g h 标准品具有相同的相对分子量，初步表明该产物即为人生长激素。 关键词：重组人生长激素；毕赤酵母；培养基优化；诱导条件；高密度发酵 a b s t r a c t p r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n th u m a ng r o w t hh o r m o n e ( r h g h ) b yg e n e t i c a l l y e n 百n e e r e dp i c h i ap a s t o r i sw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h ep u r p o s ew a st of i n do u tt h e o p t i m a lm e d i u ma n di n d u c t i o nc o n d i t i o n sw h i c hw e r es u i t a b l ef o rt h er e c o m b i n a n t p i c h i ap a s t o r i s w eg o tt h ei d e a lc u l t i v a t i o ns u b s t r a t u ma n di n d u c t i o nc o n d i t i o n si n s h a k e - f l a s kc u l t u r eb ym o n o f a e t o r i a la n a l y s i sa n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h e ns c a l e d t h er e s u l to fs h a k e f l a s kt o1 2 8 lf e r m e n t e ru n d e rt h eo b t a i n e dc o n d i t i o n s 1 1 1 ew o r k o ft h i sp a p e ro p e n e dan e wh i g h - p e r f o r m a n c ew a yt oo b t a i nr h g h t h er e s u l t sa r ea s t h ef o l l o w s ： 1 w es e l e c t e dt h eb s ma sh i g h - d e n s i t yc u l t u r em e d i u ma n dm e l i o r a t e di tf u r t h e r ：t h e o p t i m a lc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ew e r es e l e c t e da n dt h er e s u l t sw e r ea n a l y z e db y u s i n gs p s s ，w ef o u n dt h e e f f e c to fg l y c e r o la sc a r b o ns o u r c ew a sb e t t e rt h a n g l u c o s e ，t h ee f f e c to fy e a s te x t r a c ta sn i t r o g e ns o u r c ew a sm u c hb e t t e rt h a n ( n h 4 ) 2 8 0 4 ， t h e no p t i m i z e dt h ea m o u n to fe a c hi n g r e d i e n to fb s m ，t h er e s u l tw e r e ：g l y c e r o l 3 0 e g l 、y e a s te x t r a c t1 4 9 l 、k 2 s 0 413 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 0 l lg l 、c a s 0 40 3g ，l 、 p t m l4 4m 1 ，0 1 m o l lp h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ( p h = 6 5 ) t h eo u t c o m es h o w e dt h e i m p r o v e db s m w a ss u i t a b l ef o rr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s g r o w t h 2 t h ec u l t u r ec o n d i t i o n ss u c ha ss e e dg r o w t ht i m e 、i n d u c t i o