（预防兽医学专业论文）金黄色葡萄球菌β溶血素基因的克隆与表达.pdf

中文摘要 金黄色葡萄球菌b 溶血素是金黄色葡萄球菌分泌的外毒索之一。是重要的毒力因子，它可 引起多种疾病，奶牛乳房炎的主要致病因子之一就是金黄色葡萄球菌分泌的b 溶血素。奶牛乳 房炎是一种多因素疾病，给世界各国奶牛业造成巨大的经济损失。患牛牛奶中体细胞数大幅增加， 会降低乳蛋 a b s t r a c t b e t a - h e m o i y s i nw a so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te x t r a c e l l u l a rt o x i n sp r o d u c e db yv i r u i e n ts t r a i n s o f 研q p 妙幻c c 淞d “阳琊( s 口“理时) ，w h i c hw a sa ni m p o n a n tv i r u l e n c ef 犯t o ra n da s s o c i a t e dw j t ht h e e t i 0 1 0 9 i c a lo fav a r j e t yo fj n f e c t i o u sd i s e a s e sj na n i m a i s ，i n c l u d i n gm a s t j t i sm a s t i t i sw a sak j n do f m u 】t i p l ef 如t o rd i s e a s e ，w h i c hr e s u l t e di ne n o m o u se c o n o m i cl o s si nw o da r i dp l a y e da ni m p o n 锄t r o 】ei nt h em i l kq u a l i t y t h es o m a t i cn u m b c ro ft h em i i ko ft h em a s t i t i sc a 砌ew a si n c r e a s e d ，w h i c h c o u l dd e c r e a s et h ec o n t e n t i o no fm j l kp r o t e i n ，1 a c t o s ea n dm i l kf a t 吼i fa n t i b i o t i c sw e r eu s e dt ot r e a t t h ei n f e c t e dc a n l e ，w h i c hm i g h t1 e a dt om u c h e m a j nd o u b l ep 0 1 l u t i o no f t h es o m a t i ca n da n t i b i o t i c j nf r e s hm i l k ，m i g h tb r i n gd 枷a g et ot h em i l kp r o d u c ti nt h ea s p e c to fq u a l 时锄dn a v o lm a s t i t i sw a s ap m a r yo b s t a c l et om ed e v e l o p m e n to fa 1 1 i m a jh u s b a l l d r yo fc h i n a ，f o ra n 廿b i o t i ct r ea t l n e n t s a f f b c t e dt h em i l kq u a l j t ys e r i o u s l y t h u sv a c c i n a t i o nm i g h tb eaw a yt op r e v e n tt 1 ed i s e a s e a sar e s u l t ， t od e v e l o p 廿1 ee n g i n e e r i n gv a c c i n em i g h tb eaw a yt os o l v e 也ep r o b l e m as 仃a i no f 最4 “旭淞s l ou s e di 1 1t h i sr e s e a r c hw a sg a i n e d 行o m 廿1 em a s t i t i sm i l ks 锄p l e s t h e g e n ee n c o d i n gb e t a h e m o l y s i no f 脚砂，d c d c c 埘口舯埘w a s 啪p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( p c r ) 锄dw a sl i n k e dt ot 1 1 ep h 缸) - 1 8 一tt oc o n s u c tt b eb - h e m o l y s i nc i o n ep l a s m i d t h e c o m p l e t ed n as e q u e n c eo ft h ec l o n e d8 - h e m o l y s i ng e n e 疗d m 矽砂k d c c 蚶日“旭淞w a s s e q u e n c 酣a i 】dc o n