（预防兽医学专业论文）马γ干扰素单克隆抗体的制备及细胞免疫评价方法的研究.pdf

摘要 卜干扰素( i f n - y ) 是机体内一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调1 ，功能的重要细胞因子。 研究表明，内源性i f n - y 水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，因此对样 本中的i f n y 进行定鼍分析对免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果评估、器官移植、 过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等方面都具有极其重要的理论意义和应用价值。然 而，迄今没有应用于检测马i f n 吖的单克隆抗体，用以建立相应的检测方法。本研究旨在建 立检测马i f n 吖( e q u i n ei n t e r f e r o n - y ，e i f n 丫) 抗原捕获e l i s a 、细胞内细胞因子染色( i c s ) 和酶联免疫斑点试验( e l i s p o t ) ) 等方法，从而为监测马机体免疫状态、研究机体感染或 免疫过程中的免疫效应及探讨相关免疫机制等提供技术平台。 为此，本研究在克隆表达e i f n - y 之后将其免疫小鼠制备了马i f n - y 单克隆抗体，然后分 别对其进行生物素和荧光素( f i t c ) 标记制备了生物素标记的马i f n y 单克隆抗体和f i t c 标记的马i f n 吖单克隆抗体，在此基础上成功建立了检测e i f n 吖的相关免疫学方法。 首先，从c o n a 刺激的马外周血单核细胞( p b m c ) 中采片jr t p c r 扩增获得含信号肽的 马i f n - t 的编码序列，将其克隆至载体p c r 2 1 t o p o 中。然后以从重组质粒p c r e i f n y 为 模版扩增获得编码马i f n - y 成熟蛋i 刍( m a t u r ee i f n 一丫，m e i f n 吖) 的基冈，并将其弧克隆至原核 表达载体p e t 一2 8 “+ ) 。经p c r 、酶切及序列测定后所获得的重组子转化至人肠杆菌感受态 细胞b l 2 1 ( d e 3 ) ，经i p t g 诱导，将其产物进行s d s p a g e 分析和w e s t e r nb l o t 鉴定。利用 表达绿色荧光蛋白( g f p ) 的重组水泡性口炎病毒( v s v * g f p ) 作为指示病毒对所表达的 e i f n - 丫进行抗病毒活性测定。结果表明，m e i f n 丫开放阅读框全长为4 4 l b p ，编码1 4 6 个氨 基酸；其在大肠杆菌表达系统的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，重组蛋白相对分 子量约为1 8k u ，且具有免疫反应活性。采用n i + 亲和层析对大肠杆菌表达系统所表达的 m e l f n 丫在非变性和变性条件下分别进行纯化，均获得了高纯度的重组马i f n 丫，且该重组 蛋白具有抗病毒活性，其活性单位为1 1 0 3 a u m l 。 将原核表达的重组e i f n - y 免疫b a l b c 小鼠( m u sm u s c u l u s ) ，经4 次免疫后，取脾细 胞与s p 2 0 骨髓瘤细胞进行融合，以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马i f n - y 作为检测抗 原进行间接e l i s a 检测筛选，最终获得1 2 株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免 疫荧光( i f a ) 实验对1 2 株单克隆抗体进行鉴定，结果表明，所获得的1 2 株细胞分泌的抗 体均为针对e i f n - y 的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示，其中4 株为i g g l 、2 株 为l g g 2 a 、3 株为i g g 2 b 和其余3 株为i g m ，而且所有1 2 株单克隆抗体的轻链均为k 链。将 此1 2 株单克隆抗体分别与两个截短表达的重组马i f n 丫蛋白( g s t - m e i f n - y ( 1 8 4 l 和 g s t - m e i f n - 弧8 0 - 1 4 6 ) ) 进行特异性e l i s a 检测，结果表明，其中有7 株单克隆抗体识别 g s t = m e i f n - t ( 1 8 4 1 ，而另5 株单克隆抗体与g s t - m e i f n y ( 8 0 - 1 4 6 ) 发生反应，说明所获得的1 2 株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。而且，其中一株单抗( s b l 0 ) 具 有抑制重组e i f n y 抗病毒活性作用。 将两株识别不同表位的抗马i f n 丫单克隆抗体腹水( a 5 和s b l 0 ) 纯化后，对其中一株 纯化后的单抗( s b l 0 ) 进行生物素标记，通过对重组e i f n - y 进行e l i s a 检测来建立马卜干 扰素双抗体夹心e l i s a 。经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1 p g m l ，检测抗体 的t 作效价为1 ：1 0 0 0 。利用建立的方法对不同稀释度的重组马i f n - y 和丝裂原刺激的马外周 血单核细胞培养上清进行检测。结果表明，此方法检测敏感度达到1 n m l ，特异性良好。 