nt i m e 、m e t h a n o l c o n c e n t r a t i o na n dp hw e r ei n v e s t i g a t e d ，t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n si n c l u d e ：t h e o p t i m a ls e e dg r o w t ht i m ew a s2 4 h ，i n d u c t i o nt i m ew a s3 0 h ，m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n w a s2 ，p hi s6 3 6 9 3 t h e nw es c a l e dt h er e s u l to fs h a k e f l a s kt o1 2 8 lb i o e n g i n e e r i n gl 1 5 2 3f e r m e n t e r u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ef e r m e n t a t i o ns t r a t e g yw a ss t u d i e di nt h ef e e d - b a t c h f e r m e n t a t i o nm e a n w h i l e ，t h em a x i m u my i e l do fr e c o m b i n a n th u m a n g r o w t hh o r m o n e r e a c h e d o 5 4 9 l ，t h eo d 6 0 0r e a c h e d3 5 0 4 t h er e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i ss e c r e t o r yp r o t e i n sc h a r a c t e r i s t i c sw e r er e s e a r c h e d b ys d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s ，a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep r o d u c tj u s tw a sr h g h k e yw o r d s ：r e c o m b i n a n th u m a ng r o w t hh o r m o n e ；p i c h i ap a s t o r i s ；o p t i m i z a t i o n ； i n d u c t i o nc o n d i t i o n s ；h i g h d e n s i t yf e r m e n t a t i o n i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 未阜塞指导教师签名：j 茎篮埠 髫年钿日d g 年6 月f 2 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：专 知6 8 年，月6 h 第一章综述 1 1 人生长激素概述 人生长激素( h u m a ng r o w t hh o r m o n e ，h g h ) 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分 泌的一种单链、非糖基化、1 9 1 个氨基酸组成的亲水性球蛋白，具有广泛生理功 能的生长调节素，能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组 织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖 及脂肪的代谢。h g h 发挥功能作用主要经由两个途径：一是诱导肝细胞、肌细 胞产生生长激素介质( s o m a t o m e d i n ，s m ) ，再经由s m 间接起作用；二是直接 作用于靶细胞产生生理效应。无论那一种方式g h 都需要首先同细胞表面特异 性受体结合，再由受体介导，激发一系列生化事件并最终产生生物效应【1 。3 】。 1 1 1 人生长激素结构特点 1 1 1 1 人生长激素基因及其表达 h g h 基因族跨越第1 7 号染色体上( 1 7 q 2 2 - q 4 4 ) 大约6 50 0 0 b p 。这一基因家族 由5 个紧密相关的基因组成【l 】，它们是g h - n ( g r o w t hh o r m o n en o r m a lg e n e ) ，c s - l ( c h o r i o n i cs o m a t o m a m m o t r o p i n - l i k e ) ，c s - a ( c h o r i o n i es o m a t o m a m m o t r o p i n - a ) ，g h v ( g hv a r i e n tg e n e ，或称胎盘g h ) 和c s b 。