f i 姗e db yd n as e q u e n c ea 1 1 a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e d 廿1 a tt l ed n as e q u e n c e h o m 0 1 0 9 yw a sm o r et 1 1 a n9 9 2 a f t e rc o m p a r i n gw 油s e q u e n c ep u b l i s h e di ng e n b a n k ，锄dt 1 1 e h o m o l o g yo f t h ee n c o d i n gp r o t e i nw a s1 0 0 ，a 1 1t l l i sa s s u r e dt h a tt h es e q u e n c eo f t l l e 且- h e m o l y s i n o f 飘础y f o c o c c 淞口“雕淞h a dh i 曲c o n s e r v 撕o n 锄dh o m o l o g 弘 t h e nt i er e c o m b i n a t i o nw a sd o u b l ee n 巧m ei n c i t e da 1 1 di n s e r t e di m op e t - 3 2 - ae x p r e s s i o nv e c t o r t h ee x p r e s s i o no f r e c o m b i n a r i t b e t a - h e m o l y s i np r o t e i nw a sd e t c c t e db ys d s 母a g ea i l dw e s t e mb l o t t h er e s u l t ss h o w e d 出a tt h em o l e c u i a rw e i g h to ff u s i o np r o t e i no fb e t a 小e m 0 1 y s i nw a sa b o u t5 7l ( d a ， 锄de x p r e s s i o nl e v e lw 鹊3 0 t h ee x p r e s s i o no fr e c o m b i n a l l tp r o t e i nw a sp u r i n e d ，t h e n 也ep r o d u c t w a su s e di n 血et r e a d m j l lt e s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a tt 1 1 ee x p r e s s i o np m t e i na l s oc o u 】dm a k et h e s h e e pe r y t h r o c ”o p o i e s i sh e m o l y z e ，t 1 1 a tw 鹤t os a yt h eb e t a - h e m o l y s i ne x p r e s sp r o t e i ns t i l lh a dt l e b i o l o g i ca c t i v i 砂 t h es u c c e s s f u le x p r e s s j o no fr e c o m b i n a n tb e t a - h e m o l y s i nw o u l dp r o v i d eaw e l lb a s ef o rt h e f u n h e rr e s e a r c ho f t h ee n 百n e e n gv a c c i n e 1 畸w o r d s ：郇哟，如c c 淞口“陀琊；b e t a - h e m o l y s i n ： c l o n e ； e x p r e s s j o ” i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢专砖苛 日搁：砌占年占月形臼 关于论文使用授权的说明 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 葡萄球菌( 印 y f 。c o c c ) 是革兰氏阳性球菌中的一种，致病性葡萄球菌常引起各种化脓 性疾患、败血症或脓毒败血症。目前关注最多的是有关预言人类已经进入了细菌学阴暗的时代， 即人们在对待细菌感染时，再也无法应用有效的抗生素，随着耐药菌株的大量出现则为该预言 成为可能提供了有利的证据。在抗生素战役上我们失败的一个最好的例子就是金黄色葡萄球菌 ( a 肋y f d c c m 口“m m ) i ”，其致病力最强，也最重要，该菌在自然界中无处不在，空气、水、 灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，也存在于人、动物的体表、鼻咽部及肠道。金黄色葡萄 球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、 心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄 球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生 的毒素和侵袭性酶。 