利用荧光素f i t c 对纯化后的抗马i f n - y 单克隆抗体( s b l 0 ) 进行标记，制备f i t c 标 记的抗e i f n - y 单克隆抗体，然后采用该抗体对马外周血单核细胞进行胞内e i f n 吖单染色， 之后进行流式细胞术检测，并且与商品化的f i t c 标记的抗牛i f n - y 单克隆抗体( c c 3 0 2 ) 进行对比试验。结果表明，f i t c 标记的抗e i f n - y 单抗能够有效地应用于刺激后的马外周血 单核细胞的胞内染色检测。 分别将识别e i f n - y 不同表位的配对单抗作为捕获抗体和检测抗体，对经刺激的马p b m c 所分泌的i f n - y 进行e l i s p o t 检测，从而建立检测马丫干扰素e l i s p o t 方法。经过方阵滴 定实验确定捕获抗体的包被浓度为1 p g m l ，检测抗体的工作浓度为1 ：1 0 0 0 。 本研究所初步建立的检测e 1 f n - y 的抗原捕获e l i s a 、细胞内细胞冈子染色及e l i s p o t 方法，可为监测马机体免疫状态、研究机体感染或免疫过程中的免疫效应及探讨相关免疫机 制等提供技术平台。 关键词：马i f n - y ；单克隆抗体；抗原捕获e l i s a ；细胞内细胞冈子染色： 酶联免疫斑点试验 a bs t r a c t i n t e r f e r o n - 7 ( i f n - 1 , ) i sap l e i o t r o p i cc y t o k i n e ，e s p e c i a l l yi nc e l l - m e d i a t e di m m u n i t y t h el e v e lo f e n d o g e n o u si f n - ) , i sa ni m p o r t a n ti n d e xt oe v a l u a t et h ec e l l u l a ri m m u n es t a t u s s o ，m e a s u r e m e n t o ft h ep r o d u c t i o no ft h i sc y t o k i n ew o u l db eag o o di n d i c a t o ro fi m m u n i t y a l s o ，t h eq u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o no fi f n - 7c o n c e n t r a t i o n si sh i g h l yv a l u e db o t hi nt h e o r ya n dp r a c t i c e ，w h i c hc a n f a c i l i t a t et h es t u d i e so ni m m u n em e c h a n i s m ，i m m u n ef u n c t i o n ，v a c c i n ee v a l u a t i o n t r a n s p l a n t o p e r a t i o n 、a n a p h y l a c t o i dr e a c t i o na n di n t r a c e l l u l a rp a t h o g e nd i a g n o s i s m ys t u d yf o c u s e so nt h e e s t a b l i s h m e n to fs o m ed e t e c t i o nm e t h o d st oe q u i n e i n t e r f e r o n - y ( e 1 f n 丫) ，s u c ha ss a n d w i c h e l i s a ，i n t r a c e l l u l a rc y t o k i n es t a i n i n g ( i c s ) a s s a ya n de l l s p o ta s s a y t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mt h e e q u i n ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c s ) s t i m u l a t e dw i t hc o n aa n du s e da st h et e m p l a t e t h ef u l l - l e n g t ho fe i f n - 7e n c o d i n gg e n ew a s a m p l i f i e db yr t - p c ra n dc l o n e di n t ot h ev e c t o rp c r 2 1 一t o p o t h e nt h eg e n ee n c o d i n gm a t u r e e i f n 吖( m e i f n - y ) w a sa m p l i f i e df r o mt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dn a m e dp c r e i f n - ya n d s u b - c l o n e di n t o p e t - 2 8 a ( + ) a f t e rs e q u e n c i n g c o n f o r m a t i o n ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p e t 。