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广西师范火学硕士研究生学位论文 松香类手性衍生试剂在毛细管电泳手性分离中的应用研究 摘要 手性是自然界中普遍存在的现象，很多具有生物活性的物质( 包括药物) 都 具有手性中心。氨基酸是与肽、蛋白质和酶等生物大分子相关的生物活性物质， 由于对称性及光学活性的不同，氨基酸的d 、l 异构体在生物体内吸收、消化、 新陈代谢和分泌等过程中的作用是不同的。生物体内不同构型的氨基酸在传递神 经信息、调节代谢通路及肽和蛋白质的合成等许多生理过程中起着不同的作用。 在医学和药学领域，在现有的1 8 5 0 种药物( 包括天然药物和合成药物) 中，1 0 4 5 种药物具有手性中心。但是，往往只是其中一种对映体具有药理活性，而另一种 对映体的存在会影响药效，甚至是有害的。因此，对映体的分离和检测，对于生 命科学及其它相关科学领域均具有重要意义。 本文首次将松香类手性衍生试剂应用于毛细管电泳手性分离分析，研究了氨 基酸及多巴、氨己烯酸等氨基药物的衍生、分离条件，建立了氨基化合物对映体 的间接手性分离新体系，并对血浆样品中的氨己烯酸药物进行了分离分析。论文 的主要内容包括三个方面： 1 首次采用松香类手性衍生试剂一脱氢松香基异硫氰酸酯，来衍生氨基酸 及多巴对映体，以毛细管电泳在非手性介质中分离对映体衍生物。氨基酸衍生物 的对映体分离可在p h9 5 的硼砂缓冲液中进行，并加入5m m o l 十二烷基硫酸 钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s ) 和2 0 c h 3 c n 作为添加剂。多巴对映体衍 生物的分离则在d h8 0 ，含有1 7m m o l l s d s 及2 5 c h 3 c n 的磷酸氢二钠缓 冲液中进行。分别考察了添加剂、缓冲液的p h 及浓度、毛细管柱温度、分离电 压等因素对衍生物的分离及迁移时间的影响，确立了最佳分离条件。五种氨基酸 对映体衍生物的分离度在0 9 2 0 范围之间，多巴对映体衍生物的分离度为1 4 。 2 将脱氢松香基异硫氰酸酯用于手性药物氨己烯酸的衍生，并对其衍生产 物的毛细管电泳分离进行了详细的研究。实验发现，氨己烯酸对映体经该试剂衍 生后，也可在非手性介质中得到良好的分离，其最佳分离条件为：5 0m m o ，l n a 2 h p 0 4 缓冲液，p h9 o ，含2 5 c h 3 c n 及1 7m m o l s d s ，分离电压2 0k v ， 广西师范大学硕士研究生学位论文 毛细管柱温度2 0 。将其应用于人血浆中氨己烯酸对映体的分离分析，其分离 度达2 1 ，测定的重现性、精密度令人满意，回收率为9 6 7 1 0 8 。 3 以降解脱氢松香基异硫氰酸酯衍生氨基酸对映体，并在非手性环境中对 衍生物进行毛细管电泳分离。实验发现，氨基酸对映体衍生物可在含有1 8m m o ，l s d s 和2 5 c h 3 c n ，p h 为9 ，0 的n a 2 h p 0 4 缓冲液中得到分离。优化了衍生 条件，研究了缓冲液添加剂、缓冲液的p h 及浓度、毛细管柱温度、分离电压等 因素对分离的影响。在选择的最佳分离条件下，九种氨基酸对映体衍生物在 2 6 m i n 内得到较好的分离，分离度在0 9 5 8 9 之间。此外，还用该试剂衍生氨 己烯酸对映体，并对血浆样品中的加标回收实验进行了研究。 关键词毛细管电泳，手性分离，手性衍生试剂，脱氢松香基异硫氰酸酯，降解 脱氢松香基异硫氰酸酯 广西师范夫学硕士研究生学位论文 s t u d yo nt h ea p p l i c a t i o no fr o s i nc h i r a l d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t si ne n a n t i o s e p e r a t i o n b yc a p i l l a r ye i e c t r o p h o r e s i s a b s t r a c t c h i r a l i t yi su n i v e r s a lp h e n o m e n o ni nn a t u r e m a n ys u b s t a n c e ( i n c l u d i n g d r u g s ) o w nc h i r a lc e n t e r a m i n oa c i d sa r ei m p o r t a n tb i o l o g i c a lc o m p o u n d s t h a t a r ea s s o c i a t e dw i t hp e p t i d e s ，p r o t e i n sa n de n z y m e s t h eda n dle n a n t i o m e r o fa m i n oa c i dp l a y sd i f f e r e n tr o l ei nt h ep r o c e s so fa b s o r b e n c y ，d i g e