（生态学专业论文）海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究.pdf

中国海洋大学博士研究生毕业论文 海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究 摘要 海带人工育苗是发展我国海带养殖事业的一个重要环节，目前海 带育种中存在的突出问题是海带病烂的发生与抗病力降低，研究海带 病烂发生的机制对于发展海带养殖事业具有重要意义。 本文对从病烂海带表面分离的褐藻酸降解菌的生长和产酶特性进 行了研究。同时，对褐藻酸降解菌感染引起的海带生理生化效应和细 胞生物学效应进行了初步分析，以期为海带病害的发病机理和病害防 治提供基础资料。研究结果表明 褐藻酸降解菌a 1 和a 3 最佳生长和产酶条件是初始培养基褐藻酸 钠含量：o 6 o 7 ，培养基中n a c l 浓度：1 5 ，p h 值：7 5 ，培养 温度：2 0 。c 。 组织显微切片观察表明，褐藻酸降解菌入侵海带的过程为：褐藻 酸降解菌首先侵入内皮层细胞，然后再逐渐侵入到外皮层、髓部和表 皮，最终导致海带的病烂。海带被褐藻酸降解菌感染后，其各种组织 的伤害程度存在明显的差异。相比之下，内皮层细胞的伤害最严重， 其次是外皮层和髓部，表层的伤害最轻。 在褐藻酸降解菌的感染下，海带细胞中出现大量的内含物。内含 物的出现有组织特异性一仅仅发生在内皮层细胞中；内含物的出现具有 普遍性；感染后期内含物逐渐消失；内含物的形状为椭圆形或圆形， ! 垦堡堂茎兰堡主翌塑竺兰些堡苎 直径大小为1 5 4 0 “m 之间，平均直径为2 7 “m 。 细胞超微结构观察表明，叶绿体是褐藻酸降解菌感染最敏感的细 胞器，其次是细胞核，而线粒体是较稳定的细胞器。 叶绿素a 含量和光合速率对褐藻酸降解菌感染表现出相似的响应 规律，即在感染的初期阶段，二者变化不明显，随着感染的继续进行， 二者急剧下降a 在褐藻酸降解菌感染的过程中，可溶性蛋白质的含量 表现出下降的趋势，而可溶性糖的含量呈现出先升高后降低的变化趋 势。p a l 活性对褐藻酸降解菌感染表现出总体下降的的变化趋势，p p o 活性表现出先升高后降低的趋势 利用生物化学的方法探讨了褐藻酸降解菌感染过程中海带体内多 酚含量的变化，并分析了多酚含量的高低与海带对褐藻酸降解菌感染 抗性的相关性a 研究结果表明：褐藻酸降解菌感染下海带体内多酚含 量急剧上升，并且这种变化具有普遍性。多酚含量的急剧上升只发生 在褐藻酸降解菌感染的初期阶段。海带体内多酚含量的高低与海带对 褐藻酸降解菌的抗性具有明显的相关性。表明多酚类化合物在海带抵 抗褐藻酸降解菌的感染中起重要作用。 选用五株感染能力较强的褐藻酸降解菌作为致病菌，研究了细胞 壁组成在海带抗褐藻酸降解菌感染中的变化及其作用。结果表明：海 带在褐藻酸降解菌感染下细胞壁组成的变化具有普遍性。细胞壁组成 的显著变化只发生在褐藻酸降解菌感染的早期阶段，随着感染时间的 中国海洋大学博士研究生毕业论文 不断延长，细胞壁组成的变化不再明显。海带细胞壁组成的变化主要 是褐藻酸成分发生了明显变化，而纤维素、半纤维素和果胶质成分变 化不明显；在感染过程中，海带细胞壁响应变化的幅度大小与海带的 抗感染能力密切相关 研究了褐藻酸降解菌感染过程中海带细胞内活性氧的产生及其变 化规律，探讨了活性氧在海带抗褐藻酸降解菌感染中的作用。结果表 明：褐藻酸降解菌感染引起海带活性氧的大量产生，而且活性氧的大 量产生贯穿于整个感染过程中。活性氧的大量产生具有普遍性，与选 用褐藻酸降解菌菌株和海带的品系无相关性。在褐藻酸降解菌感染的 早期阶段，海带维持着较高的抗氧化能力和对褐藻酸降解菌感染有较 高的抗性，而且海带的抗感染能力与活性氧产生速率呈一定的正相关 性。褐藻酸降解菌感染的后期，海带的抗氧化能力显著降低，膜脂过 氧化和脱酯化伤害作用加剧，同时对褐藻酸降解菌感染的抗性显著降 低，海带的抗感染能力与活性氧产生速率呈一定的负相关性。感染的 早期阶段，活性氧的产生在海带抵抗褐藻酸降解菌的感染中起着重要 作用；而在后期阶段，活性氧的产生又大大降低了海带对褐藻酸降解 菌感染的抗性。海带在感染的早期维持较高水平的抗氧化能力，而在 感染的后期抗氧化能力显著下降是活性氧表现出双重作用的重要原因 之一。 ! 里塑堂奎兰塑主堕塞竺兰些堡奎一 关键词：海带；褐藻酸降解菌；感染，活性氧，多酚，细胞结构 s t u d i e so nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f i n f e c t i o n - r e s i s t a n tr e a c t i o na g a i n s ta l g i n i ca c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i ai nl a m i n a r i aj a p o n i c a a b s t r a c t t h ea q u a c u l t u r ei n d u s t r yi nc h i n ai si nag r o w t hp h a s ea n ds e ak e l p i so n eo ft h em o s tc o m m e r c i a l i z e ds e a w e e ds p e c i e ss of a r h o w e v e r ，t h e k e yl i n kr e s t r i c t i n gt h ep r o d u c t i o ng r o w t hi na r t i f i c i a lb r e e d i n g i st h e d i s e a s eo c c u r r