葡萄酒中苹果酸的测定.doc

葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuantTM (专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1) L-苹果酸 + NAD+ (L-MDH) oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate (GOT) L-aspartate + 2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，生成甲基- INT(3) NADH + INT + H+ (diaphorase) NAD+ +甲基-INT生成的甲基- INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基- INT的吸光度值可在505nm下测量。特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4 mg/L。该实验的测量范围为0.15-15ug L-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75 g/L)，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:红酒中的酚醛树脂会对本试验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。在用MegaQuantTM测定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1. 使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着 “缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。2. 推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5 mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2 % (v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干扰试验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4 g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高( 400 mg/L)，则不能进行测定。向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5 ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。通过向样品中添加标准质控做定量回收试验，计算样品在处理和提取时的损失。安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:MegaQuantTM L-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (100 mL, 100 mM, pH10.0) +L-谷氨酸(100 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性 2年，4C保存。瓶2: 药片（60粒）-含有心肌黄酶, GOT, INT, FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性 2年，-20C;干燥保存。瓶3: L-苹果酸脱氢酶(1.3 mL, 15,000 U/mL)稳定性 2年，4C保存。瓶4: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.375 mg/mL)稳定性 2年，4C保存。瓶5: 药片（65粒）-含有PVPP稳定性 5年，室温保存。试剂制备:1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。每个试验用量1.5 mL，也可以同等量的蒸馏水稀释，然后每个试验用3 mL。2. 备用试剂盒中的瓶2随时使用。保存于-20C下稳定性 2年。3. 准备瓶3中的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。4. 备用试剂盒中的瓶4溶液随时使用。使用前恢复到室温，每个试验用量20uL5. 准备瓶5溶液随时使用。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用L-苹果酸标准质控溶液进行测定，通过提供的公式计算L-苹果酸的浓度。实验需要的设备:1. 检测仪中提供有特定的测试用试管(平底; 16 x 100 mm)，同时我们也提供提取用试管(cat. no. G-MQTB25)2. 10 mL聚丙烯试管3. 微量移液器(20 uL).4. 连续分配器5. 玻璃刻度移液管及吸球6. MegaQuantTM测定仪7. 定时钟注意:1. 此方法是专门用于测定经过苹果乳酸发酵的葡萄酒，如果葡萄酒中的L-苹果酸浓度 0.75 g /L，需要对样品进行稀释。 2. 稀释葡萄酒或葡萄汁必须使用纯净水（蒸馏水或高质量的水），如果使用饮用水，首先需要用D-果糖标准品验证是否适合使用。3. 测试用试管使用前必须清洗干净并烘干。操作步骤:去除酚醛树脂:(对于红酒通常需要进行处理)1. 取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中2. 加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用Whatman No. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，具有深颜色的葡萄酒每5 mL需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。3. 取20uL滤液进行测定A. 测试方法A. (简单法 参照图1)1. 取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。2. 用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3. 加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的(未稀释的红/白葡萄酒), 未经PVPP处理的(未稀释的白葡萄酒)或经稀释的葡萄酒或葡萄汁，充分振荡混合。4. 大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示-（大约2秒钟）。5. 当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A1）6. 取下试管，加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。7. 再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示1 second,记录下数值A2。8. 为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值不再变化。（参考图1和图2）注意:1. 如果数值A2 1.00，10倍以上稀释样品，并再次测定，如果数值A2 0.10，样品不要进行过分稀释（将100倍稀释改为10倍稀释）。