基因g h - n 和g h - v 有时 被称为g h 一1 和g h 2 ，这五个基因d n a 序列和基因间隔区高度同源。g h - n 基 因表达产物有二种，1 9 1 个氨基酸组成的2 2 k d 分子是垂体g h 的主要表达形式， 为人体生长发育所必需；另外，g h - n 基因还通过m r n a 的可变剪接产生2 0 k d 分子，由1 7 6 个氨基酸组成，较之2 2 k d 分子缺少3 2 4 6 位共1 5 个氨基酸，这 种2 0 k d 分子约占血清g h 总量的5 1 5 ；它与人肝膜g h r 的结合亲和力 较低，缺乏类胰岛素效应：除脑垂体外，g h n 基因也在淋巴细胞中得到表达， 其作用可能是调节免疫应答功能，所不同的是淋巴细胞表面g h r 对2 0 k dg h 亲和力高于2 2 k d 。在人体脑垂体和血清中除了这两种主要形式分子外，还有 h g h l 4 3 ，h g h 4 4 1 9 1 ，二聚体，多聚体以及等共价修饰分子。实际上，h g h 基 因的表达产物构成了一个蛋白质家族，而不仅仅是单一激素【4 】。 g h v 只在胎盘组织中表达，妊娠期间母体血液中g h v 含量升高并成为 主要的g h 形式，这种取代的生理意义尚不为人们所知。在完全缺乏g h v 的 情况下，妊娠和胎儿生长正常进行，g h v 不能代替g h - n 促进儿童的生长发 育。g h v 和g h - n 高度同源，二者在整个序列中只有1 3 个氨基酸的差异，这 些氨基酸的改变显著地影响了蛋白质的理化性质，g h - n 等电点为5 5 ，g h v 的 为8 9 。血液中g h v 的基因产物主要有三种形式：2 2 k dh g h v ；2 5 k d 基化形 式的g h v ；2 6 k dh g h v 2 1 1 。 c s a ，c s b 基因在人胎盘表达并编码同一蛋白产物，被称为绒毛膜生长催 乳激素或胎盘促乳素，参与胎儿、乳腺的发育和促进乳汁分泌，但在其缺乏时胎 儿生长发育完全正常；c s l 是个假基因。 o 6 5 k b i i 5 - f l a n k i n g r e 2 i o i i 3 - f l a n k i n g r e l e l o n ! i a bcd 2 ! k b 图1 1h g h 基因族图示，该基因族跨越6 50 0 0 碱基对，由g h - n c s - l ，c s - a g h _ v ，c s - b 组成； h g h 基因约含26 0 0 碱基对，包括5 个外显子( i _ v ) 和4 个内含子( a - d ) f i g u r e1 1g r a p h i c a lp r e s e n t a t i o no fh g hg e n ec l u s t e r 1 1 1 2 人生长激素分子结构 人生长激素分子含有1 9 1 个氨基酸，链内含有四个c y s ，组成二对二硫键 ( c 5 4 - - 一c 1 6 5 ，c 1 8 2 - - c 1 8 9 ) 。胰蛋白酶专一裂解a r g 和l y s 羧基端的肽键。人生 长激素分子的一级机构中含有11 个a r g ，分别位于第8 、1 6 、1 9 、6 4 、7 7 、9 4 、 1 2 7 、1 3 4 、1 6 7 、1 7 8 、1 8 3 位点上，9 个l y s ，分别位于第3 8 、4 1 、7 0 、11 5 、1 4 0 、 1 4 5 、1 5 8 、1 6 8 、1 7 2 位点上，人生长激素分子用胰蛋白酶裂解，理论上有2 0 个 裂解位点和2 1 个肽段。人生长激素的一级结构如下： p h e - p r o - t h r - - t h r - i l e - p r o - l e u s e r - - a r g l e u p h e - a s p a s n a l a m e t - l e u a r g a l a h i s - a r g - l e u - h i s - g i n - l e u a l a - p h e - a s p - t h r - t y r - g i n - g l u - p h e - g l u - g l u - a l a - t y r - - i l e p r o - - l y s g l u g l n l y s t y r - s e r - p h e - l e u - g i n a s n - p r o - g i n - - t h r - - 2 s e r - l e u c y s p h e s e r g l u - s e r - i l e - p