s t ，m e t a b _ o l i s ma n ds e c r e t i o ni nt h eo r g a n i s mf o rt h e i rd i f f e r e n ts y m m e t r ya n do p t i c sa c t i v i t y a n dt h e i rf u n c t i o n si nt h ec o u r s eo ft h et r a n s f e r r i n go fn e r v ei n f o r m a t i o n ， a d j u s t i n go fm e t a b o l i z ep a t h w a y , a n dt h es y t h e s i so fp e p t i d e sa n dp r o t e i n sa r e v a r y i nt h ef i e l d so fm e d i c i n ea n dp h a r m a c e u t i c s t h e r ea r e18 5 0d r u g s ( i n c l u 。 d i n gn a t u r a la n ds y n t h e t i c a ld r u g s ) i nt h e w o r l da n d10 4 5o ft h e mp o s s e s sc h i 。 r a lc e n t e r t h o u g ht h ep h a r m a c o i o g i c a la c t i v i t yi sr e s t r i c t e dt oo n eo ft h ee n a n t i o m e r sa n du n w a n t e ds i d ee f f e c t so re v e nt o x i ce f f e c tc a no c c u rw i t ht h es e c o - n de n a n t i o m e r t h e r e f o r ec h i r a la n a l y s i so fd ，l e n a n t i o m e r si so fg r e a ti n t e r e s t a n do fi n c r e a s i n gi m p o r t a n c ei n l i f es c i e n c ea n dm a n yo t h e rr e l a t e df i e l d s int h i sp a p er r o s i nc h i r a ld e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t sw e r ef i r s t l ya p p l i e dt ot h e e n a n t i o s e p e r a t i o nb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h ed e r i v a t i z a t i o na n ds e p a r - a t i o nc o n d i t i o n so fa m i n oa c i d s ，d o p aa n dv i g a b a t r i ne n a n t i o m e r sw e r es t u d i e d a n dt h en e wm e t h o d sf o ri n d i r e c tc h i r a is e p a r a t i o no fa m i n oe n a n t i o m e r sb y c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s w e r ee s t a b l i s h e d v i g a b a t r i ne n a n t i o m e r si nt h e h u m a np l a s m aw e r ea l s oa n a l y s e d t h er e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o i l o w s ： 1 t h ea m i n oa c i d sa n dd o p ae n a n t i o m e r sw e r ed e r i v a t i z e db yt h en e w c h i r a l r e a g e n t ，d e h y d r o a b i e i y i i s o t h i o c y a n t e a n dt h ed e r i v a t i v e sw e r e s e p a r a t e di n t h en o n c h i r a le n v i r o n m e n tb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h e