b 一溶血素( b - h e m o l y s i n ) 是金黄色葡萄球菌的主要致病因子之一，是一种不耐热的蛋白 质。p 溶血素对多种哺乳动物红细胞都有溶血作用，其主要原理是毒素分子插入红细胞的细胞 膜疏水区，形成微孔，破坏了膜的完整性，而造成细胞溶解，因此它也属于穿孔毒素。9 溶血 素还可以导致白细胞的崩解、作用于平滑肌细胞，引起平滑肌收缩、麻痹，最终坏死。同时， 金黄色葡萄球菌是导致发生奶牛乳房炎的一个非常重要的因素【2 l 。 乳制品是我们生活中不可缺少的主要副食品，牛奶又是人们获得动物蛋白的主要来源之 一，是人体中不可缺少的营养成分。牛奶质量在很大程度上影响到我国人民的生活水平和健康 水平，然而奶牛乳房炎严重阻碍了我国畜牧业的发展，患牛牛奶中体细胞数大幅增加，会降低 x 黑龙江八一农垦人学硕士学位论文第一章文献综述 表达，为进一步研制奶牛乳房炎基因工程亚单位疫苗奠定物质基础，防制奶牛乳房炎，提高我 国乳制品的安全性，促进人们的健康。 1 2 金黄色葡萄球菌b 一溶血素研究进展 1 2 1 发现 人们对金黄色葡萄球菌产生的溶血素的认识经历了一定的时间。1 8 7 2 年k 1 a b e s 提出细菌的致 病性与其所产生的毒素之间存在一定关系的假设，6 年后d ec h n s t m a s 的试验研究证实金黄色葡萄 球菌的毒力可以在热的肉汤培养基中得以恢复，v e l d e 在1 8 9 4 年、k r a u s 和c l a i m o n t 在1 9 0 0 年发 现了金黄色葡萄球菌毒素对兔红细胞具有溶血的能力，以后很多的细菌学家不断探索金黄色葡萄 球菌产生的多种溶血素的作用，尤其是发病机理与致病性之间的关系。1 9 2 8 年发生的一场悲剧将 大家的注意力转移到了金黄色葡萄球菌所产生的溶血素上。当时在澳大利亚的b u n d a b e r g 有2 1 名 儿童接种了抗白喉疫苗，但在4 8 h 内，却有1 2 名儿童突然死去。究竟是什么原因导致了儿童的死 亡? 后来经过调查发现，由于该疫苗没有低温冷冻保存，而是在室温中放置很久，有关专家从中 分离到一株金黄色葡萄球菌，具有溶血性，并且对兔子具有致病性，根据患病儿童后期的临床症 状可以推测是溶血素的可能。这场悲剧的发生引起了人们对金黄色葡萄球菌毒力和侵袭力的研 究，但直到现在，这些外毒素的特性和作用方式才为人所知啪。 多数致病性葡萄球菌均能产生溶血素。根据抗原性不同，至少有a 、b 、6 、五种，能损 伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血或坏死。 b 溶血素( b e t a t o ) 【i no rb 咖- h e m 0 1 y s i n ， z 6 ) 是金黄色葡萄球菌分泌的几种外蛋白中的一 种，它是一种神经磷脂酶，能够溶解红细胞和其它哺乳动物的细胞，目前b - 溶血素在对 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 金黄色葡萄球菌b 溶血素由大量的致病性金黄色葡萄球菌菌株产生，尤其是动物分离株。 通过使用酵母渗透培养基可以产生大量的金黄色葡萄球菌b 溶血索，也可以使用牛心脏渗透培 养基。与金黄色葡萄球菌其他的外毒素一样，金黄色葡萄球菌b 溶血素也是在对数生长期以后 进行调节的。国外有很多资料进行了报道，使用含有o 0 0 】mm s 0 4 ( p h7 o ) 的缓冲液作为稀释 液，用试管在3 7 培养金黄色葡萄球菌8 0m i n ，然后再冷却3 0m i n 可以观察到毒素的活性增 高m 】。使用心脏浸液半固体培养基，或者心脏浸液包含0 3 琼脂的渗透液都适于生产大量的b 溶血素。2 4h 后在半固体培养基和肉汤培养基中毒素的含量可以得到最大值，如果继续培养的 话，肉汤培养基中的毒素将丧失溶血活性，而半固体培养基中的毒素并不丧失活性。培养基的 最适d h 值在5 5 5 8 之间。 ( 1 ) c 0 2 对生长的影响 c 岛对金黄色葡萄球菌b 溶血素效价的影响了解的不是很清楚，但似乎金黄色葡萄球菌b 溶血索的产量对c 0 2 的含量没有太大的依赖性。大多数的研究表明，在空气或者氧气中加入 c 0 2 可以提高金黄色葡萄球菌b 溶血素的效价，c 0 2 的含量在1 0 2 5 可以取得好的效果。 m a l l e s w a r a n 等发现充足的氧气中含有5 0 的c 0 2 有好的效果，但h a q u e 和b a l d w i n 发现 在空气中将c o ；的含量提高到2 0 8 0 或者氧气中含有2 0 的c 0 2 对金黄色葡萄球菌b 溶血 素效价没有显著的影响。w i s e m a i l 认为在氧气中加入c 0 2 与在空气中加入c 0 2 相比较，金黄色 葡萄球菌b 溶血素的含量有所降低1 1 6 l 。w a d s i r o m 和m o b y 的研究表明在不含有c 0 2 的液体 培养基中仍可以获得足够的产量。总之。c 0 2 在提高b 溶血素效价是否起作用还有很多争论， 但对生长的影响似乎并不是必须的。 ( 2 ) 对氨基酸的需求， 有关影响金黄色葡萄球菌b 溶血素产量营养因子的 x : 收缩，从而使较薄弱的键断裂，导致结构分解。 