r o t y r p r o s e r - a s n - - a r g - g l u g l u t y r - g l n - - g l n - l y s s e r - a s n - - l e u g l u l e u - l e u - a r g - i l e - - s e r - l e u - l e u - - l e u - i l e g l n - s e r - t r p - - l e u g l u - - p r o - v a l - g l n - - p h e l e u - a r g - s e r - - v a l - p h e a l a - a s n - s e r - l e u v a l - - t y r - g l y a l a s e r a s p - s e r a s n - v a l t y r a s p - l e u - l e u - l y s a s p - l e u - g l u g l u - g l y - i l e - g i n - t h r - l e u - - m e t - - g l y a r g l e u - g l u - a s p - g l y - - s e r p r o a r g t h r - - g l y - g i n - i l e - p h e - l y s - g l n - - t h r t y r - s e r - l y s - p h e a s p t h r a s n s e r h i s a s n - a s p - a s p - a l a - - l e u - l e u l y s a s n - t y r - g l y - l e u l e u - t y r - c y s p h e - - a r g - - l y s - a s p - m e t - - a s p - l y s - v a l - - g l u - t h r p h e l e u a r g i l e - v a l - - g i n - c y s - - a r g s e r v a l - g l u g l y - s e r - c y s g l y - p h e 。 h g h 构象中约有5 0 a 一螺旋，从三维结构看，h g h 包括四个反平行o l 一螺旋， 其中三个a 螺旋起关键作用。分泌h g h 的细胞( 在腺垂体的后外侧部) 含圆形 致密的分泌颗粒，直径约3 0 0 3 5 0 n m 。h g h 属蛋白质激素，不通过靶腺产生生 理效应，它的受体遍及全身。用1 2 5 i 标记的h g h 实验研究发现h g h 的受体在细 胞膜上，肝、肾、脾、胰、肠、肾上腺皮质、心和骨骼肌的细胞表面都有较多的 受体与1 2 5 i - g h 结合。h g h 的作用机理一般认为是通过c a m p 进行的。在与靶细 胞结合后，能改变氨基酸及代谢产物的运转，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合 成【5 1 。 。n o r t h ”e n d s o u t h e n d ah g h 结构简图 。矿 3 bh g h 的三维结构图 图1 2h 6 h 由4 个反向平行的q 一螺旋和非螺旋部分组成 f i g u r e1 2h g hg e n ec o m p o s e db yf o u ra n t i p a r a l l e la h e l i x sa n du n h e l i x 1 1 2 人生长激素的生理功能 h g h 的基本功能是刺激所有机体组织的发育，增加体细胞的大小与数目； 结果各器官在g h 影响下均变大，骨骼增长导致人体增高。g h 这种促进细胞 增殖作用的基础是促进合成代谢。g h 具有广泛的生理功能，它影响几乎所有的 组织类型，其作用靶组织包括骨、软骨、脂肪组织、免疫系统和生殖系统，甚至 对脑组织和造血系统也有作用【6 1 。g h 的功能可分为三类：代谢效应；增殖效应； 分化效应。 g h 最普遍的作用是调理各种细胞的代谢过程，如产生胰岛素样效应促进脂 肪细胞对葡萄糖的吸收和利用，增进脂质的降解：肌细胞中，g h 能刺激葡萄糖 的转化和氧化，在骨组织中，表现为影响矿质代谢，其它类型组织细胞中，g h 总 体上表现为刺激蛋白质的合成和氨基酸的转运1 7 朋。 g h 的促有丝分裂效应：g h 能直接刺激培养中的胰脏d 细胞的增殖，当培 养介质中加入生理浓度g h 时，细胞增殖指数被提高十倍：i l - 3 依赖的f d c p i 和p r o b 细胞在转化了g h r 后可依赖g h 生长；g h 还能直接刺激成骨细胞、 胫骨生长盘干细胞、血管内皮层细胞、上皮细胞、再生性骨骼肌纤维细胞、t 细 胞和b 细胞的增殖；这种增殖效应的发生不需要胰岛素样生长因子( i n s u l i n 1 i k e g r o w t hf a c t o r 1 ，i g f 1 ) 的存在。 