（分析化学专业论文）全内反射荧光法研究卟啉、蛋白质的界面吸附和相互作用.pdf

擒要 摘要 全内反射荧光法( t 丑强) 其有高度的界面特异性，可以有效排除大量本体溶 液的干扰，获取界面信号，是一种良好的界面分析技术；生命物质在界面的性质 研究在基础科学研究、生物学以及工业中都具有重要的意义，已经弓l 起了广泛的 关注。卟啉是类具有重要生物意义的化合物，在新陈代谢中起着不可缺少的作 用；蛋白质是生物体的重要组成成分，参与所有的生命活动。卟啉和蛋白质在溶 液和界面的性质以及两者的相互作用一直是人们广泛关注的课题。本论文利用 t 嬲并结合同步荧光技术研究了卟啉、蛋白质在固腋以及液液界面的荧光光谱、 吸附特性以及两者相互作用。论文共分五章： 第一章为绪论，评述了t i 】麟在生命物质界面分析中的研究进展，本章共分六 部分。第一部分介绍了t 圈旺的原理、发展及其特点；第二部分对生命物质的界面 研究作了简单评述，介绍界面研究的意义和常用的界面研究方法；第三部分重点 介绍t i 】强研究生命物质在固液界面性质的主要研究内容和研究进展；第四部分 是t i r f 应用于液液界面的研究现状；第五部分介绍t 双f 与同步扫描技术的联用； 最后部分是在上述调研的基础上提出了本论文的构思。 第二章研究了在十六烷基三甲基溴化铵( c 刑婚) 存在条件下，t p p s 在水溶 液、亲水玻璃水界面以及二氯二甲基硅烷修饰的疏水玻璃水界面的荧光光谱和吸 附特性，考察了影响t p p s 荧光光谱和界面吸附的因素，探讨了特定条件下t p p s 在界面的吸附动力学情况，对于生物相容性材料的研究有重要的参考价值。本章 首先应用常规荧光、全内反射荧光并结合同步荧光技术深入探讨了t p p s 在水溶 液、亲水和疏水玻璃水界面的荧光特性，并考察了口p s 在界面的吸附。 p s 有 几种不同的存在型体，如双质予化、非质子化、胶束化单体、h 聚集、j 聚集以及 与其它物质形成复合体等，实验结果表明，在c 尉圆存在条件下，无论在亲水还 是在疏水玻璃水界面，t p p s 的非质子型体( 1 1 p p s 知) 均优先吸附在界面上，且在 亲水界面上，只有在p h 非常低的情况下有双质子型体( 曰p s 2 ) 存在，而在疏 摘要 水的玻璃水界面，在很宽的p h 范围内，h 2 t p p s 2 。都与t p p s 4 。共存在界面上。详 细考察了不同类型表面活性剂及其浓度、1 1 p p s 浓度、p h 值对本体溶液和界面荧 光的影响，结果显示静电力在t p p s 固液界面吸附过程中有重要的作用。考察了 t p p s 在不同溶液条件下的吸附动力学，比较了t p p s 亲水和疏水界面上不同的吸 附特性，探讨了影响t p p s 在固液界面吸附的因素，为调控t p p s 在界面的吸附和 应用提供新的研究方法和理论依据。 第三章研究了t p p s 与b s a 在溶液中和固液界面上的相互作用以及b s a 在 玻璃水界面的吸附特性。首先考察了t p p s 对溶液中b s a 内源荧光的影响，发现 t p p s 对b s a 的内源荧光具有猝灭作用，并计算其s t e m v o l m e r 猝灭常数以及猝灭 速率常数，证明t p p s 对b s a 具有静态猝灭作用。研究了不同p h 条件下，b s a 对溶液中t p p s 荧光的影响，发现两者在较低的p h 范围更易于形成结合体。以t p p s 作为b s a 的荧光探针，提出了一种t 时测定溶液中b s a 含量的新方法，b s a 浓 度在1 4 7 l o 一1 1 8 1 0 1 m 范围与界面结合体同步荧光强度成正比，线性拟合方程 为i 一3 2 1 + 1 4 5 3 c b s a ( 1 0 m ) ，并应用于实际血清样的分析，与临床数据结果吻合 较好。本章重点利用t i i 谭考察了各种因素对蛋白质在玻璃水界面的吸附的影响， 考察了不同溶液条件下b s a 在固液界面的吸附动力学，获得不同条件下b s a 的 吸附动力学参数，结果表明b s a 的吸附动力学符合e l o v i c h 方程和双常数方程， 计算了不同条件下b s a 在亲水玻璃水界面的饱和吸附量和吸附平衡常数，结果表 明，b s a 在玻璃水界面的吸附过程符合l a i l g m u i r 吸附模型，b s a 以单分子层吸 附于玻璃水界面。初步探讨了b s a 在二氯二甲基硅烷修饰的疏水玻璃水界面的 吸附特性，并与亲水玻璃水界面的性质进行比较。 