后来，m e d u s k i 和h o c h s t e i n 【”】进一步提出“热冷”反应阶段是来源于神经鞘磷脂膜中胆碱 残基的改变。他们发现l ，一对红细胞的溶血作用与“热冷”溶血很相似，在“热”反应阶段之 前向体系中添加卵磷脂可以抑制红细胞的溶血，也就是说1 3 卵磷脂结合作为稳定的三碘化合物 存在。i ，一可以在p h7o 的条件下与其他可以发生“热冷”溶血的磷脂反应，如一n + ( c h 3 ) 3 。 同时他们指出，神经鞘磷脂由于它的化学特性最易于与1 3 一结合。绵羊、人和鼠的红细胞按顺序 对b 溶血素的敏感性逐渐降低，正如对1 3 一的敏感性一样。因此，这种结合磷脂就调节红细胞通 过膜的渗透，这种渗透在“热”的阶段达到一个平衡，当温度降低时这种平衡就被改变，渗透 就增加了。他们的这种关于“热冷”溶血的观点是红细胞对任何可以影响磷脂膜- n + ( c h 3 ) 3 组因素发生反应的一个特点。 b e m h e i m e r 也提出i m ，神经鞘磷脂可能位于细胞膜的表面上或者附近，在b 溶血素存在的 情况下，深度水解鞘磷脂，暴露细胞单分子层，这些单分子层在3 7 还能经受得住，但当温 度降低，就导致热力学不稳定，最终导致细胞膜大面积的破裂和溶血。 ( 2 ) 熬台剂诱导的“热冷”溶血 cjs m v l l l 等的研究也发现了这种“热冷”溶血现象，他指出，红细胞中大约有5 0 的( 神 经) 鞘磷脂在膜表面，比如绵羊的红细胞在等张盐溶液缓冲液中这种鞘磷脂的含量可达到6 0 ， 3 7 红细胞在神经鞘磷脂酶的作用下不引起溶血，然而再将红细胞冷却至4 则可导致红细胞 的完全溶血；如若在绵羊红细胞中添加乙二胺四乙酸( e d t a ) 后，再由磷脂酶c 平面培养， 可以发现在3 7 时，红细胞快速溶解，这是由于处理过的红细胞在熬合剂的诱导下易于溶解， 同时也就发生“热冷”溶血，但这两种溶解机制的原理都是相似的，溶解程度与延长细胞和磷 脂酶c 平面培养时间的增长而增加。不同种类的红细胞不是都很倾向于“热冷”溶解，但对于 熬合剂诱导的溶解都很一致，e d ，r a 系列的熬合剂是效果最好的，而其他较特殊的熬舍剂，如 c a 2 + ，z n 2 + ，f e ”，c u ”，和m 9 2 + 则没有效果。由熬合剂诱导的溶血速率取决于红细胞与b 溶血素 平板培养的时期以及添加熬合剂的浓度。研究发现，添加e 叽a 的最适浓度与外界添加m f + 的量是一致的，m 9 2 + 是神经磷脂酶c 活性的重要阳离子。低渗溶液可以增加熬合剂诱导溶血的 速率，然而，增加渗透压达到等渗溶液的2 倍，则会完全抑制熬合剂诱导的溶血。这些充分说 明，外界添加或者细胞膜本身具有的二价阳离子是磷腊酶破坏细胞膜稳定性的重要离子，“热冷” 溶解的现象可能温度依赖二价阳离子稳定性的结果p ”。 1 2 6 致病性 金黄色葡萄球菌b 溶血素的致病性机理还不是很清楚。b 溶血素可以从动物源的金黄色葡 萄球菌菌株中分离得到，有研究表明牛源的金黄色葡萄球菌与人源的相比大部分携带有金黄色 葡萄球菌b 溶血素，而且还表达该基因的表型。产生b 溶血素的细胞组织能够选择性地聚集一 些毒素分泌物，p a r k p w 等的等位基因敲除实验证实了这一点【3 b 】，a a r e s t m p f m 1 是目前唯一能 够支持该观点的试验，与金黄色葡萄球菌b 溶血素等位基因敲除后相比较，敲除前b 溶血素的 产生能够增加金黄色葡萄球菌在小鼠乳腺中的增长邛溶血素能够提高胞外( 结构) ( e c t o d o m a j n ) 域多配体蛋白4 ( s y n d e c a n 1 ) 和外皮生长因子肝磷脂复合物的脱落，这些高胞外 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 脱落可以促进细菌性的发病，由b 溶血素导致的胞外( 结构) 域脱落的活性则可能是金黄色葡 萄球菌的毒性机制。 在致病性上，金黄色葡萄球菌b 溶血素能溶解红细胞、具有白细胞毒性、对奶牛乳房具有 致病性，可使乳房产生乳房炎，而且b 溶血素还能减弱纤毛的运动，诱发兔子鼻窦炎m 】。由于 角膜和巩膜上皮细胞膜富含( 神经) 鞘磷脂】，因此在眼睛有感染的时候，b 溶血素就会侵袭 该组织。 金黄色葡萄球菌b 溶血素在一些疾病的发病机理上起重要的作用，因此就可能成为疫苗的 组成成分【4 ”。 ( 1 ) 磷脂酶c 活性 磷脂酶c 是一种分解磷脂的酶，它主要存在于胰腺、肠粘膜、肾、肝和脑中，可使甘油磷 酸胆碱分解为甘油二酯和磷酸胆碱的一种酶。1 9 6 3 年首次发现b 溶血素具有磷脂酶c 活性m 】。 国外很多的研究资料表明，金黄色葡萄球菌b 溶血素就具有这种分解甘油磷酸胆碱能力，但这 方面的研究还只仅限于对红细胞的作用，对其他细胞则知之甚少。 1 ) 对红细胞的溶解及其机制 s km a t l e s w a r a n 与r o b e nk l i n d o r f e r 的研究表明 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章文献综述 为n - 乙酰( 神经) 鞘氨醇和磷酸胆碱；其他的阳离子，比如，c o ”和m n ”也可以提高其溶血能 力。