此外，g h 还能促进脂肪前体细胞成熟分化、骨髓t 细胞前体的发育以及 造血细胞分化【9 】。近来，有关生长激素、免疫和衰老三者之间关系的研究逐渐受 到重视。免疫细胞可分泌g h ，且细胞表面存在g h 受体。g h 抗血清可引起小 鼠、狗的胸腺萎缩以及t 、b 细胞数量的下降，人工注射g h 又可使这种现象 逆转；g h 能诱导自然杀伤细胞的细胞毒性，刺激i l - 1 、i l - 2 的产生。衰老时 的许多病理、生理变化也与g h 的改变有关。b o u i l l a n n e 等【1 0 1 研究指出，正常人 成年后g h 的分泌每1 0 年下降1 4 。衰老必然伴随着g h 分泌量的减少和免 疫功能的下降，有人认为可将g h 作为衰老的一个生物标志。此外，近来g h 与 心血管之间的关系也颇受重视。g h 受体在心肌较其他组织中表达的更为充分； g h 及其次生生长因子i g f 1 具有明显的促进心肌细胞收缩和心肌肥厚效应。 4 g h 的上述生理功能主要通过两种方式起作用：经由i g f s 等生长介质 ( s o m a t o m e d i n ，s m ) 介导假说，该假说认为g h 刺激肝细胞释放i g f s ，再经i g f s 作用于靶细胞促进细胞的增殖和生长。此外，还发现g h 还能够刺激肌细胞分 泌s m 。直接作用假说，g h 促进软骨代谢作用需经由s m 介导，但促进骨骼 延伸和生长的作用则不需要i g f s 的参与，而是通过g h 直接刺激骺软骨细胞的 生长来实现的；g h 对脂肪组织的促成熟分化作用，对免疫系统以及造血细胞的 促增殖发育作用可能主要是通过后一种途径起作用的 1 1 , 1 2 , 1 3 】。 近年来的研究表明，g h 的功能不仅仅局限于促进生长，其促生长以外的功 效，特别是其在免疫系统中的作用已日益引起人们的注意。 盐gl k c 商| m 硼 15 0 5 t 0 1 5 0 - 0 5 t o0 5 o - o 5 u n t e s t e d g hr e c e p t o rh g h 图1 3h g h 与受体g h r 结构示意图 f i g u r e1 3g r a p h i c a lp r e s e n t a t i o no fh g ha n dg h r c o m b i n a t i o n 1 2 重组人生长激素 1 2 1 重组人生长激素的研究进展 人生长激素由垂体前叶分泌，5 0 - - - 8 0 年代医学上用从人垂体提取的第一代 生长激素治疗儿童激素缺乏症，因制剂提取不纯等原因，有报道发生过致命的神 经系统疾病痉挛性假性硬化( c r e a t z f e l d t j a k o bd i s e a s e ) 而被停用【1 4 】。 从8 0 年代后期开始用大肠杆菌经d n a 重组技术生产第二代人生长激素， 即重组人生长激素( r e c o m b i n a n th u m a ng r o w t hh o r m o n e ，r h g h ) ，其为19 2 多 肽，在n 端较人垂体提取的g h 多了一个甲硫氨酸，人应用后易产生抗体。后 再经重组技术合成了第三代r h g h ，去除了n 端的蛋氨酸，为1 9 1 肽。进入9 0 年 代，开始用真核细胞比如哺乳类细胞合成第四代r h g h ( 1 9 1 肽) ，该制剂的氨基 酸序列与人天然g h 完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌， 故无污染的危险，同时减少了抗原性，为临床应用的进一步扩展奠定了基础【1 5 】。 近年来，人们不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、 家兔、山羊、牛等表达人生长激素【1 0 1 ，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵 后处理复杂、难以工业化生产等问题。本研究采用真核微生物毕赤酵母发酵 表达人生长激素。 1 2 2 重组人生长激素的临床应用 重组人生长激素与天然人垂体生长激素结构和生物学特性完全相同。r h g h 的主要功能有：间接的促进细胞生长作用，能提高细胞的生长速度，重组人生 长激素通过作用于肝细胞膜上生长激素受体产生i g f 一1 而促进全身组织细胞的 生长增殖；间接的代谢调理作用，促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，维持氮 平衡，增加脂肪分解和糖异生，提高营养物的转换率；免疫调节作用，r h g h 在 触发吞噬细胞产生超氧阴离子和细胞因子，提高调理素的活力，刺激b 细胞产 生免疫球蛋白等方面起重要的作用。有人在分子水平揭示r h g h 直接刺激肝细胞 蛋白质m r n a 的表达，从而促进蛋白质的合成。