e n c ea n dt h ed i s e a s e r e s i s t a n c ed e c r e a s i n g i t i so f i m p o r t a n tm e a n i n g st os t u d yt h em e c h a n i s m so fd i s e a s eo c c u r r e n c ei ns e a k e l pf a r m i n g i nt h i ss t u d y ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fg r o w t ha n da l g i n a s ep r o d u c t i o n o fa l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i ai s o l a t e df r o md i s e a s i n gk e l pw e r e i n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e ，t h eb i o l o g i c a le f f e c to fi n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i a w a sa n a l y s e di nl a m i n a r i aj a p o n i c a t h er e s u l t s w e r es h o w n ： t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fg r o w t ha n da l g i n a s ep r o d u c t i o ni ns t r a i n a 1a n da 2w e r es o d i u ma l g i n a t e0 6 o 7 ，n a c l1 5 ， c u l t u r e t e m p e r a t u r e2 0 。c ，p h 7 5 t h ec h a n g e so fh i s t o l o g ya n dc y t o l o g yi nl a m i n a r i aj a p o n i c aw e r e s t u d i e db ya r t i f i c i a li n f e c t i o na n dm i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e e n d o d e r m i sw a si n f e c t e df i r s t l yb ya l g n i ca c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i a ；t h ee x o d e r m i s ，p i t ha n de p i d e r m i sw e r ei n f e c t e d l a t e r ；t h ed a m a g eo fe n d o d e r m i sw a sh e a v i e s t ，e x o d e r m i sa n dp i t hw e r e 中国海洋大学博士研究生毕业论文 d a m a g e dl e s sh e a v i e r ，a n dt h ee f f e c to fa l g n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a i n f e c t i o no ne p i d e r m i sw a sn o ti r r e m a r k a l e al o to fs t o r a g em a t e r i a lw a sa c c u m u l a t e do n l yi ne n d o d e r m i cc e l l s o fi n f e c t e dl a m i n a r i aj a p o n i c a d u r i n g i n f e c t i o n b ya l g i n i c a c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i a ；t h ea p p e a r a n c eo fs t o r a g ep a r t i c l e sw a su n i v e r s a l l y a n dd i s a p p e a r e di nl a t e rs t a g eo fi n f e c t i o n ；t h ed i a m e t e ro fs t o r a g e p a r t i c l e sw a sf r o m1 5 u r nt o4 0 u m t h ea v e r a g ev a l u ew a s2 7 u m t h eu l t r a s t r u c u r a lo b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tc h l o r o p l a s tw a st h em o s t s e n s i t i v et oi n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，n u c l e u sw a s m o r es e n s i t i v et h a nm i t