第四章研究了不同p h 和浓度条件下b s a 与t p p s 在液液界面的结合情况， 并探讨了b s a 在界面的吸附情况。结果表明，在液液界面两者主要以1 ：1 比例相 结合；比较界面与甲苯中的荧光光谱，可以推测，油水界面的极性更接近有机相。 建立了现场检测油水双相体系分配的荧光技术，考察了b s a 与t p p s 在水、界面 以及油相中的分配和型体特征。通过绘制全内反射同步荧光强度与溶液总浓度的 i i 摘要 关系曲线，获得b s a 的临界胶束浓度为1 o 1 0 r 4m ；提供了计算界面吸附参数的 新方法，获得了b s a t p p s 在甲苯水界面的饱和吸附量和吸附平衡常数。 第五章是本论文的结语与展望。总结了本论文研究工作的创新性，并对研究 工作的进一步发展进行了展望。 关键词：全内反射荧光法，蛋白质，卟啉，固液界面，液液界面 i a b s t r a c t t o t a li n t e n l a lr e n e c t i o nn u o r 鼯c 饥c e ( t i 下) s p e c t r o s c o p yi sah i g m ys e l e c t i v c 锄d s e i l s i t i v ew a yt 0s t u d yt h ei n t e r f a d a lr e 西o n t h ei n t e 娟臣c i a lb e h a v i o ro fb i o m a t e f i a li s i m p o r t a n ti n如n d 锄e n t a lr 豁e a r c h ，b a u s i ci n d u s 白叮 觚db i o l o 季c a ls c i e n c 鹪t t l i s d i s s e r t a t i o nu s e st i r f 锄di t sc 0 n l b i n a t i o nw i t l ls y n 幽n o u sf l u o f 骼c e n c et e 幽q u et 0 s t u d ym eb e h a v i o ro fp r o t e i na n dp 0 讪舛na ts o l i d l i q u i di n t e m 啪a n d1 i q u i 硼i q u i d i n t e 一沁e t h ep a p e rc o n s i s t so ff i v ec h a p t i 湘 i nc h a p t e ro n e ，l cr c s e a r c hp r o g r e s sa l l da p p l i c a t i o no ft i r fi nb i o m a t 耐a ls t u d y a r cr e v i e w e d 1 1 1 i sc h a p t c fc o n s i s t so fi n 仃o d u c t i o no ft i r es t u d yo fb i o m a t 舐a l i n t e 血c i a lb e h a v i o r ，b e h 撕o ro f b i o m a t 耐a la ts o l i d 1 i q u i di n t e 疵c e 锄dl i q u i d l i q u i d i n t e r f a c eb yt i i t f t h ec o m b i n a t i o no ft 疆a 芏l ds y i l c h r o n o l l ss c 锄i n gt e c h n i q u e ，肌d m er e s e a r c ho b j e c t i v ef o rt h i sd i s s e n a t i o n i nc h a p t e r 伽o ，t i r fw a su s e dt 0i n v e s t i g a t e l ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro f m e s o - t e t r a l 【i s q - s u l f o n a t o p h e n y l ) p o 啦蛐n ( t p p s ) a tt l l e 酉弱s 、a t c ri n t e r f a c ei nm e p r e s e n c eo fac a t i o i l i cs u r f a c t a n t ( c e t y l t r i i n e m y