m e i f n - 7w a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21 ( d e 3 ) s u b s e q u e n t l y t h ef u s i o np r o t e i nw a s e x p r e s s e dw i t ht h ei n d u c t i o no fi p t ga n dp u r i f i e dw i t hn i p n t ac o l u m n t h ea n t i v i r a la c t i v i t yo f t h er e c o m b i n a n tm e l f n 一丫w a se v a l u a t e db yu s i n gav e s i c u l a rs t o m a t i t sv i r u se x p r e s s i n gg f p ( r v s v - g f p ) s y s t e mi ne f k - 7 8c e l l s t h eg f pe x p r e s s i o nl e v e ld r a m a t i c a l l yd e c r e a s e di nt h e e i f n - yt r e a t e de f k - 7 8c e l l si nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r , c o m p a r i n gw i t ht h em o c k - t r e a t e dc e l l s t h et i t e ro fa n t i v i r a la c t i v i t yw a s1 10 3a u m l b a l b cm i c e ( m u sm u s c u l u s ) w e r ei m m u n i z e di n t r a p e r i t o n e a l l yw i t hp u r i f i e dr e c o m b i n a n t m e i f n - yp r o t e i n m u r i n em y e l o m ac e l l sw e r ef u s e dw i t ht h es p l e n o c y t e so r i g i n a t e df r o mt h e i m m u n i z e dm i c e a ni n d i r e c te l i s aw i t hr e c o m b i n a n tm e i f n - yd e r i v e df r o mt h eb a c u l o v i r u s e x p r e s s i o ns y s t e ma sa n t i g e nw a se m p l o y e dt os c r e e na n t i b o d y - p r o d u c i n gh y b r i d o m a s a f t e r3 c y c l e so fs u b c l o n i n g ，t w e l v eh y b r i d o m a sc e l l sw e r eo b t a i n e d ，w h i c hc o u l dp r o d u c em c a b s s t e a d i l y a l s o ，a l lt w e l v em c a b ss h o w e dp o s i t i v er e a c t i o nt om e i f n 丫i ni n d i r e c tf l u o r e s c e n c e a s s a y ( i f a ) t e s t s a m o n gt h e s et w e l v em c a b s ，f o u rw e r el g g1 ，t w ow e r el g g 2 a , t h r e ew e r e l g g 2 ba n dt h er e s tt h r e ew e r el g mi s o t y p er e s p e c t i v e l y a d d i t i o n a l l y , t h el i g h tc h a i n so fa l lt w e l v e m c a b sw e r ekc h a i n s f u r t h e r m o r e ，s e v e nm c a b ss h o w e dp o s i t i v er e a c t i o nt og s t - m e i f n - y ( 卜8 4 ) p r o t e i n ，a n dt h eo t h e r ss h o w e dp o s i t i v er e a c t i o nt og s t - m e i f n - y ( 8 0 、1 4 6 p r o t e i ni nt h es p e c i f i c e l i s at e s t s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h e s e12m c a b sc o u l d r e c o g n i z e t w oo rm o r e m e i f n - ye p i t o p e s t om e a s u r et h ee i f n - yp r o d u c tf r o me q u i n el y m p h o c y t e s ，aq u a n t i t a t i v ee l i s aw a sd e v e l o p e d i nt h i ss t u d y t h em a ba 5a n db i o t i n y l a t e dm a bs b10w e r eu s e da st h ec