d e r i v a t i v e so fa m i n oa c i d sc a nb es e p a r a t e di n5 0m m o i ，lb o r a t e ( p h9 5 ) i i i 广西师范大学硕士研究生学位论文 c o n t a i n i n g5m m o l ls o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) a n d2 0 c h 3 c n t h e s e p a r a t i o no fd o p ad e r i v a t i v e sw a sp e r f o r m e di nab u f f e rs y s t e mc o n t a i n i n g5 0 m m o i ln a 2 h p 0 4 ( p h8 0 ) ，17m m o l ls d sa n d2 5 c h 3 c n t h ee f f e c to ft h e a d d i t i v e s ，p ha n dt h ec o n c e n t r a t i o no fb u f f e r , t h et e m p e r a t u r eo fc a p i l l a r ya n d t h ea p p l i e dv o l t a g eo nt h em i g r a t i o nt i m ea n dr e s o l u t i o nw a sd i s c u s s e d ，a n d t h eo p t i m a l s e p e r a t i o nc o n d i t i o nw a se s t a b l i s h e d t h er e s o l u t i o n so ff i v e d l - a m i n oa c i d sd e r i v a t i v e sw e r ei nt h er a n g eo f0 9 2 0 t h er e s o l u t i o no f d o p ad e r i v a t i v ew a s 1 4 2 t h e d e h y d r o a b i e t y l i s o t h i o c y a n t e w a sa p p l i e dt od e r i v a t i z et h e v i g a b a t r i ne n a n t i o m e r s ，a n dt h es e p a r a t i o no ft h ed e r i v a t i v e sb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sw a sd e t a i l e d l ys t u d i e d i tw a sf o u n dt h a tt h ed e r i v a t i v e s o b t a i n e dw e l ls e p a r a t i o ni nt h en o n c h i r a lm e d i u m a n dt h eo p t i m a ls e p e r a t i o n c o n d i t i o nw a s ：5 0m m o l ln a 2 h p 0 4 ( p h9 0 ) ，c o n t a i n i n g2 5 c h 3 c na n d1 7 m m 0 i ，ls d s t h ea p p l i e dv o l t a g ew a s2 0k v , a n dt h et e m p e r a t u r eo fc a p i l l a r y w a s2 0 。c t h es e p a r a t i o no fv i g a b a t r i ne n a n t i o m e r si nh u m a np l a s m aw a s a n a l y s e da n dt h er e s o l u t i o nw a s2 1 a n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y , p r e c i s i o na n d a c c u r a c y ( 9 6 7 1 0 8 ) w e r eo b t a i n e db yu s i n gt h i sm e t h o d 3 a m i n oa c i d se n a n t i o m e r sw e r er e a c t e dw i t ha n o t h e rr o s i nc h i r a i d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t ，d e g r a d i n g d e h y d r o a b i e t y l i s o t h i o c y a n t e t h ed e r i