而金黄色葡萄球菌b 溶血素的抑制剂，如乙二胺四乙酸、碘乙酰胺就能够抑制红细胞血影 和神经鞘磷脂中有机磷的释放。 d o e r rj a 等的研究表明，在血琼脂平板上金黄色葡萄球菌周围b 溶血环的大小与来自鸡饲 喂黄曲霉毒素的水平有关，当饲喂高水平的黄曲霉毒素( 】o m g 幢) 时，溶血环的大小是对照组 的6 倍，分离到含有b 溶血素的金黄色葡萄球菌株的比例可以从正常血液中的15 增至饲喂过 黄曲霉毒素( 1 0 m 眺) 血液的9 0 ，而且可以检测到p 溶血的时间也缩短一半。纯化的金黄色 葡萄球菌b 溶血素溶解红细胞的能力随着鸡血中黄曲霉毒素的增加而增强，这些都说明，在动 物霉菌中毒时为何动物对抗原的毒性因子更敏感，动物更易于被感染媒介所感染给出一个新的 机制。 ( 2 ) 自细胞毒性 虽然人的白细胞和淋巴细胞只含有少量的神经鞘磷脂，但金黄色葡萄球菌b 溶血素对这些 细胞的作用仍有争论。m a 曲a i 】l j 等的研究表明1 9 】：1n g 的金黄色葡萄球菌b 溶血素在冷热” 试验中，可以溶解1 1 5o o o 个绵羊红细胞和8 20 0 0 个人的红细胞，并且可以导致3 2 5 个红细胞 和白细胞毒性。溶血毒性和自细胞毒性都是m 矿+ 依赖性的，每个物种的红细胞易于溶解的特点 与本身所含神经鞘磷的含量有直接的关系。通过显微电镜扫描，在m f + 存在下，金黄色葡萄球 菌b 溶血素的“热冷”培养可以导致红细胞和淋巴细胞表面结构形态上的改变，这种改变在红 细胞主要体现在膜表面形成坑和膜的内陷，白细胞则丧失了膜表面的皱褶并呈现膜的全部瓦解。 该研究表明，含有神经鞘磷脂的白细胞和淋巴细胞在有金黄色葡萄球菌b 溶血素的存在下，他 们的存活能力降低，也就是说，金黄色葡萄球菌b 溶血素天然具有自细胞毒性，白细胞膜在金 黄色葡萄球菌b 溶血素的作用下并不像红细胞那样膜内陷，因此，白细胞毒性的产生并不是由 于膜的溶解。 ( 3 ) 奶牛乳房炎 养牛业目前是我国畜牧业发展的主要产业，奶牛业又是养牛产业中的重中之重，而阻碍我 国奶牛业发展的最主要障碍之一就是牛奶的品质问题，奶牛乳房炎始终是困扰牛奶品质的棘手 问题，是危害奶牛业发展的一类重要疾病，进几年奶牛乳房炎的发病率在全球有上升的趋势【4 9 】， 每年均给奶牛业造成巨大的经济损失。引起奶牛乳房炎的最主要致病菌之一为金黄色葡萄球菌， 而牛源金黄色葡萄球菌中有7 5 携带编码表达b 溶血素基因，与人源金黄色葡萄球菌相比，表 达的b 溶血素基因显著多于q 溶血素，是导致奶牛乳房炎的一个重要因素。 1 ) b 溶血索是导致奶牛乳房炎的一个毒力因子 从欧洲和美国患有乳房炎的牛只中，l a r s e nhd 独立的流行病学调查研究发现，患牛中存 在的超抗原外毒素与b 溶血素由于地域的不同而呈现不同的比例。目前以及以往的研究表明， 超抗原外毒素在奶牛乳房炎发病机理上不起任何作用，而b 溶血素则可能就是导致奶牛乳房炎 发病机理的一个活性毒力因子】。 c i f r i a ne 的试验充分说明了金黄色葡萄球菌b 溶血素对奶牛乳房的致病性。他指出溶解 奶牛红细胞的主要是金黄色葡萄球菌b 溶血素，n 溶血素可以增加金黄色葡萄球菌b 溶血素对 奶牛红细胞的溶解，蔚单独存在于金黄色葡萄球菌上清培养液中a 溶血素却不能增加对奶牛红 细胞的溶解。纯化的金黄色葡萄球菌p 溶血素对奶牛分泌上皮细胞具有细胞毒性作用，在体外 7 墨些江八一农垦大学碳士学位论文 第一章文献综述 可以溶解牛的上皮细胞，但该作用弱于溶血素。 而且，l o e 用e rd a 等在_ je l l s a 方法检测乳中和血清中抗体的实验中，感染金黄色葡萄 球菌慢性乳房炎的乳中，可以检测到b 溶血素抗体水平的增加，这很明显是机体免疫系统对毒 素做出的应答m 】。 2 ) 对奶牛上皮细胞的作用 有研究表明，金黄色葡萄球菌b 溶血素能够破坏奶牛乳房分泌上皮细胞，并增加q 溶血素 对机体的损害，增加金黄色葡萄球菌对奶牛上皮细胞的粘附，继而增加金黄色葡萄球菌在病畜 体内的增殖。 在c i f r ia 1 1e 等的试验中m 1 ，将牛的上皮细胞与抗d 溶血素和b 一溶血素的抗体与金黄色葡萄 球菌上清培养液一起培养，并检测金黄色葡萄球菌对细胞的损坏以及粘附作用，该结果表明， 抗溶血素血清、抗p - 溶血素血清以抗n 溶血素+ 抗b 一溶血素血清可以抑制金黄色葡萄球菌上 清培养液的细胞毒性，其中抗血清a 溶血素+ 抗p 培血素对其的抑制作用最强，而抗b 一溶血素 血清的抑制效果最差。同时三种抗血清都可以降低金黄色葡萄球菌以及大量的粘附细菌中每个 菌落的有机菌对奶牛单层上皮细胞的粘附的百分比。在该研究中抗溶血素血清以及抗a 溶血 索+ 抗p - 溶血素血清均能够减少每个平板中金黄色葡萄球菌的菌落数，然而抗p 一溶血素血清却 没有显著的效果。抗q 溶血素+ 抗d 一溶血素血清能够减少金黄色葡萄球菌粘附上皮细胞的百分 比，但无论抗q 溶血素还是抗b 溶血紊血清都没有显著的效果。该试验很好的说明了，抗金黄 色葡萄球菌血清可以减少金黄色葡萄球菌以及该菌对上皮细胞粘附的百分比、平板中菌落的数 量以及每个菌落种有机体的数量，抗体能够抑制该菌对奶牛上皮细胞的粘附。试验结果表明： n 溶血素抗体和肛溶血素抗体可以抑制金黄色葡萄球菌对奶牛乳房上皮细胞的粘附和细胞毒 性，同时金黄色葡萄球菌抗体能够抑制金黄色葡萄球菌对奶牛乳房上皮细胞的粘附。 