a p t u r ea n dd e t e c t i o n a n t i b o d yr e s p e c t i v e l yt oe s t a b l i s ht h es a n d w i c he l i s af o re q u i n el i e n 一丫t h el i m i to fd e t e c t i o n f o rt h es a n d w i c he l i s ao fe q u i n ei f n - yw a s1n g m la n dn oc r o s s r e a c t i v i t yw a so b s e r v e dw i t h r e c o m b i n a n te q u i n ei l - 18 u s i n gt h ee l i s ae s t a b l i s h e di nt h i s s t u d y , e q u i n ei f n - yc a nb e d e t e c t e da n dq u a n t i f i e de a s i l yf r o mc u l t u r em e d i u mo ft h ep b m c sa f t e rb e i n gs t i m u l a t e dw i t h c o n ao rp m a i o n o m y c i n i no r d e rt od e v e l o pt h ei c sa s s a yt od e t e c tt h ei f n - yi ne q u i n ei y m p h o c y t e s ，p u r i f i e dm c a b ( s b lo ) w a sl a b e l e dw i t hf i t c d u r i n gt h ed e v e l o p m e n to fl c s ，c o m p a r a t i v et r a i lw i t ha n t i - b o v i n e i f n ym c a b ( c c 3 0 2 ) w a sc a r r i e ds i d eb ys i d e a l lt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef i t c c o n j u g a t e d m o n o c l o n a la n t i b o d ys bl0c o u l db eu s e dt od e t e c te q u i n ei f n - ye f f e c t i v e l yf o ri c sa s s a y t h ee l i s p o ta s s a yf o re q u i n ei f n - yw a sd e v e l o p e du s i n gt h em a ba 5a sac a p t u r ea n t i b o d y a n db i o t i n y l a t e dm a bs b ioa sad e t e c t i o na n t i b o d y a f t e rt h a t ，t h i se l i s p o ta s s a yw a se m p l o y e d t od e t e c tt h ee i f n - yi np b m cs t i m u l a t e dw i t hp m a l o n o m y c i n t h er e s u l ts h o w e dt h ee l i s p o t a s s a ye s t a b l i s h e di nt h i ss t u d yc a nb eu s e dt om e a s u r et h ee i f n - 1 s u c c e s s f u l l y a l lt h e s em e t h o d sd e v e l o p e di nt h i ss t u d y , s a n d w i c he l i s a ，i c s ，e l l s p o t , c a nn o to n l yb e u s e da s t h ee f f e c t i v et o o l st om o n i t o ri m m u n es t a t u so fe q u i n e s ，b u ta l s of a c i l i t a t et h e u n d e r s t a n d i n go ft h ei m m u n er e s p o n s e st oi n f e c t i o nv e r s u sv a c c i n a t i o no ne q u i n e sa n ds o m e r e l a t e di m m u n em e c h a n i s m s k e yw o r d s ：e q u i n ei f q - ) , ，m c a b ，s a n d w i c he l i s a ，i c s ，e l i s p o t i v 英文缩略表 英文缩写英文全称 i f n 吖 o r f p c r i n t e r f e r o n - g a m m a o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 中文名称 伽玛干扰素 开放阅读框 聚合酶链反应 p b m c s p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s 外周血单核细胞 a p c c t l s h t h a t p b s s d s