v a t i v e s w e r es e p a r a t i o ni nn o n c h i r a le n v i r o n m e n tb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h ec e r u n n i n gb u f f e rc o n s i s t e do f 5 0m m o l ln a 2 h p 0 4 ( p h9 o ) 18m m o l ls d s a n d2 5 c h 3 c n t h ed e r i v a t a z a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h ee f f e c to f t h ea d d i t i v e p ha n dt h ec o n c e n t r a t i o no fb u f f e r , t h et e m p e r a t u r eo fc a p i l l a r y a n dt h ea p p l i e dv o l t a g eo ns e p e r a t i o nw a ss t u d i e d i nt h es e l e c t e ds e p e r a t i o n c o n d i t i o n ，n i g h ta m i n oa c i de n a n t i o m e r sd e r i v a t i v e sw e r es e p e r a t e dw i t h i n2 6 m i n u t e s a n dt h er e s o l u t i o nw e r ei nt h er a n g eo f0 9 5 8 9 t h em e t h o dh a s a l s ob e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fv i g a b a t r i ne n a n t i o m e r si np l a s m a k e y w o r d sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e n a n t i o s e p a r a t i o n ，c h i r a ld e r i v a t i z a t i o n r e a g e n t ，d e h y d r o a b i e t y l i s o t h i o c y a n t e d e g r a d i n g d e h y d r o a b i e t y l i s o t h i o c y a n t e i v 广西师范人学硕上研究生学位论文 第一章综述 1 引言 手性是自然界中普遍存在的现象，很多具有生物活性的物质( 包括药物) 都 具有手性中心。不同立体构型的生物活性物质，其生物活性及生理活性是不同的。 氨基酸是与肽、蛋白质和酶等生物大分子相关的生物活性物质，由于对称性及光 学活性的不同，氨基酸的d 、l 异构体在生物体内吸收、消化、新陈代谢及分泌 等过程中的作用也是不同的，而且生物体内不同立体构型的氨基酸在传递神经信 息、调节代谢通路及肽和蛋白质的合成等许多生理过程中起着不同的作用 【1 - - 8 。氨基酸的不同立体构型也与一些疾病相关【9 ，1 0 】。在医学和药学领域， 在现有的1 8 5 0 种药物( 包括天然药物和合成药物) 中，1 0 4 5 种药物具有手性 中心 1 1 ，1 2 】。但是，具有药理活性的药物往往只是其中一种对映体，另一种 对映体的存在会影响药效，甚至是有害的。因而，手性药物的对映体分离就显得 非常必要。1 9 9 2 年，美国食品药品管理局( f d a ) 颁布了丌发新立体异构体药 物的法规，提出制药公司必须测定每个药物的立体异构体的组成，并对每个异构 体的药理学活性进行比较【1 3 】。欧洲和日本的药品管理部门也采取了类似的措 施【1 4 】。对映体的分离和测定，对于生物体的生理过程及生命的起源、发育、 病变、衰老过程等生命科学领域的研究，以及药物化学、生物医学等其它相关领 域均具有重要意义。 手性分离的传统方法是气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 和高效液 相色谱法( h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 【1 5 2 0 。而高效 毛细管电泳( h i g h - p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 是二十世纪 8 0 年代兴起的分离方法，是以电场为驱动力，使离子或荷电粒子在毛细管中按 其淌度或分配系数的不同而进行高效、快速分离的一种电泳新技术。由于毛细管 具有良好的散热性能，允许在毛细管两端加上高至3 0k v 的高电压，因而分离操 作可以在很短的时间内( 大多数分离在3 0m i n 内完成，最快可在数秒内结束) 完成，达到非常高的分离效果( 理论塔板数可达到4 0 00 0 0 ，m ) 。