3 ) 对小鼠乳腺的毒性作用 在c e n c i g o g a b t 等的实验中p ”，将不表达p 溶血紊的金黄色葡萄球菌菌株进行定点突变， 使其具有毒性，该突变株的毒性与在泌乳期乳房内接种的野霉株的毒力相比较，结果显示，野 毒株可以导致急性乳房炎，使泌乳期小鼠6 0 在4 8 h 内死亡，小鼠接种b 溶血素突变株的也能 够导致急性乳房炎，但并没有死亡发生。乳腺的组织病理学实验表明，细菌被吞噬的发生与毒 性没有任何关系，产毒素菌株，尤其是产b 溶血索菌株可以大量繁殖，侵害小泡间的组织，产 生严重的损害，b r a i i ，l e y a j 等的实验也证实了这点。这些都充分说明了金黄色葡萄球菌b 溶 血素对小鼠乳腺具有毒性作用例。 4 ) 影响奶牛乳房肌上皮细胞生殖 z a v i z j o nb 等在体外研究金黄色葡萄球菌数量对奶牛乳房肌细胞生长和功能的研究中指 出，b 一溶血素可能在影响奶牛肌上皮细胞生殖的过程中起作用。金黄色葡萄球菌m 6 0 是同基因 突变，它可以产生q 溶血素或者b 溶血素，将肌上皮细胞与m 6 0 上清培养基作用后。可以减少 肌上皮细胞的数量，但这种损害的程度弱于野毒株的上清液。在细胞实验中，在上清培养基中 添加缩宫素( 1 0 ( - 7 ) m ) 后，有4 2 的细胞发生收缩，当肌上皮细胞与m 6 0 上清作用1 5 m i n 后，与未加缩宫素之前相比较，收缩细胞的数量可以达到9 2 。将肌上皮细胞与同样的上清作 用，在培养基中未添如缩宫素即取消缩宫素的反应，对肌动蛋白和肌球蛋白的免疫定位没有影 响，但是可以影响肌上皮细胞中h 肌动蛋白的位置【s 7 】。 8 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 质粒、宿主菌和细胞 第二章材料与方法 金黄色葡萄球菌s 1 0 株、b l 2 1 宿主菌、原核表达载体p e t 3 2 a 质粒均由黑龙江八一农垦大 学预防兽医实验室保存：p m d l 8 - t 载体质粒购自t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司。 2 1 2 工具酶和化学试剂 t 4 肼q a l i g a s e 、限制性内切酶聊h i 与s 甜i 、i p l b 、x g a l 、l a t a q d n a 聚合酶、d l 2 0 0 0 、 d l l 5o o o 和氨苄青霉素为t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司的产品；g 0 1 d v i e w “d n a 染 料购自北京赛百盛基因技术有限公司：其它化学试剂为国产分析纯级；p c r 引物由上海生工生 物工程技术服务有限公司合成。 2 1 3 培养基 细菌培养用胰蛋白胨和酵母提取物为o x o i d 公司产品。 2 1 4 试剂盒 a g a r o s e g e ld n a p u r i f i c a t i o n k i t ，购自杭州维特洁生化技术有限公司。 2 1 5 主要仪器设备 g e jd o c 2 0 0 0 紫外凝胶成像系统：美国b i o r a p c r 仪：p c re x p r e s sh y b a i d 2 k 1 5 型高速台式离心机：美国s i 舯a 公司 c r 2 1 型高速立式离心机：日本日立公司( h i t a c h l ) r 一1 3 4 a 型超低温冰箱：r e v c o ，g e n e q u 卸tl lp h a h r i a c j ab i o t e c h s l m f 12 4 型制冰机：日本索尼电子股份有限公司 h z s h 型水浴振荡器：中国哈尔滨东联电子技术开发公司 h z q c 型空气浴振荡器：哈尔滨市东明医疗仪器厂 d k s 1 2 型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司 h c 2 1 0 0 6 型低温恒温器：重庆实验设备厂 x w 8 0 a 型旋涡振荡器：上海医疗器械五厂 d r p 9 2 7 2 型、d r p 一9 2 7 1 型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司 9 黑龙江八一农垦人学硕士学位论文 第一章材料与方法 p h s 一3 c 型精密p h 计：上海雷磁仪器厂 2 2 方法 2 2 1 引物的设计与合成 根据已发表的金黄色葡萄球b 溶血素基因序列m 1 设计p c r 引物，并在上游引物57 末端加 入且hi 限制性酶切位点，下游引物57 末端加入曲限制性酶切位点。经计算机b l a s t 软件分析，具有较好的特异性。送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。引物的核苷 酸序列为： 上游引物：5 。g c g q 鱼叁王匹a a a g t t g c a a c a c t t g 一3 下游引物：5 g g ag 匹堑c g a g l l a 订a g n a g t t g a g c 一3 目的p c r 产物大小：9 8 2 b p 2 2 2p c r 菌体模扳d n a 的制备 将菌株接种于血平板培养基中，3 7 恒温箱培养过夜，挑单菌落于t s b 液体培养基中，3 7 剧烈振荡培养1 2 h 。