a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l c y t o t o x i ctl y m p h o c y t e s h y p o x a n t h i n e t h y m i d i n e 抗原提呈细胞 细胞毒性t 淋巴细胞 次黄嘌呤胸腺嘧啶 h y p o x a n t h i n e - a m i n on e o p t e r i n t h y m i d i n e次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e 十二烷基硫酸钠 s d s - p a g e s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 m c a b i p t g f i t c b s a v s v g f p a v a c m i e l l s a i c s m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 i s o p r o p y l - 1 3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d 异丙基- b d 一硫代半乳糖苷酶 f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n v e s i c u l a rs t o m a t i t sv i r u s g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n a n t i v i r a la s s a y c e l lm e d i a t e di m m u n i t y 异硫氰酸荧光素 牛血清白蛋白 水疱性口炎病毒 绿色荧光蛋白 抗病毒活性测定 细胞介导免疫 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验 i n t r a c e i l u l a rc y t o k i n es t a i n i n g e l i s p o t e n z y m e - l i n k e di m m u n o s p o ta s s a y i x 细胞内细胞因子染色 酶联免疫斑点试验 独创性：声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特另j d r i 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：钮导 时间：p 君年 多月 16 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 导师签名： 饲野 夏存著 时间：d 罗年 多月么日 时间：0 。 2 1 4 细胞系与病毒 杆状病毒表达的重组马i f n - 7 ( h y e l f n - 7 ) i 刍本实验室制备保存，马胎肾细胞( e f k 一7 8 ) 1 刍 本研究室保存；v s v * g f p 和m d b k 细胞由哈尔滨兽医研究所步志高研究员提供。 2 1 5 主要仪器 t h e r m op x 2 基因扩增仪，h i t a c h ic f l 6 r x 落地式低温离心机，e p p e n d o r f 迮接仪， 1 7 巾同农、i | ! 科学院博f 学伊论文 钨一：帝 电热恒温培养箱( 上海医用仪表厂w m z k 0 1 ) ，p h 计( b e c k m a n3 2 0p hm e t e r ) ，水平 电泳槽( 北京六一仪器厂) ，b i o r a d 蛋白电泳仪及转印系统，电热恒温水浴锅( d k 8 d 上 海精宏实验设备有限公司) ，j y 9 2 2 d 超声波破碎仪。紫外凝胶成像仪( i m a g em a s t e rv d s ， 瑞典p h a r m a c i a 公司) ；制冰机( s i m f 1 2 4 ，s a n y o ) ；紫外分光光度仪( 3 0 0 0p h a r m a c i ab i o t e c h 公司) ；高压锅( l a b a u t o c l a v es nz y 0 3 0 2 ，s a n y o ) ；旋涡混合器( o l 9 0 1 ，江苏 海门麒麟医用仪器厂) ；直流电泳仪( d y y i i i ，北京六一仪器厂) ；电子天平( a e 2 4 0 ， m e t t l e r ) ；生物安全i i 级操作柜( l a b l o n c op u r i r i e r ) ；空气浴震荡器( h z q c 型， 哈尔滨东联电子有限公司) ；荧光显微镜( 德国l e i c ad m i r e 2 ) 。 2 2 方法 2 2 1 引物的设计与合成 根据g e n b a n k 中已有的基冈序列( 登录号d 2 8 5 2 0 ) ( c u r r a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 以及酶切位点分 析，在开放阅读框( o r f ) 两侧分别设计两对引物： p e i f n - 丫u p ：5 一q q i a t g a a a t a t a c a a g t t t t a a 3 ，含b a m h i 酶切位点； p e i f n 一丫l o w ：5 一鱼鱼工可汀t g ca g gc a gg a tg a cc a - 3 ，含b a m hi 酶切位 点( w ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 m e i f n - 1 u p ： 酶切位点； 5 g g aa t t c c a t a tg t a1 1 ac t gc c a g g c c g cg t t 3 m e i f n - 1 l o w ： 5 - c c gc t cg a gt t a t t gc a a c g ct c tc c gg c 3 切位点，引物均由上海英骏( 1 n v i t r o g e n ) 生物技术有限公司合成。 