毛细管的内 径( i n s i d ed i a m e t e r ，i d ) 很小( 一般小于1 0 0 m ) ，以内径为5 0 , u m ，长度 为5 0c m 的毛细管为例，其容积小于1 l ，进样体积为纳升( n l ) 级，样品浓 广西师范大学硕士研究生学位论文 度一般低于1 0m o l l 。因此，h p c e 具备了仪器分析技术所需的高效、快速和 样品用量少等基本特点，同时还具有易实现自动化，操作简便，溶剂消耗少，环 境污染小等优点。h p c e 技术拥有的这些的优点，使其受到极大关注，成为生物 化学和分析化学中最受瞩目，发展最快的一种分离分析新技术【2 1 。 2 毛细管电泳分离模式 2 1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是最简单的电泳模 式，其分离机理为：毛细管中充入电解质溶液( 缓冲液) ，样品从毛细管的一端 导入。当毛细管两端加上电压后，带电的溶质朝与其电荷极性相反的方向移动， 不同样品由于其淌度不同，其电泳速度也不同，从而得到分离。 2 2 毛细管凝胶电泳 1 9 8 3 年，h j e r t e n 2 2 】将聚丙稀酰胺凝胶填充到毛细管中，用于c e 分离， 发展了毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 。c o h e n 等【2 3 】 用c g e 分离了蛋白质碎片。毛细管凝胶电泳分离和激光诱导荧光( 1 a s e ri n d u c e d f l u o r e s c e n c e ，l i f ) 检测相结合，成为d n a 快速序列分析的有力工具【2 4 。 c g e 还将在人类基因工程的庞大计划中发挥巨大作用【2 5 。 2 3 胶束电动色谱 1 9 8 4 年t e r a b e 等【2 6 】建立了胶束电动色谱( m i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i cc h r o - m a t o g b p h y ，m e k c ) 的分离模式，其分离机理为：以表面活性剂形成胶束作 为准固定相，根据溶质分子在胶束准固定相和水溶液之间的分配差异达到分离目 的。 2 4 毛细管等电聚焦 对于两性电介质( 如蛋白质) ，当其所处的介质具有p h 梯度时，具有不同 等电点的分予分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦 ( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) 过程 2 7 。1 9 8 5 年，h j e r t e n 2 8 】将等电聚焦电 泳方法引进c e 分离，使毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c l e f ) 技术在蛋白质分离中成为一个强有力的微柱分离分析工具。 广西师范大学硕士研究生学位论文 2 5 毛细管等速电泳 毛细管等速电泳是一种“移动边界”技术，它采用两种不同的缓冲液系统， 一种是前导电介质，充满整个毛细管柱，另一种是尾随电介质，置于毛细管一端 的电解槽中，前者的淌度高于任何样品组分，而后者则低于任何样品组分，被分 离的组分按其淌度的不同，被夹在中问，以同一速度移动，实现分离【2 9 1 。h j e r l e n 等【3 0 】以等速电泳模式成功分离了几种染料，从而使毛细管等速电泳( c a p i l l a r y i s o t a c h o p h o r e s i s ，c l t p ) 在分析和微制备中得到广泛的应用。 3 毛细管电泳手性分离方法 毛细管电泳手性分离有直接分离和间接分离两种方法。 3 1 直接分离 直接分离方法是将手性选择剂加入背景电解质中，使对映体与手性选择剂在 毛细管内的动态平衡过程中形成包合络合物，导致其稳定常数不同，使两个对映 体的有效淌度不同，从而达到分离目的。迄今为止，很多手性选择剂已被用于对 映体的分离，如手性配体交换络合剂【3 1 - - 3 9 ，环糊精及其衍生物 4 0 一8 8 】， 手性冠醚f 8 9 - - 9 8 ，手性表面活性剂 9 9 1 1 2 ，手性聚合物 1 1 3 - - 1 2 0 ，大 环抗生素【1 2 1 1 3 2 。一些天然蛋白质【1 3 3 - - 1 3 8 ，麦角生物碱【1 3 9 等均被 用作手性选择剂。 3 。2 间接分离 间接分离是背景电解质中不存在手性选择剂的手性分析方法。这种方法是在 分析前用手性衍生试剂与对映体反应，生成非对映异构体。在非手性分离系统中， 电泳性能或疏水性能不同的非对映体通过与准固定相( 如胶束假相) 的相互作用 而得到分离。这种方法特别适合于氨基酸对映体，因为它有一个氨基连接在不对 称碳上，可以容易地被合适的手性衍生试剂衍生。此外，通过衍生还能使那些不 能检测的非芳香氨基酸转化为可被紫外或荧光检测的化合物。