l a n 硼o n i u mb r o m i d e ，c t a b ) l rb e l o w t h ec r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t i 嘶o n w bp r o p o s e dt l l ea d s o r p t i o nm o d e lo ft p p s ，w l l i c h w 嬲d i 岱胁t6 o mm ea d s o 印t i o no ft p p si n 廿1 ep r e s e l l c eo fm i c e l l e so fc t a ba t 酉鹤s w a t e ri n t e r f a c e t p p s 姐dc 1 d i dn o tf o 肌s t a b i l ec o m p l e xi nd i l u e n ts y s t 锄a t m ei n t e r f a c e 1 1 1 ei m e r f a c i a ls p e c i e so ft p p sw e r ea i l a l y z e db yc o m p 撕n gm es p e c 缸o f t p p sa t 钉舱酉嬲s ) i ，a t e ri n t e r f i a c ea n di i lm ea q u e o u sp h 嬲e t h ei n f l u e n c 懿o ft h et p p s c o n c e 1 1 _ 行a t i o n ，m ec t a bc o n c e i l 触t i o n ， a i l dm ep hv a l u 懿0 nt 1 1 ei n t e 血c i a l f l u o r e s c e i l c es p e c 舰孤di n t e i l s i t i 懿w e r es t u d i e d i td 锄o n s t r a t e dm a te l e c 呐s t 撕c i n t 删i o na i l dh y d r o p h o b i c i 够h a di m p o r t a n te 腩c to nm ea d s o 印t i o no ft p p si nt 1 1 c p r e s e l l c eo fc t a b 1 1 1 ed i 丘曲m te 腩c t so ft p p sc o n c e n t r a t i o no nt h ea d s o 印t i o n b e h a 啊o u ro ft p p sa td i 舒嬲l tp hw e r e0 b s e r v e df 0 rt h ef i 塔tt i m e i tw 嬲f - 0 u i l dt h a tm e i v a b s 臼锹 a d s o 巾t i o ni s o t l l 锄so ft p p sa t 酉a s s w a t e ri n t e r f i a c ec o u l df i tf r e u n d l i c he q 删o na t p h7 1 a tb 曲嘲p h o 税c 百嬲s v a t 盯i n t e r f a c e ，d i p r o t o n 加c d 口p s 锄dm i p r 0 白o n a t e d t p p sb o me x i s ta t 也ei n t 洳i nm e 、) l ，i d ep h 瑚g c ni n d i c a t e dt l l eb e h 撕0 ro f t p p s a td i 妇衙t 缸e 慨ei sd i f 断e n t 1 1 1 i ss t u d yp r 0 v i d c dt l 啪r e t i c a lb 勰ef i 缸嘲a l a d s o 印t i o no f t p p s i nc h a p t e rt h 心e ，t l 垃n 黜t i o no ft p p s 锄db s ai l l l u t i o n 锄da t 廿豫 西鹤咖a t 盯i n t 盯f a c ew 勰s t u d i o db yn u o s c e n c cs p 吧n s c o p yi tw 鹤f o m l d i a tt p p s q u c h c dn l eb s ai i l t r i n s i cm 1 0 r e s 