2 2 2p e i f n 一丫基因的克隆 ，含n d ei ，含x h oi 酶 从健康马颈静脉采血1 0 m l ，用人淋巴细胞分离液无菌分离出外周血单核细胞( p b m c ) ， 然后片j 含1 0 胎牛血清的完全r p m i1 6 4 0 培养基调整细胞密度到1 1 0 6 m l ，在5 c o ，、 3 7 条件下培养2h ：然后用含7 5p g m lc o n a 的完全r p m i1 6 4 0 培养基将细胞密度调整至 5 x 1 0 5 m l ，在5 c 0 2 、3 7 条件下再刺激培养1 2 h 。收集细胞，用t r i z o lr e a g e n t s 提取细 胞总r n a 。采用r t - p c r 从细胞总r n a 中扩增出马干扰素丫基因( 包含信号肽序列，命名 为p e i f n 丫) 。将r t - p c r 纯化产物克隆至p c r 2 1 t o p o ，构建正确的重组质粒由上海英骏 ( 1 n v i t r o g e n ) 生物技术有限公司进行核苷酸序列测定，命名为p c r 2 1 - p e i f n 丫，将序列测定 结果与g e n b a n k 中已登录的e i f n y 基因进行序列比较分析。相关实验具体操作方法按说明 书和参考文献( w ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 进行。 2 2 3m e i f n 吖基因扩增与纯化 以鉴定正确的p c r 2 1 一p e i f n - 1 质粒为模板，用p c r 扩增m e i f n 丫的编码基因( 去除 1 8 中固农业科学院婶f 学位论文第_ 帝 p e i f n - y f l j 信号肽序列) 。p c r 反应条件为：9 5 c 预变性5 m i n ，9 4 c 变性6 0 s ，4 8 退火4 5 s ， 7 2 延伸6 0 s ，3 5 个循环后，7 2 延伸1 0 m i n ：同时设立阴性对照。p c r 产物经l o g l 低溶点 琼脂糖凝胶电泳后，用d n a 胶回收试剂盒纯化回收目的条带。 2 2 4 重组表达质粒的构建和鉴定 将上述回收的p c r 产物和载体p e t 一2 8 “+ ) 分别用限制性内切酶n d ei 和勋di 双酶切后，分 别回收，再用d n al i g a t i o nk i t 将回收的两个片段连接后转化至d h 5 。感受态细胞，构建重组 质粒p e t m e i f n - y 。将构建好的重组质粒转入大肠杆菌b l 2 l ( d e 3 ) 感受态细胞，涂布于含5 0 p g m l 卡那霉素f l 勺l b 平板上，3 7 过夜培养，挑取单个菌落培养丁卡那霉素抗性l b 液体培 养基中，抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳以及p c r 鉴定，阳性重组子命名为p e t - m e i f n y 。初 步鉴定正确的重组质粒由上海英骏( 1 n v i t r o g e n ) 生物技术有限公司进行核苛酸序列测定，并与 g e n b a n k 中已登录的马m e i f n y 基因进行序列比较分析。 2 2 5 目的蛋白的表达 挑取含阳性的重组质粒和空载体质粒的单菌落，接种于3 m ll b 液体培养基，3 7 c 振荡 培养，当o d 6 0 0 。值为0 6 时加入i p t g 至终浓度为0 4 m m o l l 进行诱导表达，同时设立空载体 对照，继续培养1 2 h ，收集各管菌体，超声波破碎后收集其上清，沉淀部分经洗涤后用8 m o l l 脲变- l 生3 0 m i n 后离心取上清，然后分别用于s d s p a g e 分析。 2 2 6s d s p a g e 分析和w e s t e r n b l o t 鉴定 s d s p a g e 和w e s t e r n - b l o t 按照b i o r a d 说明j f 5 进行，采用1 5 0 9 l 的分离胶、5 0 e ：l 的 浓缩胶进行s d s p a g e ，初步分析表达产物，并进一步采用w e s t e r n b l o t 鉴定。转印结束后 将n c 膜用1 b s a 封闭2 h ，然后以抗人1 f n - y 单克隆抗体为一抗，以山羊抗小鼠i g g - h r p 为二抗，3 7 ( 2 条件- 卜j 各反应l h ，最后在底物d a b 中显色。 2 2 7 目的蛋白的纯化 根据产品说明书，变性条件下，取1 m l n i ”n t a 树脂与8 m l8 m o l l 脲溶解的包涵体上清 混合物，将其加入至c h r o m a t o g r a p h yc o l u m n 空纯化柱中，轻柔混匀之后使其自然沉降，弃 去上清，用3 柱体积的结合缓冲液( 8 m o l l 脲：0 5 m o l ln a c ! ；0 0 2 m o l lt r i s h c i ；0 0 0 5 m o l l 咪唑：p h 7 9 ) 预洗一次，再用3 倍柱体积的洗涤缓冲液( 8 m o l l 脲；0 5 m o l ln a c i ；o 0 2 m o l l t r i s h c l ；0 0 2 m o l l 咪i 唑；p h7 9 ) 洗涤2 次，最后_ h 3 倍柱体积的洗脱液( 8 m o l l 脲；l m o l f l 咪唑；0 5 m o l ln a c i ：0 0 2 m o l lt r i s h c hp h 7 9 ) 洗涤2 次，收集洗脱液，将纯化产物进 行s d s p a g e 分析。