由于问接方法可以 提高选择性和灵敏度，因而它受到了人们的广泛关注。 迄今为止，已有十多种手性衍生试剂用于氨基酸和肽的c e 分离。这些手性 衍生试剂的结构及其衍生氨基化合物( 包括氨基酸) 时的反应条件见表1 【1 4 8 。 用手性衍生试剂形成氨基酸非对映体的过程如下： 广西师范大学硕士研究生学位论文 n h 2o ( d ，l ) r - - e h 弋+ ( + ) 一c r 一 + 、o h ( d ，l - 氨基酸) ( 手性衍生试剂) n h c r ；0 n h c r o ( ( + ) 一d ) r - - e h 弋 + ( ( + ) - l ) r , i 一e h 弋 ， + b h + 0 h ( 非对映异构体) 3 2 1 胶束准固定相中的间接手性分离 非对映体可在水相和胶束相中分配，因而在m e k c 中使用十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 胶束可分离大部分氨基酸和肽的衍生物。t r a n 【1 4 1 】以m a r f e y 试剂为 手性衍生试剂，在含有2 0 0m m o l ls d s 的硼砂缓冲介质中对7 种氨基酸和2 种肽进行非对映体的c e 分离。n i s h i 【1 4 2 】用g i t c 衍生并分离了1 7 种d l 氨 基酸，这一试剂在反相高效液相色谱( r p h p l c ) 手性分离氨基酸和肽中也有 广泛的应用。k i n g 和b u c k 【1 4 3 】用o p a 以及b o c c 衍生1 7 种氨基酸对映体并 进行检测，拆分了其中1 3 种，在缓冲液中添加1 5 0m m o l ls d s ，可同时分离 6 种氨基酸对映体的混合物。h o u b e n 【1 4 4 】用o p a 和n 乙酰半胱氨酸衍生缬 氨酸，检测l 缬氨酸中的d 一缬氨酸杂质。t i v e s t e n 和f o l e s t a d 1 4 5 】用o p a 和 一种类似于g i t c 的手性试剂w 盯g ，在5 分钟内快速分离了1 7 种氨基酸，只 有少数衍生物的峰重叠在一起。以1 5m m o i 儿s d s 和4 乙腈( a c n ) 为添加 剂，在p h9 5 5 条件下大部分t a t g 一氨基酸都达到了高分离度( 平均分离度为 1 4 3 ) 。此外，t i v e s t e n 【1 4 6 ，1 4 7 】用o p a 门丁g 对d 和l ，氨基酸进行在柱 衍生，氨基酸在数秒钟内通过区带混合而衍生，随后在m e k c 中分离。这一方 法在微量化学分析中非常有用，可以标记纳升( n l ，1 0 - 9 l ) 到皮升( p l ，1 0 一 ”l ) 样品，因而相对于柱前衍生来说样品浓度可以稀释到最小【1 4 6 ，1 4 7 】。w a n 和b l o m b e r g 【1 4 8 】认为这一方法可用于复杂基体中, u m ( 1 0 “m o l l ) 浓度以下 的氨基酸的衍生。这是因为它有两个优点。首先，相对于基体中的其它介质，由 于氨基酸的淌度不同，因而基体效应可以减少。其次，静电堆积可以使氨基酸富 集。这使得可以用商品化的仪器对痕量氨基酸进行全自动分析。但是在这些试剂 4 广西师范大学硕十研究生学位论文 o 或l 一1 一氟 2 4 - 2 - 硝基苯基 - 5 - l 丙氨酰胺 ( m a r f e y s 试剂) 2 3 ，4 ，6 一四一o 一 乙酰基坷- d 一吡 喃葡萄糖基 异硫氰酸酯 ( g i t c ) 邻苯二甲醛及 n - 正丁基羰基 l - 半胱氨酸 ( o 刚b 0 c c ) 邻苯二甲醛及 2 ，3 ，4 ，6 - 四- 0 一 乙酰基1 硫代 3 5 0 4 1 5 乖- d 一葡萄糖 ( o p a ，w 汀g ) ( + ) 或( ) 1 - ( 9 一 芴基) _ 乙基氯 甲酸酯 ( f l e c ) ( + ) 或( - ) _ 1 ( 9 - 葸基) 2 丙基 氯甲酸酯 ( a p o c ) h 3 h c 舢o c o o 。鼢n 一。一。 o c o c h ， o n 洲。少。 从c h o h c o c ( c h 3 ) 3 , c h 3 v c 帅少甲0 丫洲3 以o 。i z 。p ， s h0 3 56 c 9 0 m i n3 4 0 【1 4 1 】 6 0 ，15 m i n r t 1 5 m i n2 1 0 【1 4 2 】 r t ，1 0 m i n2 3 0 ，3 4 0 【1 4 3 】 r t ，6 m i n3 4 0 【1 4 5 】 3 5 0 4 1 5 r t ，5 m i n2 6 5 3 1 0 r t ，5 m i n2 4 4 3 3 0 r t 10 m j n 1 4 8 】 1 4 】 1 5 1 】 1 6 0 】 【1 6 1 】 2 5 6 【1 5 2 】 3 5 1 4 1 2 5 广西师范_ 人学硕士研究生学位论文 r - ( 一) 或s 一( + 卜4 - ( 3 - 异硫氰酸酯 基- 1 吡啶) - 7 一 硝基- 2 1 ，3 一苯 并恶二唑 ( n b d - p y n c s ) ( + ) _ 联乙醯 l - 酒石酸酐 ( d a t ) ( + ) _ 联苯甲酰- l 酒石酸酐 ( d b t ) ( 1 r 2 r ) 或( 1 s 2 r ) - n - 【( 2 - 异硫 腈酸酯基) 环己 基卜6 - 甲氧基- 4 喹啉酰胺 ( c d i t c ) ( s ) 一1 一( 1 一萘基) - 乙基异硫氰酸 酯 ( s n e i t ) ( s ) 一( + ) 一甲基 苯基异硫氰酸 酯 ( s a m b i ) n c s d a t ：r ；c o c h 3 6 0 。