咖c e 1 1 坨s t 踟卜、，0 l m 盯q 懈c h i i l gc 0 璐t a | n 锄d q u e n 龇g r a t ec 0 烈姐tw 嗽翻c u l a t e d 锄di t 砌i c a t c dt p p sh a ds t a t i cq u 锄出n gf o r b s af l u o r e s c 吼c e 1 p p sw 勰u s e d 弱ab s an u o r 鹤c 锄c ep r o b e 孤dat i i 心m e 1 0 d 衙 d 醣釉疵i i l l gm ec o n c 删o no fb s am s o l u t i o nw 嬲p r o p o s e d t h em e t h o dh a db e 饥 a p p l i e dt 0r c a lb 1 0 0 ds e n l l i lw i ms a t i s 伽n gr e s u l t s s 鲫嗽lf a c t 邮o nt l l ee 行融o fb s a a d s o t i o no n t 0s o l i 肌i q u i di n t e r f a c e w e r er e s e a r c h e db yt i i 疆t h ea d s o 印t i o n e q u i l i b r i 啪c o n s t 锄ta n dt l l em a x i m u 】 i l 锄o u n to fa d s o 叩t i o n w e r cc a l c u l a t e db y l a n g m u i ra d s o 印t i o ni s o t l l e 衄a lm o d e l t h ea d s o 叩t i o nl 【i n 舐c so fb s a i i l ( 1 i f | 陀n t s 0 1 u t i o nc o n d i t i o n sw 嬲s t u m e d 觚dm ea d s o r p t i o nk i n e t i c sp a r 锄e t e r sw e r eg a i n e db y s e v e r a la d s o 印t i o nl 【i i l e t i c sm o d e l s n l ea d s o 叩t i o no fb s aa th y d m p h o b i c 哲硒咖a t c r i n t e 娟坞em o d i f i e dw i md i d = l l o 血d i m e m y l s i l a n ew 鹪矗j m l 盯s n 】d i e d 1 1 l i sc h a p t 盱 p r o v i 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题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：毒坡 0 。口踩占月夕日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 干 j ( 日解密，解密后适用上述授权。 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 谤气。暂乞 、p t1j 儿 日 名够f 签弘 月 人岔 明 ，年栅晦 、艾 第一耄缝论 第一章绪论 1 1 全内反射荧光法( 耵r f ) 概述 1 1 1 荧光分析法简介 利用紫外光照射某些物质，这些物质会发射出各种颜色的光线，而当紫外线 停止照射时，所发射的光线也随之很快的消失，这种光线被称为荧光。荧光分析 法就是利用荧光的特性和强度来对物质进行定性和定量分析的。 荧光分析法的灵敏度极高【l 】，一般可超过分光光度法二至三个数量级；同时 荧光分析法的选择性好，特别是对有机化合物的分析而言。因为在众多的化合物 中熊发出荧光的化合物较少，且有激发和发射两种参数霹供选择。倘若选择适当 的激发波长和发射波长后仍无法消除干扰的话，还可以通过采用同步扫描、导数 荧光、时闻分辨、相分辨、三维荧光、圆体表面荧光帮荧光偏振等一些荧光测定 的技术，进一步提高测定的选择性。此外，方法简捷，重现性好，取样量少，仪 器设备不太复杂等等，也是荧光分耄蠢法的优点。 豳前，荧光分析法已广泛应用于医药、临床、农业和环境等领域，荧光分析 法已经发展成为一种重要的光谱化学分析手段，有关荧光分析法的理论与应雳， 有大量的综述性文章【2 6 】介绍。 