人生长激素在临床上的应用主 要有以下几个方面： 1 治疗儿童激素缺乏症【2 1 ，2 2 】 常见的儿童生长激素缺乏症( g h d ) 是原发性垂体生长激素缺乏或分泌不足 所致的生长障碍，g h d 是导致儿童身材矮小的主要疾病之一。自1 9 8 5 年国外 率先在临床应用r h g h 以来，r h g h 的替代治疗已成为g h d 的首选治疗措施。 g h 主要是通过诱导静止期软骨细胞转化为增殖期软骨细胞；还通过肝脏等组织 产生i g f 1 ，后者促进增殖期软骨细胞增殖、分化，从而促进骨增长。 2 治疗重症充血性心力衰竭【2 3 ，2 4 】 近年研究显示g h 在维持正常心血管生理功能中具有重要的作用，它可以直 接或间接地通过i g f 1 而发挥作用。g h i g f i 轴对心肌的作用分直接及间接影 响，直接作用为正性肌力作用，影响心肌的收缩、促进心肌生长及能量供给； 间接影响包括减少外周血管阻力、增加血容量及肾小球滤过率。 6 3 在严重烧伤烫伤及手术后伤口愈合中的应用【2 5 2 7 】 大手术、烧伤等创伤使机体处于应激状态，出现高分解代谢，蛋白质降解加 速，能量消耗增加，糖代谢紊乱，负氮平衡，免疫功能减退等症状，影响机体的 康复。r h g h 通过促进肝脏产生i g f 1 ，进而促使肝贮脂细胞分泌血小板源性生 长因子( p d g f ) ，p d g f 能强力地诱导成纤维细胞的再生，使细胞外基质的合成增 加。p d g f 和p d g f a 、p 受体的表达增强与i g f 1 同步，尤其是成纤维细胞上 的p d g f a 、b 受体的表达成倍增加，促使i 、型胶原的含量亦明显增多。同 时，r h g h 增强免疫功能，增加单核巨噬细胞的活性，促进p d g f 及其受体的 表达，通过p d g f 和i g f 1 两种途径及其协同作用，促进创面愈合。 4 治疗慢性肝脏疾病【2 8 - 3 2 】 相关研究表明：r h g h 可以增加i g f 1 的合成和释放，消除生长激素抵抗现 象以及促进白蛋白的合成，提高白蛋白含量，减少蛋白质的分解，提高糖营养物 质利用及转换率，维持氮平衡。从而改善肝硬化患者低蛋白血症，在改善食欲， 增加尿量，消除腹水等方面安全有效，治疗过程中无明显不良反应。 g h 治疗慢性肝病可能机理为o g h 能显著增加肝脏r n a 的合成及其含 量，注射g h 后r n a 聚合酶活性增加，m r n a 增加，核糖体含量增多，蛋白 质合成增加，肝脏许多酶如磷酸果糖激酶等活性也增加；国外通过临床检测血 i g f 1 及i g f b p 3 ，证实外源性生长因子可有效地改善肝硬化患者由于g h 抵抗 所致的蛋白代谢异常。r h g h 可克服肝硬化患者的生长激素抵抗，刺激i g f 1 升 高。i g f 1 具有很强的合成代谢效应，可抑制蛋白分解，增加氨基酸摄取和细胞 增生，促进白蛋白的合成：刺激肝细胞再生，研究发现，r h g h 能促进大鼠肝 部分切除后残肝中肝细胞核分裂指数，肝细胞体积密度、新生肝细胞数目密度。 5 治疗肾脏疾病【3 3 1 外源性r h g h 可提高肝脏i g f l m r n a 的表达，也可以直接与肾脏局部的 g h r 结合，导致肾脏i g f m r n a 的表达增强，使得血液中和肾脏局部的i g f 1 浓度升高。i g f 1 通过和肾小球i g f 1 受体结合入球和出球小动脉血流，使r p f 增加而最终导致g f r 增加。g h 在治疗肾病综合症、肾功能不全、多囊肾、肾 移植等肾病的治疗方面也有良好的效果。 6 治疗骨质疏松症【3 4 】 7 m a r c u s 认为g h 直接刺激骨细胞的增值及分化，影响生长激素一胰岛素样生 长因子轴，升高血清i g f 1 水平，增加老年人骨内和骨膜新骨生成，治疗老年骨 质疏松症。 7 抗衰老【3 5 】 近年来，g h 已经成为抗衰老研究领域的研究热点之一，补充生长激素可以 增加肌肉成分，减少体脂，促进氧耗，提高生命的全面质量。动物实验证明，r h g h 可以使组织细胞分化增加旺盛，较好地改善年老老鼠的机体成分，从而起到抗衰 老的作用。 8 治疗艾滋病相关消耗综合症【3 6 】 r h g h 是近年来研究较多的一种治疗艾滋病相关消耗综合症的方法，其通过 刺激肝脏产生i g f i 和直接与外周组织细胞膜上的h g h 受体结合而产生增强蛋 白质合成、促进脂质溶解及增加体细胞数目和大小的作用。动物试验还表明r h g h 在体内有造血生长因子的作用，可增加脾髓及骨髓定向造血干细胞的含量，另有 研究发现对于存在贫血的成人生长激素缺乏患者r h g h 治疗可刺激血浆红细胞 生成素的分泌和提高血红蛋白水平。董婕、孙洪清等用r h g h 治疗艾滋病相关消 耗综合症，使用r h g h 后患者胃纳改善明显，精神好转，体重增加，并且在无输 血的情况下保持血红蛋白持续增高。 