取1 m l 菌液1 0 0 0 0 咖i n ( 4 ) 离心1m i n ，去上清，并将残余液滴吸净。 加入5 0 0 肛t e ( p h 8 q ) l o o 煮沸1 0 m i n ，立即放置于冰上，一2 0 保存备用。即可作为p c r 反应的模板。 2 2 3p c r 扩增金黄色葡萄球菌b 溶血素基因 p c r 反应体系的组成： 以感染牛乳房炎牛乳中的金黄色葡萄球菌s 1 0 的d n a 为模板，利用t ，岖a r a l a l 细“d n a 聚合酶和设计的引物扩增金黄色葡萄球菌b 一溶血素基因。 组成成分体积 灭菌去离子水 1 0 x p c rb u 疵r d n t p s ( 每种浓度为2 5 m m ) 上游引物( 2 5u m ) 下游引物( 2 5 “m ) 模板d n a ( 2 0 0 n 肛l ) l a t a qd n a 聚合酶( 5u 止) 反应总体积 p c r 反应程序： 9 4 预变性3 m i 矿后，再以9 4 变性1 5 m i n ，5 9 退火1 m i n ，7 2 延伸1 m i n ( 】k b 的 p c r 产物m i n ) 进行3 0 个循环，最后以7 2 延伸l o m j n ，p c r 产物于4 保存。 0 虬虬虬虬虬虬虬此 ：。，。毗加 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章材料与方法 2 2 4 琼脂糖凝胶电泳 用1 t a e 电泳缓冲液配成1 琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后，加 入g o l d v j e w d n a 染料( 5 m m l ) 至终浓度为o 5 m l ，稍冷却后灌胶。凝胶完全冷却后， 取5u l p c r 扩增产物与1 ，6 体积的电泳上样液( 0 2 5 溴酚蓝，0 2 5 二甲苯青f f ，4 0 蔗 糖) 混匀，将混合样本加到上样槽中，以5 v c m 的恒压进行电泳。当溴酚蓝电泳至适当的位置 后，用长波紫外线灯观察并记录结果或凝胶成像系统拍照保存( 本实验所用的琼脂糖凝胶未加 说明均含有终浓度为o 5 耀加l 的g o j d v i e w d n a 染料) 。 2 2 5p c r 产物的回收与纯化 用d n a 凝胶回收试剂盒( d n ag e le x t r a c t i o nk i t ) 回收和纯化d n a ，其具体过程如下： ( 1 ) 在紫外灯下切取含有目的d n a 片段的琼脂糖凝胶，置于2 m l 微量离心管中。 ( 2 ) 称量凝胶质量，按照凝胶：e x 仃a c t i o n b u 行e f l ：3 的体积溶解凝胶( 以1o o m g = 1 0 0 止换算凝胶体积) 。一次虑加e x t r a c t i o n b u 疵r 不得超过1 2 m l 。 ( 3 ) 悬浮均匀在水浴锅中加热( 普通胶5 5 ，低溶度胶5 0 ) ，每隔2 3m i n 涡旋一次， 直至凝胶块完全融化为止( 约1 5 m j n ) 。凝胶块必须完全融化，以充分释放凝胶中的d n a 。 ( 4 ) 在离心管中加入与凝胶等体积的异丙醇。 ( 5 ) 将上述溶液转移到样品离心管中，6 0 0 0 r n l i n 离心1m i n ，去除漏液。如果样品体积 超过7 5 0 儿，将剩余的样品加入离心管中再离心一次。 ( 6 ) 在离心管中添加5 0 0 此的e x n t i o nb u 彘r ，离心lm j n ，去除漏液。 ( 7 ) 添加6 5 0 l 的w a s h b u 妇，离心1 m i n ，去除漏液。 ( 8 ) 重复步骤7 一次。 ( 9 ) 1 2 0 0 0 r m i n 离心1m i n ，然后将柱子转移到灭菌的1 5 m l 的离心管中。 ( 1 0 ) 添加5 0u l 的e 1 u t i o nb u f f c r 或灭菌去离子水( 如果要提高回收率，可预先将e l u t i o n b u 腩r 或灭菌去离子水在5 0 5 5 中预先进行水浴) 。在室温下静置数分钟。 ( 1 1 ) 1 2 0 0 0 r m i n 离心l m i n ，在离心管中的b u 彘r 或去离子水中即包含所需的d 州a 。 抽提出的d n a 可直接用于分子的生物学实验。如果不能马上使用，可先置于一2 0 冰箱 中保存。 2 2 6 金黄色葡萄球菌b 溶瓶素基因的克隆 ( 1 ) 感受态细胞的制备( c a c l 2 法) 在无菌条件下，用接种环从甘油保存菌b l 2 1 中挑取较少量的菌液，接种到新鲜不含抗生 素的l b 琼脂平板上，3 7 过夜倒置培养1 2 h 。从l b 平板上挑取单个菌落，接种到4 m l 不含 抗生素的l b 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜。次日无菌吸取1m l 培养液接种于1 0 0 m l 不 含抗生素的l b 液体培养基中，3 7 剧烈振荡( 3 0 0 r m i n ) 培养3 5 h ，至o d 6 0 0 值为o 3 0 4 ， 冰水浴1 5m i n ，使培养物冷却到o 。