o c h o n d r i o n ，a n dm i t o c h o n d r i o ne x h i b i t e dh i g h e r s t a b i l i t yt oi n f e c t i o na l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a t h e c h l o r o p h y l l a c o n t e n ta n d p h o t o s y n t h e s i s r a t e c h a n g e d i r r e m a r k a b l e l y a tt h e e a r l y s t a g e o fi n f e c t i o n b ya l g i n i c a c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i aa n dd e c r e a s e do b v i o u s l ya t t h el a t e s t a g eo f i n f e c t i o n t h es o l u t a b l ep r o t e i nc o n t e n to fk e l pt e n d e dt od e c r e a s ew i t h t h ei n f e c t i o no fa l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a b u tt h es o l u t e ds u g a r c o n t e n ti n c r e a s e da tf i r s ta n dt h e nr e d u c e du n d e rt h es a m e c o n d i t i o n s u n d e ri n f e c t i o nb y a l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，t h e c h a n g eo fp a la c t i v i t yw a ss i m i l a rt ot h a to fs o l u t a b l ep r o t e i na n dt h e c h a n g eo fp p oa c t i v i t yw a ss i m i l a rt ot h a to fs o l u t a b l es u g a r t h ec h a n g eo fp o l y p h e n o lc o n t e n ti nl a m i n a r i aj a p o n i c aw a s i n v e s t i g a t e db y b i o c h e m i c a lm e t h o d s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p o l y p h e n o lp r o d u c t i o n a n dr e s i s t a n c e a g a i n s t i n f e c t i o n b y a c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i aw a sa l s oa n a l y s e d i nl a m i n a r i aj a p o n i c a t h e r e s u l t ss h o w e da s f o l l o w s ：p o l y p h e n o lc o n t e n ti nl a m i n a r i aj a p o n i c a i n c r e a s e ds h a r o l yu n d e ri n f e c t i o nb ya c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，a n dt h e c h a n g e o f p o l y p h e n o l c o n t e n te x h i b i t e d p o p u l a r t h e r e m a r k a b l e i n c r e a s i n go fp o l y p h e n o lc o n t e n to c c u r r e do n l yi nt h ee a r l ys t a g ed u r i n g i n f e c t i o nb ya c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a t h ep o l y p h e n o lp r o d u c t i o nh a d c l o s er e l a t i o n s h i pw i t hr e s i s t a n c ea g a i n s ti n f e c t i o nb ya c i dd e c o m p o s i n g 中国海洋大学博士研究生毕业论文 b a c t e r i a t h e r e f o r e ，p o l y p h e n o lp l a y e dai m p o r t a n tr o l ei nr e s i s t a n c e a g a i n s ti n f e c t i o nb ya c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i