9 其他 r h g h 还可应用于短小肠综合征，改善肌体对肠内营养物的耐受性，刺激术 后小肠的重生长；应用于成人肥胖症，增加脂肪分解，在不用严格限制饮食的同 时保存蛋白质及肌肉，避免了其他减肥药易致体虚及电解质紊乱【3 7 1 。重型颅脑损 伤患者应用r h g h 能改善机体对营养底物的利用率，促进蛋白合成、减轻重型颅 脑损伤后低蛋白血症【3 8 】。于凯江等【3 91 报道对3 0 例在重症监护病房住院的采用 机械通气治疗慢性阻塞性肺疾病( c h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i e a s e ，c o p d ) 呼吸 衰竭患者，结果显示生长激素能够显著缩短c o p d 患者的机械通气时间，使患 者成功脱离机械通气，降低病死率。r h g h 对t u r n e r 综合症促生长的治疗已经得 到f d a 的批准【4 们。总之，r h g h 在临床应用方面已经显示出了广阔的前景。 1 3 巴斯德毕赤酵母表达系统 1 3 1 巴斯德毕赤酵母表达系统概述 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外 源基因表达系统之一。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白 质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷；弥补了 哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的 不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处：该表达系统具有强有力 的醇氧化酶( a l o c h o lo x i d a s e ，a o x l ) 基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达； 同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，包括二硫 键的形成、脂肪的酰化、蛋白的磷酸化、折叠、信号序列加工、n - 糖基化、o 糖基化，从而使表达出的蛋白具有生物活性；该酵母菌营养要求低、生长快、 培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生 产；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上水平：表达的外源蛋白可分泌到 胞外，分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传 稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表 达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵 母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用【4 1 舶】。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母的一种，能在甲醇为惟一碳源的培养基上生长。 甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如a o x 、二羟丙酮合成酶( d h a s ) 和 过氧化氢酶( e a t a l a s e ) ，表达的a o x 和d h a s 的含量甚至可达到总细胞蛋白的 6 0 一8 0 。而以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源时，a o x 几乎不表达。a o x 的合 成是在转录水平调控的，其基因启动子为诱导型。 1 3 2 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载 体为主。常见的整合载体又分为胞内表达和分泌表达2 类。胞内表达的载体有 p p i c 3 、p p i c 3 k 、p p i c 3 5 k 、p h i l d 2 、p p i c z a 、p p i c z a b 和p p i c z a c 等：分 泌表达的载体有p p i c 9 、p p i c 9 k 、p a c 0 8 1 5 、p p i c z a a 、p p i c z o t b 、p p i c z a c 和 p h i l s 1 等。