c l l o m i n4 8 8 5 2 0 【1 5 3 】 5 0 。c 2 0 h 2 3 3 【15 4 】 d b t ：r = c o p h5 0 2 0 h2 3 3 , c h 3 飞r 人n c s 蟛 , c h 3 矿、，咿n c s 比 【1 5 5 】 【1 5 6 】 【1 5 7 】 6 0 。c 12 0 m i n2 5 4 【15 8 】 3 3 3 4 3 0 6 0 ：3 0 m i n 2 10 【15 9 】 6 0 c 3 0 m i n2 5 4 【15 9 】 r t ：室温 6 广西师范大学硕士研究生学位论文 中，只有很少的试剂，如o p a 和n d a ，能与氨基酸快速反应，获得定量产率， 因而这一技术的应用受到了限制。 w a n 等【1 4 9 ，15 0 】以f l e c 为手性衍生试剂，衍生d l 氨基酸和二、三肽， 用低浓度的s d s 在p h9 2 条件下进行m e k c 分离。c h a n 【1 5 1 报道了1 0 种 f l e c 氨基酸的非对映体分离。t h o r s 6 n 【1 5 2 用一种新的手性荧光试剂a p o c 衍生并分离了1 7 种氨基酸和4 种二肽。这种试剂的化学结构与f l e c 相似，因 而与f l e c 非对映体类似的分离条件也可用于m e k c 中的a p o c 非对映体分离。 a p o c 的另外一个优点是它有很高的u v 摩尔吸光系数，而且观察到的a p o c 衍生物的u v 吸收比f l e c 衍生物高1 0 倍【1 5 2 。l i u 等【1 5 3 】用非离子表面活 性剂在低p h 条件下用n b d - p y n c s 衍生并分离了6 种氨基酸和1 种二肽。这 种苯并呋喃类荧光衍生试剂有很好的光谱性能，用氩离子激光在4 8 8n m 激发可 得到5 0n m o l l 的检测限。但这种试剂的光学纯度( 9 9 5 ) 不足以用于痕量对 映体杂质的检测【1 6 2 。此外，反应需加热，这可能会引起外消旋化。 3 2 2 聚合物作为准固定相的间接手性分离 s c h o t z n e r 等【15 4 】用d a t 衍生色氨酸对映体。他们将聚乙烯吡咯烷酮加 入背景电解质中作为准固定相，衍生物通过与准固定相之间的疏水和偶极相互作 用而分离。他们还用d b t 衍生氨基酸【1 5 5 - - 1 5 7 ，发现选择性有所提高。他们 还研究了三种线型高聚物，聚乙烯吡咯烷( p v p ) ，聚乙烯乙二醇( p e g ) 和聚 丙稀酰胺( p a a ) 对非对映体分离的影响，发现p v p 的选择性最佳。他们认为 这是因为p v p 和d b t 衍生物之间的和丌相互作用增强所致。k l e i d e r n i g g 和 l i n d n e r 【1 5 8 】用另外一种荧光衍生试剂c d i t c 衍生并分离了1 9 种氨基酸对映 体。分离在低p h ( 3 o ) 条件下进行，将p v p 与有机改性剂结合，分离酪氨酸 时分离度可达1 6 。用非离子聚合物代替s d s 作为准固定相的优点之一便是分离 过程中产生的焦耳热较少，但对比常规m e k c ，分离窗口相对较窄。聚合物相 为氨基酸和肽的非对映体分离提供了新的方法。其它类型的手性衍生试剂如 f l e c ，a p o c 等，其氨基酸和肽的衍生物也可以在聚合物修饰的准固定相中进 行对映体的间接分离。 3 2 3 疏水相互作用的选择性 表2 1 4 8 】列出了一些手性衍生试剂衍生氨基酸或肽后衍生物的分离条件 广西师范大学硕士研究生学位论文 a a s ：氨基酸( a m i n oa c i d s ) d p = 二肽( d i p e p t i d e ) t p ：三肽( t r i p e p t i d e ) 8 广西师范大学硕士研究生学位论文 及分离结果。从中可以看出大多数分离是在m e k c 中进行的。但也有不用准固 定相分离的，如t r a n 等【1 4 1 】不用任何准固定相，以m ar f e y 试剂衍生氨基酸 并在c z e 中进行非对映体分离。但m e k c 的分离选择性明显比c z e 要好。这 是因为与胶束的疏水作用提供了额外的选择性。b o n f i c h i 等【15 9 】以s n e i 及 s a m b i 为手性衍生试剂，不用胶束，对氨基酸进行非对映体分离。由于这些衍 生物在水缓冲液中的溶解度很小，因而在缓冲液中加入环糊精来提高溶解度，达 到分离目的。