1 1 2 空间分辨荧光法 现代分析化学正向着信息多维化的方向发展，空间分辨的重要性日益受到重 视。髓着微电子、计算机、机械加工和现代仪器的发展，几种空间分辨荧光技术 应运而生，主要包括：共焦荧光法、多光子荧光法、全内反射荧光法以及近场荧 光法【7 】。这些技术弥李 了传统荧光分析技术缺乏空闯分辨能力( 将空间上某一位 点信息定位抽取出来的能力) 的不足，使得荧光技术再次成为化学分析方法的研 第一章绪论 究热点。这些技术虽然原理各异，但均具有卓越的空间分辨能力。共焦荧光法利 用“针孔”效应，可有效地减少非探测区散射光以及无用荧光信号的影响，提高了分 析的灵敏度和对样品的空间定位能力，可对样品进行纵深剖析 8 】，其共焦成像的 分辨率和深度分辨力分别是普通显微镜的互和2 倍，构成的三维图像具有对比度 高、成像清晰和信息量大等优点；多光子激发荧光法根据非线性光学原理提高空 间分辨率【9 】，且和单光子激发不同，其激发波长处在比发射波长更长的波长位置， 减少了光损伤的可能性，双( 多) 光子荧光法可以在不伤害或杀死细胞的情况下 观察细胞，为生物学家探索细胞内各种分子的实时动态提供了有效工具，双光子 激发荧光法与共焦荧光法相结合可使空间分辨能力更为提高；近场荧光法则借用 扫描隧道显微镜原理，得以突破传统光学衍射的限制 1 0 】，配合扫描的方式在样品 表面上逐点采集荧光信号，即可获得极高分辨的荧光成像图，近场荧光显微镜与 光谱仪耦合可以进行纳米尺度的空间超分辨的近场光谱研究；全内反射荧光法利 用倏逝波激发界面层的荧光团，具有高度的界面特异性，可有效排除本体干扰， 获取界面信息。 这些空间分辨荧光技术的出现和发展，促进了单分子水平测定的实现和兴起， 并在材料科学、生物科学和医学等领域显示出巨大的应用前景。 1 1 3 全内反射荧光法 1 1 3 1 全内反射的物理学原理 当一束光以入射角0 i 从折射率n l 的介质1 照射到折射率n 2 的介质2 ，到达两 介质的交界面时，将可能同时发生光的反射和折射。反射光以与入射光相同的角 度0 i 回到介质1 ，而折射光以满足折射定律【1 1 】的角度0 。进入介质2 。折射定律可 以用下式表示： n l s i n 。i = n 2 s i n o t( 1 - 1 ) 如果光是由光密介质进入光疏介质时( n l n 2 ) ，其折射角e 。必定大于入射角0 i ， 2 第一耄缝论 因此必存在一个临界角魄，在入射角为时折射熊嚷力嚣趁。按照折射定律，晦赛 角的方程为： = s 讨魁勉l ( 1 艺) 当入射角大于临界角o c 时，通过折射定律的计算可得，s i n o p l ，即此时的折 射角瓴不麓为实数。丽按照几何光学的原理，折射角只能为q 至耽的实数，因此 可以认为在0 i 。c 时，没有折射光，只有反射光，这种现象叫做全内反射。全内反 射意味着入射光的能量无耗费地转为反射光的熊量，这是符合能量守恒定律的， 全内反射只发生在光密介质到光疏介质的界面上。光以不同的角度照射在两相界 面( n l n 2 ) ，发生的光学现象如图1 1 所示。 a ) e i 吼 吵罗。器 反射光 玲质l i x 介质2 射光倾2r 心触 图1 1 两相界面的光现象，n l n 2 f 德薹。lt h e 堍h 曲e 糕。瓣珏a 曩霉继e 运l e l 纭憾 当光从光密分质进入光疏介质，折射光和反射光的能量随入射角度的变化如 图1 2 所示。随入射角度的增加，反射光强度不断增强，折射光强度不断降低，当 入射角等于临界角时，反射光强度增至1 0 0 。当入射焦大于临界角时，没有折射 光，只有反射光。 3 第一章绪论 o 2 04 0 6 0 h c i d e n t 栅垂e ，d e 蓼e e 图1 2 反射光和折射光能量与入射角的关系 f i g 1 2t h e 聆l a 廿o n s h i pb e t w n n e c t a n c e & t m n s m i t t a n c ea n di l l c m e n ta n g l e 1 1 3 2 倏逝波及其性质 当全内反射在界面发生时，虽然入射光在界面上被全部反射，还是有一部分 电磁辐射渗透到光疏介质，这部分能量就称为倏逝波( 损耗波，消失波) 。倏逝波 不离开界面层又不耗费入射光的能量，因此可以认为入射光能在界面层沿一曲线 运动后再返回入射光的另一侧，构成反射光，如图1 3 所示，反射和透射是在界面 附近的一个区域内完成的物理过程。 