在无菌条件下将其平均转移到2 个用冰水预冷的5 0m l 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料与方法 离心管中，4 ，4 0 0 0 r ，m j n 离心1 0 m i n ，彻底倒掉上清液，回收细菌沉淀。然后每管用冰预冷 的1 5 m l c a c l 2 溶液轻轻悬浮细胞，冰水浴2 0 m i n ，4 ，4 0 0 0 “m i n 离心1 0 m j n ，倒掉上清液。 每管加入2 m l 冰预冷的c a c 】2 溶液重新悬浮细胞，冰上放置儿分钟，即为感受态细胞，分装到 e p p e n d o r f 管中，每管1 0 0 此，动作要快，一7 0 冰箱中保存备用。 ( 2 ) 连接 在o 5 m l 离心管中按插入d n a 与p m d l 8 t 载体摩尔比约为3 ：1 依次加入下列成分：灭 菌双蒸水2 3 皿，p m d l 8 一t 载体o 7 此，目的片段d n a2 此，s o i u t i o n ( 含堍a s e ) 5 ，混匀 后瞬时离心，1 6 水浴过夜，次日即可做转化。 ( 3 ) 转化 做连接产物的全量转化。于一7 0 冰箱中取出一支1 0 0 此的感受态细胞，立即放入冰盒 中。用手心将感受态细胞快速融化之后，将连接产物全量加入到1 0 0 吐感受态细胞中，轻旋混 匀，冰上放置3 0 m i n 。然后4 2 热休克9 0s ，注意不要摇动，立即冰浴2 m i n 。加入1m l 事先 3 7 水浴的l b 液体培养基，3 7 空气摇床振荡培养4 5 6 0 m i n 。培养产物瞬时离心，将上清 液留约2 0 0 曲，其余倒掉，旋涡震荡混匀菌体，将其涂布于l b ，a m p + g a l n p l 平板培养基 上，3 7 温箱中培养过夜。 ( 4 ) 重组质粒的小量制备 挑取转化板上的白色菌落，无菌接至3m ll b a m p + 液体培养基中，震荡培养2 4h 后，采 用碱裂解法小量提取制各质粒。 取1 o m l 菌液于1 5 m l 离心管中，1 2 0 0 0 转m i n 离心1 m i n ，尽弃上清，稍微干燥菌体沉 淀后，加入1 0 0 吐溶液i ，充分震荡悬浮菌体，使所有菌体沉淀均匀散开；加入新鲜配置的溶液i i 2 0 0 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章材料与方法 p c r 反应程序： 9 4 预变性3 m i n ，9 4 变性l5 m i n ，5 9 退火l m i n ，7 2 延伸1 m i n ，3 0 个循环，最 后7 2 延伸l o m i n 。p c r 产物4 保存。取5 止p c r 扩增产物于1 琼脂糖凝胶中进行电泳， 于紫外灯下观察和拍照。 2 ) 重组质粒的酶切鉴定 依据设计在引物两端的限制性内切酶位点，用b 口m hi 、勋切割所提取的质粒d n a ，以 鉴定重组质粒是否正确。 酶切体系如下： 组成成分 体积 重组质粒p m d l 8 - t - b 1 0 m cb u 订打 b 口m h i s h f i 灭菌去离子水 总体积 2 u l lu l lu l lu l 5 u l 1 0 u l 混匀后3 7 水浴2 3 h ，取出后全部上样，1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 ( 6 ) 重组克隆的序列测定和序列分析 取鉴定为阳性的重组克隆菌落1 个，无菌操作保存为甘油保存菌( 4 0 甘油与l b 液体菌 以体积比1 ：1 的比例混合) ，装至1 5m le p 管中，封口膜封口后，特快专递邮寄北京华大中 生科技发展有限公司测序。所获序列用b l t 程序与g e n b a n k 中已发表的标准序列进行比较。 2 2 7 表达载体的构建 ( 1 ) 将口e t 3 2 a 载体质粒转化至e 矗b l - 2 l 感受态细胞中，3 7 摇床中振荡培养过夜后， 提取质粒。 ( 2 ) 将质粒p e t 3 2 a 用b 口m hi 和勋，i 进行双酶切，使用d n a 纯化，回收试剂盒回收载 体。 ( 3 ) 将重组克隆质粒p m d l 8 - t - b 用曰口m hl 和黝f i 进行双酶切，使用d n a 纯化回收试 剂盒回收b 溶血素基因片段。 ( 4 ) 使用t 4 d n a l i g a s e ，将插入片段金黄色葡萄球菌b 一溶血素基因与载体p e t - 3 2 a 连接 后，热转化至e “b l 2 】感受态细胞中，涂布平板过夜培养菌体。 ( 5 ) 挑取白色菌落，提取质粒。 ( 6 ) 质粒用口口m hi 和涮i 进行双酶切检测，确认目的片段有无插入载体中。 ( 7 ) p c r 鉴定重组表达质粒p e t - 3 2 a 。 ( 8 ) 重组表达质垃的序列测定和序列分析 取鉴定为阳性的重组表达质粒卜个，无菌操作保存为甘油保存菌，装至1 5m le p 管中， 封口膜封口后，特快专递邮寄测序。所获序列用b l a s t 程序与g e n b a n l ( 中已发表的标准序列进 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料