用这一技术分离了3 种氨基酸对映体。 w a n 等用化学计量学实验设计及最优化方法获得了不同的f l e c 一氨基酸和 f l e c 肽的最佳分离条件【1 4 9 ，1 5 0 】。他们发现，分离取决于分析物的疏水性 和s d s 的浓度【1 4 9 】。 另一方面，不同类型的手性衍生试剂，从其结构可以看出其不同的疏水性。 由于相对较高的极性或低的疏水性，m a r f e y 试剂或g i t c 的非对映体分离需要 较高的s d s 浓度【1 4 1 ，1 4 2 。而f l e c 和a p o c 则相反f 1 4 9 - - 1 5 2 。s o s 的 浓度增大，会增加缓冲液的导电性，从而增加焦耳热，降低分离效率。因此，一 般来说s o s 的浓度要尽可能低。 除了疏水作用外，在分析物如天冬氨酸和谷氨酸的分离中，静电作用对分离 也有很大影响。这两种氨基酸用阴离子胶束如s d s 很难分离。这是因为在高p h 条件下这两种氨基酸产生双负电，从而产生强烈的静电斥力。使用低p h 可减少 这种效应，这两种氨基酸就可以分离【1 4 1 ，1 5 1 。用n b d p y n c s 衍生后，用 非离子表面活性剂分离天冬氨酸和谷氨酸对映体的衍生物，可得到高分离度 【1 5 3 。 3 2 4 间接分离方法的优点及局限性 表2 1 4 8 对比了不同的手性衍生试剂如m a r f e y 试剂，g i t c ，o p a t a t g ， o p a ，f l e c 等的综合性能，其中f l e c 试剂有几个优点。首先，衍生反应快速 简单，衍生物稳定。【1 4 9 。第二，f l e c 衍生物具有相对较高的疏水性，因而在 m e k c 分离中所需的s o s 浓度( 1 0 一2 0m m o l l ) 较低 1 4 8 ，1 4 9 】。低的s d s 浓度可减少导电性及s o s 在毛细管壁的吸附，获得高的分离效率。第三，商品 化的( + ) 和( 一) f l e c 都具有很高的光学纯度( 9 9 9 ) 1 6 1 ，而且具有 很好u v 吸收，还可进行高选择性荧光检测。最近的一项研究确信f l e c 的光学 9 广西师范大学硕士研究生学位论文 纯度可超过9 9 9 9 【1 6 0 。f l e c 的一个缺点可能是缓冲液添加剂有高的背景 荧光发射及样品基体中有污染物【1 5 2 ，1 5 3 。这是因为它的激发波长( 2 6 5n m ) 与u v 最大吸收波长( 2 5 6n m ) 接近。c h a n 等【1 5 1 】用激发波长为2 4 8n m 的 脉冲氪氟激光检测，得到了5 0n m o l l 的检测限。w a n 等 1 6 0 】用倍频氩离子 激光( 2 4 4n m ) 成功检测到了有n 一2 - 羟乙基哌嗪一n 一2 一乙磺酸( h e p e s ) ，s d s ， 卜环糊精( f - c d ) 和异丙醇( i p a ) 存在的背景电解质中的4 0n m o l l 的f l e c 一 甘氨酸。 a p o c 的性质与f l e c 十分相似，但u v 吸收比f l e c 高。a p o c 的光学 纯度只有9 9 9 1 【1 5 3 ，不足以对含量低于o 1 的痕量对映体杂质进行检测。 以o p a t a t g 作为手性衍生试剂进行非对映体分离时，分离速度快，分离 度高，反应条件简单，很有发展前景【1 4 5 】。但o p a 的反应必须考虑到反应动 力学1 6 3 。尚不清楚是否所有的手性衍生试剂在与两种对映体反应时生成的非 对映体的产率均相同。可以预测，物理性质和化学性质相同的d 型和l 型对映 体( 只是旋光性不同) ，具有相同的反应动力学、u v 吸收和荧光产率【1 4 8 。但 m e y e r 等【1 6 3 】用o p a 研究氨基酸非对映体的反应动力学，发现l - 异亮氨酸的 反应比它的d 型异构体快，而l 苏氨酸的反应比d 型异构体稍慢。虽然这些氨 基酸的反应速率不同，但其u v 吸收特征相同。在衍生过程中这一效应也存在于 直接分离方法中。关于这一问题有待进一步研究。 非对映体分离的优点在于可以简单快速地优化分离条件。而在直接手性分离 中由于和手性选择试剂络合，反应动力相对较慢。间接分离的另一个优点是非对 映体的迁移顺序，当采用( + ) 或( 一) 手性试剂( 如果有的话) 时，很容易地 反转。顺序的反转为对映体过量的定量分析提供了明确的方法。 成功应用间接方法的先决条件是必须确定或已知所用的手性衍生试剂的光 学纯度，特别是对于痕量对映体杂质的检测。此外，间接方法的一个固有的缺陷 是如果在非手性系统中进行分离，手性衍生试剂的手性中心和分析物的手性中心 必须接近【1 6 4 ，1 6 5 。因此用间接方法不能分离以甘氨酸开头的肽【1 4 8 。 广西师范_ 人学硕士研究生学位论文 4 本文主要研究工作 本文利用我院王恒山教授课题组新近合成的两种松香类手性衍生试剂来衍 生氨基酸对映体及含氨基的药物对映体，在非手性环境中对衍生物进行毛细管电 泳分离研究。 两种手性衍生试剂的结构如下： 脱氢松香基异硫氰酸酯 ( d h a n c s ) 降解脱氢松香基异硫氰酸酯 ( d d h a n