ai nl a m i n a r i a j a p o n i c a f i v e a l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i as t r a i n sw e r es e l e c t e d t o i n v e s t g a t e dt h ec h a n g e s a n dr e a c t i o no fc e l lw a l l c o m p o s i t i o n i n l a m i n a r i aj a p o n i c a a g a i n s t i n f e c t i o no fa l g i n i ca c i d d e c o m p o s i n g b a c t e r i a t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ：t h ec h a n g e so fc e l lw a l l c o m p o s i t i o ni n l a m i n a r i aj a p o n i c ad u r i n gi n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i aw a sd e m o n s t r a t e du n i v e r s a l l y t h en o t a b l ec h a n g e s o fc e l lw a l lc o m p o s i t i o no c c u r r e do n l yo ne a r l ys t a g eo fi n f e c t i o nb y a l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，a n dw i t hl a s t i n g n e s so fi n f e c t i o n ，t h e c h a n g e so fc e l lw a l lc o m p o s i t i o na p p e a r e di r r e m a r k a b l y t h ec h a n g g so f c e l lw a l lc o m p o s i t i o ni nl a m i n a r i aj a p o n i c aw e r em a i n l ye x p r e s s e db y a l g i n i ca c i d ，a n d w e r en o tr e l a t e dt o c e l l u l o s e ，s e m i c e l l u l o s e a n d p e c t i n t h el e v e lo fc e l l w a l lc h a n g ed u r i n gi n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i d d e c o m p o s i n gb a c t e r i ah a dac l o s er e l a t i o n s h i pw i t ht h ei n f e c t i o n r e s i s t a n t a c t i v i t yo fl a m i n a r i aj a p o n i c a t h ep r o d u c t i o na n di t sr e a c t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) i n l a m i n a r i aj a p o n i c a a g a i n s t i n f e c t i o no f a l g i n i c a c i d d e c o m p o s i n g b a c t e r i aw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ：t h ei n f e c t i o n o fa l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i ar e s u l t e di nm a s s i v e p r o d u c t i o no f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a n dt h em a s s i v ep r o d u c t i o no fr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e ss u s t a i n e dd u r i n gw h o l ep r o c e s so fi n f e c t i o n t h ep r o d u c t i o no f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nl a m i n a r i aj a p o n i c ad u r i n gi n f e c t i o no fa l g i n i c a c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i aw a sd e m o n s t r a t e du n i v e r s a l l y o ne a r l ys t a g e