非变性条件下纯化方法同上，结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱液均不含 8 m o l l 脲。 1 9 2 28 太肠杆菌和杆状病毒表达的重组马 f n y 抗病毒活性的测定 i ! jv s v + g f p 的忙龇n ；。号上# ( m e a g e r2 0 0 4 ) 囊体巧辑扪、：ne f k - 7 8 细胞j 2 5 c m 。幢商积n 细胞就1 叫m 主密腰为1 0 0 ，晴酶，自化n 照是12 0 m 。08 f b sn i ) m e m 端养液( 叫1 ：4 t t t t f j l 传代j ，u 坪7 l2 0 0 p l 钿j 世液加j9 6 扎堆咆靖养收破 3 7 5 c o 二 蚪肖2 4 小时 细胆k 崔悭沁9 0 ，靠土细咆碧养渡、j l 禽8 1 - r s 的d m e m 培养液将 n 拥q i f n y 稀释山i - 1 0 、i 一】0 、1 - 1 0 、1 ：1 0 1 ：1 0 、1 1 0 。加入刮9 6 孔雏f 胞扳中3 7 5 c o 、孵舟2 4 h ，e 时娃仃。l - i 孔fb l a n kc o n t r o lh ( ) 目毒对1 j l ( v i r u sc o n i i o iv c j 卉上细胞* 莽，搜，1 ij 舍2 f b s 的d m e m 靖葬液编秆v s v + g f p ，豫b c 孔“外每_ j l g n 八痫 + 。j 稀秆液1 0 0 p l ( 3 0 0 0 0 p f u ) ：生f _ | 胞j 。3 7 5 c o ，孵育1 6 - 2 4 小叫，竹v c 孔的c p e 约为 1 0 0 时，荧光例置显髓镜r 恍臻g f p 表j l , 判定：以v c 扎为参l 暾，以表】0 绿色荧光减少 为v c 扎5 0 f f j 最高稀释膻为十抗痛由， 肚单缸( a n l i v i r a lu n i ta u ) 。 23 结果 2 31 p e i f n * f 基因的克隆 从c o n a 体外刺激的p b m c 中提取铜肚总r n a ，经r tp c r 十增获符5 0 ib pn u 的 片砼( 如【划1 ) ，。，e i f n - 7 预删j 、小4 _ 符- 也降牟p c r 2 1 _ t o p o 载体后g q l ：例驯记，测j 结 粜我明所也晦的e i f n v 革冈恢甘睦哼“0g e n b a n k 一 ( d 2 8 5 2 0 ) 所* j n n 址冈坎 十眩盯别 臧溉性山1 0 0 ( c u g a nc ia l1 9 9 4 ) 亚虮质粒命名p c re i f n - y 232 目的片段m e i f n - 7 基因扩增产物分析 刚t n e i f ny 引物up c re i f ny 为枧板进行j p c r j ；增，h r ；经i o g , q 琼 | 菖耕自! 腔i l i , k 后，n4 4 i b p 世有一条特肄的d n a 每带r 自蚓! - 2 ) 1 ) m e i f n 一7 两j ! 人小籼符，推断为m e i f n - v 塾同片段。 i 目2 - lp l ：l fh ，y * 【| 勺r j - i ( rn 镕 r i g2 - 1 r i = p c rp m d u c t so fp f i in7g c “ i - 3p e i l l n - y 蚺的r ii c rp # ： 4 “ n 5d n a 廿丁质量 i 椎 f i g2 - 2p crpr o d u e t so f m e i f n - p c n c i 2m l ：l f l - * i p c r ，珊： 2 33 重组质粒的构建与测序鉴定 p c rr 铷经 c n i 和、n ix 2 , 融i | ! _ ：j 1 1j 墨厅砷：w 肝r l jp e i 一2 9 a ( + ) 坡恽j i 埙缃建 c ：f i l 质粒p e t m e i f n “7 f 纠j 1 鲐序列t i | 定“确j i i 俯名乃p e t m e l f n 也 234 表达产物的s d s p a g e 分析和w e s t e r nh l o ! 鉴定 经韭白可溶陀分析结粜表岍：所表哒的h 的坐1 u 训济陀州包涵体似“，口式仟往提取 - - j 济悻和包拍件部分驯ns d s p a g e 分析，址如h2 - 3 所1 与卒批件辞导刘”i 引巴 诱导曲株在1 8 k u 牛右 边出j 一条特芹坐n 条带，_ m e i f n - 7 预l 分子茧人小敢。“抗 凡 f n v 啦执为抗拂根过氧化酶柑、记】| i 扎小敝扎休为抗进仃w e s l e mb l o t 鉴定“ l8 k u 处t 卜一特异反廊带，与s d s - p a g e 结果扣啮合，川纠2 - 4 所示。 k 】l1 2 3 4 56 1 89k u h2 - 3p e t - m e i f n - y 表t - “物r * n 1 1 # 帕s d s e g g e j j 衍 f i g2 - 3t h es d s - p a g e t j s s a 、o f l h eu n p ur f l c da n dp u r i f i e dp e t - m li in 一c x p l c s s o np r o d u c l i o n p e 2 9 a i + i 十a * 请# 前* 2p e t - 2 8 a l + j , “救* 后辛：3p l i i m e i f n - t i 5 i - - 4 北i ：m l i in 州 * * j h * - ) m o m n f m