2. 由于INT对光有敏感性（显色剂在药片中），长时间的反应将导致溶液颜色加深，因此必须按照推荐的操作方法进行测定。3. 在进行试验前，瓶1提前从冰箱中取出，并恢复到室温，如果温度 23C，反应过程将很快结束。4. 添加药片到1.5 mL溶液1和1.52 mL蒸馏水中，确保药片全部溶解后测定的 0 吸光度值作为空白对照，然后加入20uL 的L-苹果酸脱氢酶（瓶3），5分钟后测定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度变化(A2)是没有意义的（如由0.00到0.01）。计算:AL-苹果酸 = 增加的吸光度值 (A2)按照常规AL-苹果酸 的数值至少要在0.10个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:未经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.771 x 稀释系数 x AL-苹果酸 g/L经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x AL-苹果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数 x DAL-苹果酸 g/L注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图 1. 用分光光度仪测定(25C, 1 cm管径)的MegaQuantTM L-苹果酸随时间的变化。注意: 用此方法测定的L-苹果酸浓度比图3中测定的浓度要低，是由于此方法中使用的测试管管径为1 cm，而MegaQuantTM测试管大约为1.3 cm.测试方法 B (对 “缓慢反应”的处理)1. 取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。2. 用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3. 加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的红葡萄酒，充分振荡混合。4. 大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示-（大约2秒钟）。5. 当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A0），同时记录时间。6. 取下试管5分钟，再次插入试管按下开关直到屏幕上显示1 second，插入试管前不要按压按钮，否则将导致测定仪读取错误 ,记录下数值A1（经过5分钟由于存在缓慢反应将导致颜色增深）。7. 取下试管，立即加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。8. 再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示吸光度,记录下数值A2。9. 为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值变化不超过0.01个吸光单位。（参考图1和图2）计算:AL-苹果酸 = (A2-A1) - (A1-A0)由于A0数值为0，因此可以简化为：AL-苹果酸 = A2 - (2 x A1)例如（参照图1）: A2 = 0.42；A1 = 0.02AL-苹果酸 = 0.42 - (2 x 0.02) = 0.42 - 0.04 = 0.38按照常规AL-苹果酸 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x AL-苹果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数 x DAL-苹果酸 g/L注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图 2. 用分光光度仪测定(25C, 1 cm管径, 492nm)的MegaQuantTM L-苹果酸随时间的变化。测试样品为用PVPP处理并过滤的不同浓度的红葡萄酒（0-18ug），加入样品后测得A0，经过5分钟反应测定吸光度A1，可计算出“缓慢反应”比率，然后加入L-苹果酸脱氢酶（20uL）继续反应10分钟5分钟后测定吸光度值A2，如果使用MegaQuantTM测试仪进行测定，A0的吸光度值为0。制备样品:稀释样品.比色杯中（如：分析20 uL的样品）的L-苹果酸含量必须在1.54-15ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.007 -0.75 g/L之间。估计L-苹果酸浓度(g/L)蒸馏水稀释稀释系数F 0.750.75-7.57.5-75不用稀释1 + 91 + 99110100样品处理事例:(a) 测定葡萄汁和白葡萄酒中的L-苹果酸含量测定白葡萄酒和葡萄汁中的L-苹果酸含量，样品通常不需要处理，可直接进行测定。如有必要可以进行稀释。样品处理事例:(b) 测定红葡萄酒中的L-苹果酸含量取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中，加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用Whatman No. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，如果滤液为深红色，还要在进行处理，但需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。澄清的或浅粉色的滤液可以直接进行测定。(c) 测定葡萄中的L-苹果酸含量取200 mL蒸馏水加入到500 mL的量筒中，加入葡萄使体积刚刚超过400 mL，再加入400 mL以上的等体积蒸馏水（如: 总体积为420 mL，需另外加入蒸馏水20 mL），这样就等同于对葡萄进行了2倍稀释，然后充分均质3分钟，然后用Whatman No. 1（9 cm）滤纸过滤，弃去最初的几mL滤液，收集后来的5-10 mL滤液，稀释后可以直接进行测定。单个葡萄也可以进行测定，压碎葡萄收集葡萄汁到10 mL的量筒中，然后用等体积的蒸馏水稀释，混合均匀后过滤，收集的提取液稀释后可以直接进行测定。图 3. 用MegaQuantTM 测定仪测定的L-苹果酸浓度(ug/每个测定)相对于吸光度的标准曲线（室温; 505 nm）参考文献:1. McCleary, B.V. and Charnock, S. J. (2005). Reagent components in tablet form for colorimetric assays of food and beverage analytes. Patent submitted.2. Mollering, H. (1985). L-Malate. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VII, pp. 39-47, VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.验证MegaQuantTM 测定仪和L-苹果酸测试的精确性和可靠性:1. 我们可以提供用于MegaQuantTM 测定仪校验标准，仪器参数在使用过程中不应改变。2. 可以通过试剂盒中提供的L-苹果酸质控标准验证MegaQuantTM 测定仪的准确性，将样品替换为L-苹果酸质控标准20uL，按照试验步骤进行测定，可以得到的吸光度(A2-A1)为0.49，如果存在差别