o fi n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ，t h el a m i n a r i aj a p o n i c a s h o w e dh i g h e ra n t i o x i d a n t i v e a c t i v i t y a n dh i g h e rr e s i s t a n c e a g a i n s t i n f e c t i o n ，a n di t sr e s i s t a n c ea g a i n s ti n f e c t i o nh a dp o s i t i v er e l a t i o n s h i p w i t hp r o d u 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o r t a n t r o l ei nr e s i s t a n c ea g a i n s ti n f e c t i o no fa l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a o nt h ec o n t r a r y ，t h ep r o d u c t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s g r e a t l y d e c r e a s e dr e s i s t a n c e a g a i n s t i n f e c t i o no f a l g i n i c a c i dd e c o m p o s i n g b a c t e r i a t h es u s t e n a n c eo fh i g h e ra n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ne a r l ys t a g eo f i n f e c t i o na n ds h a r pd e c r e a s eo fa n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo nl a t e rs t a g eo f i n f e c t i o nb ya l g i n i ca c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i ai so n eo fi m p o r t a n t r e a s o n sw h i c hr e s u l t e di nc o n t r a d i c t o r yr e a c t i o no fr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s k e yw o r d s ：l a m l n a r i a j a p o n i c a ：a l g i n i e a c i dd e c o m p o s i n gb a c t e r i a ： i n f e c t i o n ；r e a c t i v eo x y g e n ；p o l y p h e n o l ，c e l ls t r u c t u r e 海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究 第一章前言 1 海带生活史特征及细胞工程技术在育苗育种中的应用 1 1 海带的经济地位 海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 是我国海水养殖的重要经济品种，在我国的海水 养殖中占有重要的经济地位，主要体现在以下几个方面： 工业方面：以海带为原料提取的碘、胶、醇，广泛应用于医药、纺织、印染、 橡胶、机械、陶瓷等领域，具有重要的工业价值。 药用和保健方面：碘是人体必需的微量元素之_ 。据世界卫生组织( w h o ) 统计，全世界缺碘人群达1 2 亿，其中我国就占5 亿。根本原因在于我国食用的 加碘盐中的无机碘是从矿物硝石或石油废水中提取的，安全性差，吸收率低，而 且易诱发碘致甲亢：而海带中的生物有机碘安全无毒，既可防治缺碘甲肿，又可 防治高碘甲肿。同时海带中富含海藻多糖等特效成分，可制备多种海洋药物，因 此海带具有重要的药用和保健价值。 环保方面：海带是绿色安全的可再生产品，海带纸、纤维海带纸盒等食品包 装器皿已经投入批量生产；有关专家认为：尽快推广该产品，不仅成本低廉，产 量巨大，而且无污染，保护环境。因此海带具有重要的环保价值。 生态方面：有计划有步骤地发展海带养殖既是提供重要产品的需要，也是调 节、优化养殖生态环境的需要；近年来，随着我国海带养殖面积的增加，工业污 水大量排放，海水污染严重，赤潮频繁发生，水产养殖生物病害加剧，对我国的 海水养殖业造成严重的威胁。海带被誉为“海中森林”，有助于净化海域环境，使 海洋生态结构产生良性变化。因此，大力发展以海带为主的海藻养殖，具有重大 的社会经济意义【1 8 】。 我国的海带养殖起步于二十世纪四十年代，五十年代后有了较大的发展，逐 渐建立起相对完整的科学养殖体系；根据2 0 0 0 年的统计，我国海带养殖面积已 达2 4 1 2 7 h a ，养殖产量达8 3 0 4 1 0 t ，占世界海藻栽培总产量的5 0 以上，出口产 品占世界市场的8 0 ，养殖产量、规模连续多年居世界第一，位居藻类养殖的首 位。 