通用的整合载体多含有a o x l 启动子，有一个外源基因表达框、多 克隆位点和一个从a o x l 基因上拷贝下来的终止序y j j ( t t ) ，作为筛选标记的h i s 4 基因和在细菌中进行复制起始点和选择标记( 如c o l e l 复制起始点和抗氨苄青霉 素基因) 以及a o x l 的非编码区序列，使外源基因能以同源重组的方式整合到染 9 色体的a o x l 部位( 表1 1 ) o 1 3 3 毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般步骤 首先合成或克隆目的基因，如果选用分泌型表达载体，则外源基因的阅读框 架和信号肽的阅读框架应该保持一致；将重组载体线性化，然后转化酵母菌，一 般选用原生质球法或电击转化法，后者较为常用，效果也好：最后对转化子进行 筛选，检测外源蛋白是否表达；对优良的转化子放大培养，进行工业化生产。 表1 1 巴斯德毕赤酵母表达载体的结构与功能 t a b l e1 1c o n s t r u c t i o na n df u n c t i o n so f p i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o r 1 3 4 外源蛋白的表达方式 目前，利用毕赤酵母表达系统已成功地表达了许多外源蛋白。外源蛋白在毕 赤酵母中的表达分为胞内表达和分泌到胞外2 种方式。胞内表达如破伤风毒素蛋 白的产量达1 2 9 l 。胞内表达适宜于通常在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化 蛋白，其较胞外分泌水平高，但产物纯化较复杂。对于那些易于降解的不稳定蛋 白或具有毒素活性及对宿主菌有毒害作用的蛋白，胞内表达可以将它们存储在广 泛存在于甲醇酵母细胞内的特异性细胞分隔过氧化物酶体中。因巴斯德毕赤 酵母只分泌很低水平的内源蛋白，分泌表达的外源蛋白纯化非常方便，故分泌表 达为优先选择的方式。一些在其他表达系统中不能分泌的蛋白在巴斯德毕赤酵母 中可分泌表达，如人肠组织蛋白酶在大肠杆菌中的表达以包涵体形式存在，在哺 乳细胞中为胞内表达，而在巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外。但基于蛋 1 0 白稳定性和折叠的需要，分泌表达方式通常限于天然宿主的分泌蛋白，而天然非 分泌蛋白往往难于分泌表达。同样，天然分泌蛋白如血清白蛋白等也难以在胞内 表达为可溶性蛋白【4 5 1 。所以，表达方式的选择受限于目的蛋白本身的特性。 1 3 5 外源蛋白的翻译后修饰加工 在毕赤酵母中表达的外源蛋白一般要经过几个程序的加工才能形成有生物 活性的目的蛋i 兰t t 4 6 1 。对于需要分泌表达的蛋白在其n 端存在信号肽，此类蛋白 要进行信号肽加工，信号肽的加工对外源蛋白的n 端均一化至关重要。某些含 二硫键的蛋白质需要进行二硫键的重建、蛋白构象的正确折叠，以及适度的糖基 化修饰、磷酸化修饰，使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。 此外，如果是糖蛋白，还要经高尔基复合体对蛋白糖链剪切，使表达蛋白的 外链不含a 1 ，3 甘露糖，避免了与酿酒酵母表达系统一样的免疫原性问题。但因 毕赤酵母糖蛋白与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有的潜在抗原性，使其在 医药工业上的应用受到一定的制约，它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而失 去效能，而且有引起超敏反应的危险性【4 7 1 。 1 3 6 培养条件 培养基的组成、p h 值、培养温度、通气状况、培养时间、诱导时间等直接 影响细胞生长量和蛋白的表达水平。对于诱导表达的蛋白和一些自身不稳定的蛋 白，优化培养条件显得更加重要。由于甲醇容易挥发和胞内a o x 酶m u t + 表型细 胞内主要为a o x l 、m u t s 表型细胞内为a o x 2 的活性，培养基中的甲醇会不断消 耗。在培养中后期，甲醇消耗速度加快。如果甲醇耗尽或浓度太低，a o x l 启动 子不能有效启动，外源基因就不能高效转录；若甲醇浓度过高，则会对细胞产生 毒害作用。所以在进行高密度发酵时要维持外源基因的高效表达，应定时取样或 用新近专门设计的甲醇传感器，跟踪监测甲醇浓度的动态变化，在线调整甲醇的 流加速度。 1 3 7 毕赤酵母表达系统的应用 基于上述毕赤酵母表达系统的特点和其相对于其他表达系统的优点，自2 0 世纪8 0 年代建立以来毕赤酵母表达系统就倍受青睐，到2 0 0 0 年，已有3 0 0 多种 外源蛋白在毕赤酵母表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产。其中胞内 分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶产量高达2 2 9 l t 4 引，破伤风片段c 产量高达 1 2 9 l 4 9 1 ，胞外分泌表达的鼠明胶蛋白达到了1 4 8 9 l t 5 0 1 ，组织坏死因子产量达到 6 9 l t 5 1 1 。近几年来，对毕赤酵母表达系统的研究更是突飞猛进。王清路等采用 p p i c