4 第一翥缝论 h c i d e n t 魄l l t l 234 r e l l e c t e ll i g h t l 图1 0 全内反射产生倏逝波示意网 l 强g 。1 3s c h e 毽叠圣耋c 羚p 豫氍隰l 蠢t i 强。薹e v 雌e 鼹蛾耄w 蠢v e 毫嗲幻谯l 速锄藏l 硝l e e 耋蠢。蕤。 倏逝波是一个沿平行于界藤方向传播的行波，有如下相关的性质和特征【1 2 】： 1 ) 相速度 倏逝波的相速度为： = 1 ) l s i n o i = n 2 u 2 ( n l s i n e i )( 1 3 ) 由于嘲0 p 鑫2 趣l ，故匈2 ，可见倏逝波沿平行于界面方向传播的褶速度比一 般情况下电磁波在介质中的相速度小，故称之为慢波。 2 ) 渗透深度 倏逝波振幅沿界面法线方向按指数急剧衰减，见图1 4 。在距离界面z 诋处， 倏逝波的振幅衰减到界西处的l 绝倍，一般将距离d o 作为倏逝波存在的介质厚度， 称为倏逝波的渗透深度或有效深度( 穿透深度) 。它与入射角、入射光波长及两介 质的折射率有关，其大4 、表示必： d p = w 【2 耳( n 1 2 s i n 2 i 净ri l _ 2 2 ) 1 趁】 ( 1 4 ) 5 第一耄绪论 啦 夥 、 式 一i 童制吼e 纯e 越r e g i 哦 1r 图1 4 倏逝波渗透深度示意熙 f 远1 4s c h e m a 廿c 棚u s t r a 戗o no fe v a n e 瓣蚰tw a v eo f t i r f 入射角越接近临界角，倏逝波的渗透深度越大；随着入射角角度的增加，倏 逝波的渗透深度逐渐减小。一般情况下，渗透深度的大小与光波在介质l 中的波 长扎具有相同的数量级。倏逝波渗透深度一般大约在几百纳米左右，可以通过改 变入射角，控制渗透深度，达到空闻分辨的基的。 3 ) 倏逝波的能量 倏逝波能鳖e 圆随离开界面的距离z 呈指数迅速衰减： e ( z ) = e ( 0 ) e 刀d p 其中南为倏逝波的渗透深度。正是出予倏逝波的能量随离开界面的距离迅速 衰减，倏逝波只能作用于界面层附近的物质，因而具有高度的界面特异性。 1 1 3 3 全内反射荧光的产生 在界面产生的倏逝波可以激发界西层附近的分子，使其产生荧光。倏逝波具 有和入射光相同的频率。此处所指的界面层应理解为包括附近的有一定厚度的层 面，蠢子倏逝波一般渗透深度大约在几露纳米左右，并且倏逝波离嚣界面迅速衰 减，无法被大量本体分子所吸收，因此只能激发在界面层的荧光团，从而产生所 6 第一章绪论 谓的全内反射荧光( t i r f ) 。全内反射荧光技术可以实现对界面层分子选择性激发， 具有高度的界面特异性，它是一种表面分析的有效技术。改变入射光的入射角度， 倏逝波的渗透深度随之改变，因此，可以考察荧光团随界面距离的浓度变化，全 内反射荧光可和能量转移结合以研究在表面上荧光团之间的距离。 倏逝波诱导产生的荧光其强度可用下式来表示【1 3 】： i f j 扩昕“x ) i o e x p ( 一姒u d x ( 1 5 ) 其中，嘶是荧光量子产率，1 0 为界面处的荧光强度，x 为离开界面的距离，c ( x ) 是距离界面x 处的荧光团浓度。 1 1 3 4 全内反射荧光法的发展 h a r t i c k 【1 4 1 6 】在2 0 世纪六十年代开始从事全内反射领域的最初工作；全内反 射荧光实验是由h i f s d l f e l d 1 7 】在1 9 6 5 年完成；1 9 7 6 年，h i r s c 嘲d 【1 8 】首次尝试用 全内反射荧光法测定溶液中的单分子，揭开了单分子荧光检测的序幕。 8 0 年代后，全内反射荧光法得到了快速地发展，并被广泛地应用到界面物质 多样性的研究中，从聚合物、染料到蛋白质等。首先是全内反射理论得到了比较 全面的研究【1 9 】，同时t 心的量子方法的研究工作获得了进展 2 0 】。t i i 球技术受 到了生物界的广泛关注，并被应用到蛋白质吸附研究 2 l 】，聚合物表面的t 强研 究应用【2 2 】，多重的全内反射荧光光谱法研究 2 3 】，与时间分辨相结合的t 瓜f 【2 4 】 等。全内反射荧光配合偏振技术和时间分辨技术在研究表面分子或近表面分子的 取向、旋转、和荧光寿命方面已取得很好的效果。流动注射系统引入全内反射荧 光分析中实现了界面信号的在线检测，f i l i p p o v 于1 9 9 5 年提出了流通池内动力学 扩散对流吸附的理论 2 5 】，f i l i p p o v a 研究了聚合物在二度表面上的吸附和解附动力 学【2 6 ，2 7 】。