中国海洋大学博士学位论文 1 2 海带的生活史及其配子体的形态特征 1 2 1 海带的生活史 海带的生活史具有明显的异形世代交替现象9 “0 】，海带生活史是由大型的 孢子体世代( 生产对象) 与微小的配子体世代相互交替而组成。孢子体个体大， 为人工栽培的对象，占生活史时间长。海带的配子体为微小的丝状体，配子体世 代是人工培育苗种的对象。 图1 海带的生活史 f i g 1l i f ec y c l eo f k e l p 1 2 2 海带配子体的形态特征 海带生活史中，配子体存在的时间很短，在适宜的条件下只有两个星期左右。 海带的雌配子体多为单细胞的藻体，但也有几个细胞的。单个细胞形成的雌 配子体多为球形或梨形，直径1 1 2 2l am 。最初几天，色泽较淡，以后色素加深， 迅速变为棕褐色。 雄配子体一般由多个细胞组成，细胞小于雌配子体细胞，直径为5 8 l am 。 1 3 海带苗种的发展历史 海带苗种是海带养殖的根本基础，是发展海带养殖必须解决的首要问题。多 年来，为了适应我国海带养殖产业的发展，对海带苗种的培育工作进行了不断的 研究、创新工作。 1 9 5 4 年以前，我国海带养殖生产用的幼苗，主要是采用自然海区育苗法培育 的秋茁，即利用海带孢子体在秋季自然成熟放散游孢子的习性，用劈竹等育苗器 采集海带游孢子，然后将其悬挂在设于海中的浮筏上进行培育，使其形成配子体 2 海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究 并获得海带幼孢子体。该法首次解决了海带养殖的苗种问题，但存在游孢子生产 不稳定、产量低、劳动强度大等问题。因此当夏苗出现后，秋苗很快被夏苗所代 替。 夏苗是利用渡夏前成熟的种海带进行孢子采集，并在室内人工低温条件下培 育而成。1 9 5 5 1 9 5 8 年为夏苗发展的初级阶段，即冷库日光灯育苗法，在普通 的低温室内用日光灯作光源，静水培育幼苗。 1 9 5 8 年至今，采用自然光低温流水育苗法。 此外，有关科研和生产单位，曾经进行了春苗和二年苗的培育试验，但未取 得理想的结果。目前我国海带生产上所使用的苗种，几乎全是自然光低温流水育 苗法培育的夏苗。 1 4 海带细胞系技术的应用及研究概况 1 4 1 海带细胞系技术的建立 y a b u 报道( 1 9 6 4 ) 1 1 1 ，在海带雌雄配子体培养的过程中，分离培养能大大 促进配子体的有丝分裂，并且不同的营养盐也可促进雌配子体的细胞分裂。 我国的海带细胞系即无性繁殖系技术建立于二十世纪七十年代末，方宗熙先 生等【1 2 】发现在人为的分离培养条件下，某些物理化学条件如维生素c 处理【1 3 1 、 低温的连续光照和较高温度1 4 1 等，可促进海带雌、雄配子体进行营养生长形成细 胞系( 即无性繁殖系) 1 2 l 。海带细胞系技术的建立在种质资源的保存、分子生物 学、遗传学、海带育种等方面都有重要价值。 1 4 2 海带细胞系技术的应用 1 4 2 1 海带细胞系在种质资源中的应用 由于海带配子体世代在海带的生活史中只有两周左右的时间，使得有关海带 配子体的研究受到季节性的限制。海带细胞系技术的建立，为海带遗传育种和生 理、生化实验提供了基础，也使配子体的长期保存成为可能。目前主要的海带细 胞系保存方法为低温弱光保存法【1 5 1 。 对自然界的生物来说，保护天然群体的基因库，维持生物多样性是种质资源 开发和保护的主题之一【1 61 7 】。海带细胞系长期保存技术的建立，为海带种质库 中国海洋大学博士学位论文 的建设提供了切实的技术保证。 1 4 2 2 海带细胞系在生理、生化和遗传学研究中的应用 海带细胞系是研究海带生理、生化、遗传的手段之一，以细胞系为研究对象， 比孢子体更方便、容易培养，而且节约时间和设备，易于较快地取得成果。另外， 海带细胞系亦是进行海带原生质体培养研究的方便材料1 8 】。 有关海带细胞系的生理、生化研究，主要包括无机 1 9 - 2 2 】和金属元素 2 3 - 2 5 j 、植 物生长激素【2 6 。3 1 】和其他因素对海带细胞系的影响【3 2 l3 3 1 。 由于海带孢子体组织培养技术尚不完善，以孢子体为研究对象品种不够丰 富，且海带细胞富含多糖物质在技术上对d n a 的提取、纯化也有一定的难度， 而利用细胞系提取d n a ，用分子标记技术，获得种( 品) 系的特征图谱，建立 其“基因图谱”，用以研究海带遗传多样性和辅助育种，是一项可靠有效的方法 1 3 4 1 。 1 4 2 3 海带细胞系在育种中的应用 1 ) 单倍体育种 海带细胞系在分离培养条件下，经过较长时间的营养生长后，雌、雄细胞系 在适宜条件下仍能正常发育为孢子体植株1 3 】。 ( 1 ) 雄配子体单性生殖无配生殖 海带的无配生殖是指雄配子体细胞不形成配子，而直接发育成叶状体【3 5 】。 1 9 7 9 年，蒋本禹【3 6 】等报道了由海带雄配子体培育出成熟的大孢子体，并能产生 孢子。戴继勋等吲( 1 9 9 7 ) 报道自然野生海带的雄配子体在培养温度为8 1 2 c ， 光照强度为1 5 0 0 2 0 0 0 l u x ，光照时间为1 0 h d 条件下，经过2 3 个月的培养， 部分丝状体细胞可发育成叶状体。由无配生殖发育的叶状体，正常形态的个体很 少，其中绝大多数为畸形个体，染色体数目均为单倍体f 拥。经海上养成后，藻体 不产生孢子囊，为高度不育。 ( 2 ) 雌配子体单性生殖一孤雌生殖 我国有关海带孤雌生殖的研究开展较早 3 8 - 4 0 l ，野生杂种海带的雌细胞系在培 养温度为8 1 2 c ，光照强度为1 5 0 0 l u x ，光照时间l o t g d t 4 3 】的条件下能够成熟 海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究 排卵，大约5 0 左右可经细胞分裂长成孢子体，但这些孢子体绝大多数为畸形； 正常孢子体经海上养成后，多数都能成熟并放散孢子，最终全部长成雌孢子体， 即完成了海带雌性生活史【4 1 “2 1 。 