目前，全内反射荧光法已经成为荧光光谱学在生物化学应用中的重要工 具 2 8 】。全内反射荧光法与荧光显微技术( t i 7 m ) 结合，更加强了界面空间分辨 的优势，主要应用于单分子的测定等。细胞膜内外的全内反射荧光研究得到了生 物科学家的极大重视【2 9 】。近年来，t i i 强m 已经用于活体细胞中蛋白质的单分子 测定【3 0 3 2 】。 7 第一章绪论 1 1 3 5 全内反射荧光法的特点 由于倏逝波只能激发界面层附近很小体积的荧光团，可以最小化背景吸收， 此外发射的荧光没有通过本体溶液，也能避免本体溶液对荧光的吸收，因此全内 反射荧光法具有高度的界面( 表面) 特异性，可以有效排除大量本体溶液的干扰， 获取界面信号；倏逝波的能量随离开界面的距离呈指数急剧衰减，对测定的分子 没有破坏，因此，全内反射荧光法是很理想的生命物质的检测手段；控制入射光 的角度，可以实现界面到本体溶液的深度剖析：此外，全内反射荧光法可以实现 单分子测定，是一种实时实地检测的方法，还可以制成各种传感器。 理论上讲，常规荧光分析的各种方法都可以应用到全内反射荧光法，如时间 分辨【2 3 ，2 4 ，3 3 】、偏振技术 3 4 】、能量转移 3 5 】以及同步扫描技术 3 6 】等都已经应用 于全内反射荧光，在研究表面分子的分布、取向、旋转、荧光团之间的距离、表 面多组分物质的同时检测和荧光寿命等方面取得进展，这进一步拓宽了全内反射 荧光法的应用范围。 当然，全内反射荧光法也有自身的局限，例如，对荧光仪器光源的要求比较 高，一般要采用激光作为光源，采用激光光源，研究物质的波长范围以及激发光 谱的绘制受到限制。如果采用染料激光则需要很高的费用。全内反射荧光法进行 定量存在一些困难，因为正确地校准t i r f 数据需作出一些假设：表面吸附和本体 中的荧光分子没有发生光降解；没有光散射和内滤效应；在吸附过程，荧光量子 产率没有发生变化等等，因此在全内反射荧光分析中较难进行界面的定量研究 3 7 】。 1 2 生命物质在界面的性质研究 1 2 1 生命物质简介 所有生命物体都是由化学物质组成的。组成生物体的化学物质除水和无机盐 外，还有蛋白质、核酸、多糖、脂类和多种具有生物活性的小分子化合物，它们 是生命活动的物质基础。由于生命物质的组成、结构和功能及其相互关系的研究 的重要性，生命科学研究向分子、原子水平发展，并在化学领域形成了生物无机、 8 第一章绪论 生物分析、生物有机、生物物理化学等生命化学的新研究方向。分析化学在生命 科学中的应用越来越广泛和深入，目前主要集中在蛋白质、核酸等生物大分子、 生物药物、痕量生物活性物质、活体分析等各方面的分析研究。 蛋白质是一类重要的生物大分子，是生物体的重要组成成分，参与所有的生 命活动，在生命现象和过程中起决定性作用。其结构十分复杂，基本上是由数百 个，甚至数千个氨基酸合成的多肽形成的多维结构，成分常因来源的不同而不同。 有的蛋白水解后只生成多种氨基酸，叫做单纯蛋白质，如卵蛋白、血清蛋白等都 是单纯蛋白质；有的蛋白水解后，除生成氨基酸外，还有非蛋白质成分( 如糖、 色素等) ，结合在蛋白质中的非蛋白部分称为辅基。 蛋白质可解离基团包括末端q 氨基、末端q 羧基及可解离侧链r 基。这些可 解离基团在特定p h 范围内解离，产生带正电荷或带负电荷基团。当溶液p h 使蛋 白质所带电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质分子本身净电荷为零时，此时p h 即为 该蛋白质分子等电点，用p i 表示，溶液p h 值大于p i ，蛋白质带负电荷，反之带 正电荷。 由于蛋白质的生物重要性，人们已将各种分析技术用于蛋白质分离纯化、鉴 定、检测、结构分析和物理化学性质等的研究之中。 卟啉及其衍生物是另一类重要的生命物质，广泛存在于生物体内与能量转移 相关的重要细胞器内。在动物体内主要存在于血红素( 铁卟啉) 和血蓝素( 铜卟 啉) 中，在植物体内主要存在于维生素b 1 2 ( 钻卟啉) 和叶绿素( 镁卟啉) 中。这 类物质在血细胞载氧进行呼吸作用和植物细胞进行光和作用过程中起关键作用。 因此化学家和生物学家对卟啉的研究一直比较重视。 卟啉的结构是由k l l s t e r 3 8 】于1 9 1 2 年首次提出的，其结构为大环的“四吡咯”结 构，当时被认为该结构是不稳定的，未被人们认可；直到1 9 2 9 年由f i s h c r 和z e i l 冶 成了氯高铁卟啉m a e m i n ) ，其结构才被证实【3 9 】。卟啉是在卟吩环上拥有取代基的 一类大环化合物的总称。