雌细胞系为多细胞的丝状体，为孤雌生殖提供了较多的机会【4 3 1 。由于雌配子 体进行孤雌生殖比雄配子体进行无配子生殖容易，因此多用雌配子体做单倍体育 种的材料。单倍体育种的速度较快，一旦找到符合要求的单倍体植株，经过染 色体加倍，即可得到性状稳定的海带新品种。“单海一号”就是用单倍体做材料培 育出来的新品种。 2 ) 杂交育种 有性杂交育种是选育新品种的一个重要而有效的方法。利用分离保存的海带 雌、雄细胞系，可以更容易地实现两个品种( 系) 间的杂交4 5 1 ，有目的地把亲本 的优良性状结合在杂交后代里，选育出兼有两个亲本优良性状的新品种，大大缩 短选育周期，提高育种效率。烟台海带良种场利用两个品种的海带雌、雄细胞系 进行杂交选育出的东方2 号杂交海带，其后代表现出明显的杂种优势，目前已通 过鉴定和品种初审，有望成为抗逆性强、高产的新品种。“单杂1 0 号”也是利用 单倍体雌性和雄性克隆杂交而获得的具有明显杂种优势的杂交组合，产量比已推 广的优良品种增产6 0 以2 ：1 4 6 - 4 8 j 。 1 5 细胞系育苗与传统育苗方法的区别及优点 传统的海带育苗方法即夏苗培育法是以海带的生活史为依据，海上培育种海 带，七月份室内采孢子，在人工降温、流水、自然光条件下使海带渡过其配子体 世代，1 0 月中、下旬培育成l 2 厘米的幼孢子体，待自然海水水温降到适宜温 度时( 低于2 0o e ) ，幼苗出库进行海上养殖；幼苗需在育苗室低温培育3 个月左右。 海带夏苗培育法自二十世纪六十年代创立以来，解决了我国海带养殖的苗种来 源，极大地推动了海带养殖业的发展。它是由大量的叶状体( 孢子体) 获得游孢 子开始育苗的，这种由大量藻体植株得到苗源的人工育苗技术本身就不是一种完 善的良种体系，因为由众多的个体产生孢子得出的后代，只能是易变和易退化的 混杂栽培种群。因而，必需近早解决海带良种种质的分离、纯化、保存的问题， 解决良种种质的扩大培养和有效地导入生产的关键技术【”，用海藻细胞工程发展 中国海洋大学博士学位论文 我国海藻养殖业己成为目前海藻栽培研究工作的当务之急0 9 。 随着科技的进步，海带育苗方法由传统方式向生物技术细胞工程转化已成为 必然的趋势【5 0 1 。海带细胞系育苗是利用细胞系进行海带育苗( 将室内培养的细胞 系切割，使其附着于基质上，同样低温、流水、自然光培育) 的一种育苗方式， 这种全新的育苗方法较现行的育苗方法有以下优点：一、工艺简单，育苗前的细 胞系培养，在一定规模的器皿中进行即可，减少了传统育苗需海上养殖及选择种 海带环节，节省大量人力、物力和财力。二、细胞系育苗避免了大量种菜混合繁 殖对品种纯度的影响，能够长期保持品种的优良性状，较大程度上解决目前海带 品种退化、混杂问题。三、细胞系在室内人工条件下培养，可随时根据生产需要 进行采茵、育苗，而不受季节变化的严格限制，同时也避免了种海带养殖中生长 发育时常受到不利因素干扰而影响育苗生产的问题。四、为杂种优势在生产上大 面积应用，育种成果向生产过渡提供了条件，为育种和新品种的快速推广探索出 了一条有效途径。以细胞系育苗工艺改革现有的海带育苗方式是实现海带产业可 持续发展的重要环节，是科技成果转化为生产力的具体体现。 海带细胞系具有遗传一致性和发育全能性的特点，利用这些生物学特性能够 克服传统育种和育苗技术的缺点和不足；细胞系育苗是一种利用海带细胞系将育 种和育苗结合起来的新方法【5 1 】。其技术路线大致如下1 5 2 】：1 ) 建立优良品系海带 的细胞系无性系；2 ) 进行多组合杂交，筛选具有优良性状的f l 代孢子体：3 ) 丰富培养具有优良性状孢子体的亲代的雌雄细胞系；4 ) 利用大量的雌雄细胞系 进行种苗生产。要实现这一路线，需要解决两个关键的问题，一是细胞系的丰富 培养问题，细胞系是育种的材料，大量的细胞系又是育茁的基础；因此，研究缅 胞系合适的生长条件，使其具有较高的生长速率，获得足够量的细胞系是解决这 一问题的关键；二是细胞系的发育调控问题，即在适当的时间，改变环境条件， 使其从营养生长状态转为发育状态，诱导孢予体的发生，实现育种和育苗的目的。 海带细胞系技术自二十世纪7 0 年代建立以来，我国的藻类工作者在利用细 胞系育苗方面进行了大量的研究工作，是提出了构想，即人工控制温、光、盐， 快速、大量繁殖海带配子体，并用以附苗和幼苗的培育；二是研究出了细胞系培 养的适宜温、光、盐等因子；三是进行了小型试验。但迄今为止，有关配子体无 性繁殖系的大规模培养所达到的水平及相应的技术参数尚未见报道，细胞系生产 性育苗尚无系统的技术工艺，细胞系育苗中的脱苗难题也一直没有得到较好的解 6 海带抗褐藻酸降解菌感染反应的生物学特征研究 决，我国海带苗种繁育仍然沿用孢子体采苗育苗模式。 2 我国海带病害的研究概况 海带育苗技术的不断改进，使得海带生产成本不断降低，育苗量倍增，产量 直线上升，促进了海带养殖业的迅速发展。二十世纪五十年代末，中科院海洋研 究所吴超元同中国海洋大学方宗熙合作，对海带数量性状遗传与变异进行了研究 和新品种培育；中科院海洋研究所和水产院黄海水产研究所合作，于7 0 年代中 期，培育出高产高碘海带新品种；8 0 年代中国海洋大学和中科院海洋研究所分 别培育出优良杂交种和单倍体品系。很多有关海带的研究成果，均居世界领先地 位。随着海带养殖过程中病害的问题越来越突出，我国对海带病害的研究也开展 起来，主要进行了以下几个方面的研究工作。 2 1 海带养殖中常见病害的分类 海带养殖过程中出现的病害问题严重影响着海带的生产，随着我国海带养殖 业在沿海地区的展开，海带病害随之普遍出现，有关海带病害的报道也屡见不鲜。 国外科学工作者对海带病害也非常关注，l i m i n ( 1 9 9