卟吩是由4 个吡咯环和4 个次甲基桥联起来的大二共扼体 系。卧吩分子中4 个吡咯环的8 个p 位和4 个中位( m e ) 的氢原子均可被其它基团所 取代，生成各种各样的卟吩衍生物，即卟啉【4 0 】，见图1 5 。 9 第一章绪论 b 眦s o 昼 图1 5 卟啉的分子结构 f i g 1 5t h em o l e c u l 盯s t l m c t l i 砖o fp o r p h y r 证 卟啉的研究发展迅速，并在生物学、药物化学等领域等到了广泛的应用【4 1 】。 另一方面，合成卟啉也得到了广泛重视，人们根据各自的要求，设计具有特定结 构、性质和功能的卟啉化合物，这些合成卟啉有的可以作为模拟研究叶绿素、血 红素、维生素b 1 2 等天然产物的模型化合物主体，揭示生命现象的奥秘；有的可以 作为光动力学治疗、肿瘤早期诊断试剂 4 2 ，4 3 】。 1 2 2 研究生命物质的界面性质的重要意义 自然界存在固、液、气三种相态，互不相溶的两相要相互接触必定存在一个 区域，通过这个区域，体系的固有性能从一相到另一相发生了变化，这个区域就 是界面。界面在基础科学研究以及工业环境中都有重要的意义，已经引起了人们 的广泛关注。 由于在生物、医药、微乳液和工业上的应用，两种互不相溶的溶剂形成的界 面受到广泛的关注 4 4 ，4 5 】，液液界面上发生的特殊现象，如相转移催化、胶体化 学 4 6 】、分离化学、溶剂萃取 4 7 】和界面上的电子或离子转移过程【4 4 ，4 8 ，4 9 】等，已 经引起了各个领域研究者的广泛兴趣。液液界面对于食品体系和食品加工过程也 是异常重要的。比如，界面上蛋白质和表面活性剂的分离和反应极大地影响食品 1 0 第一章绪论 乳胶和微乳胶特性。乳胶的稳定性如蛋黄酱，很大程度上取决于其在油水界面上 的吸附。蛋白质乳胶影响食品存储时间和泡沫稳定性。食品工业( 与药物工业一 样) 通常用蛋白质来降低两个不互溶液相之间的界面张力，来使得一相在另一相 中悬浮。事实上，生物膜结构非常复杂，而不互溶的水油界面可以作为药物传输 实验的模型。液液界面提供了大分子在易受扰动的界面上相互作用的模型，因为 它有着模拟相关复杂系统的灵活性。如，添加表面活性剂和离子到简单的油水界 面或控制p h ，界面可以设计成复杂的体系来模仿很多生物系统。特别是，碳氢化 合物水界面可以代表生物膜表面，将水相的外部环境与非极性的核中心区域分隔 开。油水界面可以用来表征药物在生物膜上的传输，帮助我们理解其机理。在生 物医药应用中，药物在生物膜表面的行为是决定药理学活性的重要因素【4 5 】。 蛋白质在固液界面吸附是当前非常活跃的研究领域，因为蛋白质吸附存在于 许多生物现象中，如基本的生物物理和生物化学过程中，而且在各种实际应用如 生物材料【5 0 】、色谱【5 l ，5 2 】、d n a 探针 5 3 】、药物传输 5 4 】以及疾病治疗等，蛋白 质吸附都是基本的过程。在血液凝结和固相免疫探针研究过程中，蛋白质在固体 表面的吸附是首要发生的，因此深入了解这些现象是至关重要的。 对于生物科学来说，研究和理解分子在表面的性质是其学科的一个中心。比 如，血浆蛋白质与外界表面的相互作用，荷尔蒙和神经传质的键合，光合反应， 抗体抗原相互作用和细胞连接到表面上都是界面过程，这些性质与其在本体溶液 中的性质有很大的不同。 蛋白质或d n a 的检测以及疾病的快速诊断和治疗一直是生物和生物材料研究 中令人振奋的热点。生物膜是生物转换过程的核心，因为活体器官的交换都发生 在细胞膜上或渗透细胞膜。因此，蛋白质膜相互作用的知识能帮助我们设计生物 传感器，理解药物传送或疾病诊断的生物过程，并应用于医学材料 5 5 】。 当溶液中的蛋白质扩散到界面上，开始阶段表面上的蛋白质浓度很低，在大 多数情况下，吸附速率一般被认为是扩散控制。当蛋白质吸附到界面上后，蛋白 质的构型、取向和亲水性将发生改变，且蛋白质在界面上展开，这些变化都将影 响蛋白质的吸附。材料表面性质，如亲水性和疏水性，也会很大程度地影响蛋白 质吸附 5 6 】。很多化学修饰的界面包括甲基、硅烷醇、四胺 5 7 】、聚合物表面 5 8 】、 第一章绪论 自组装单分子层【5 9 】和一些固定功能表面已应用于该项研究。 不同的蛋白质有不同的物理和化学性质，如几何特征、电荷、p h 值和亲水性 等等，而蛋白质的这些性质与吸附相关。已有不同的蛋白质或其混合溶液应用于 吸附研究，如生长荷尔蒙 5 7 】、i g g 【5 8 】、溶解酵素【5 7 ，5 7 ，5 9 】、蛋白酶 5 0 ，5 6 ，5 8 ，6 0 】、 纤维蛋白原 5 6