（微生物学专业论文）生物表面活性剂提高石油采收率的研究.pdf

摘要 从本实验室保藏菌种中 分离到一株产芽抱细菌 x , ， 经鉴定为 地衣芽抱杆菌 ( b a c ill u s l i c h e n 如 r m is ) 。 通过 正 交实 验对 培 养条 件 进行了 优 化， 其 发 酵上 清 液 具有高表面活性。 取发酵上清液用 h c i 沉淀法可得到生物表面活性剂 ( b i a ) 粗品， 再经c h , c l : 抽提和酸沉纯 化得到浅 黄色固 体， 其c m c值 ( 临界 胶束浓 度 ) 为 3 0 .0m g/1。 该 产 物 进 行 聚 丙 烯 酞 胺 凝 胶 电 泳 ， 显 示 两 条 带 ;( ir 分 析 表 明 含有 肤键、内 酷键以 及脂 肪族侧链等官能团; 经 h c i - c 凡o h液水解、甲 醋化 后，g c - ms分析表明疏水基半分子含0 - 甲基十四碳脂肪酸及0 - 轻基十八碳脂 肪酸; 经6 n h c 1 水解后， p c分析表明 亲水基半分子含a s p , g l u , i l e , v a l , lys 等 “ 基 酸 ， h p l c 也 证 实 了 这 一 氨 基 酸 组 成 以 上 分 析 表 明 ， 该 产 萨种 由 脂肪酸和肤构成的脂肤类b i a 。 己 证明 它在n a c t 浓度为。 - - 1 5 % , 温度2 5 - - 1 2 0 、 p h 4 - 1 2 , 钙离 子 浓 度 。 - 0 .4 % 等条 件 下， 均 显示 较高的 表面 活 性。 这些 特 性与脂肤类 b i a特殊的双重结构有直接关系。同时也证实它对高粘油有增溶、 脱附、降粘作用 ( 降粘率最高可达5 0 %) ， 对高蜡油有乳化分散作用，并使硬度 下降。 b i a在微生物提高石油采收率 ( m e o r )上起着十分重要的作用。 关键 词: 地 衣芽 抱杆菌 ( b a c i l l u s l i c h e n 加r m is ) ， 脂 肤， 生 物表 面活性剂 ( b i a ) 微生物提高石油采收率 ( me o r ) ab s t r a c t f r o m t h e r e s e r v e d s t r a i n s o f t h e l a b , a s p o r e - f o r m e d b a c t e r i u m x 3 w a s s c r e e n e d wh i c h wa s i d e n t i f i e d a s b a c i l l u sl i c h e n 扣r m i s . f e r me n t a t i o n t h e b e s t c u l t i v a t i o n f a c t o r s h a v e b e e n f o u n d b y o r t h o g o n a l t e s t . t h e s u p e rna t a n t h a s h i g h s u r f a c e a c t i v i t y . b i o s u r f a c t a n t ( b i a ) c a n b e a c q u i r e d 衍 a c i d p r e c i p i t a t i o n . a y e l l o w i s h s o l i d c a n b e g o t b y e x t r a c t i n g w i t h c h 2 c l 2 a n d p u r i f i e d b y a c i d p r e c i p it a t i o n o n c e . t h e c mc o f t h e p r o d u c t i s a b o u t 3 0 .o m g 1 1 . t h e e l e c t r o p h o r e s i s o f b i a t wo b a n d s . th e i r a n a l y s i s s h o w s t h a t t h e p r o d u c t c o n t a i n s p e p t i d e b o n d , la c t o n e b o n d , a n d a l ip h a t i c c h a i n . a ft e r h c i - c h 3 0 h h y d r o ly s i s - m e t h a n o l y s i s , g c - ms i n d i c a t e s h y d r o p h o b i c p c a n a l y s i s m o i e t y c o n t a in s 0 - m e t h y l c , u f a t t y a c i d a n d 13 一d r o x y l c , 8 f a tt y t h a t a c i d . s h o w s t h a t h y d r o p h i l i c m o i e t y c o n t a i n s a s p , g l u , i l e , v a l a n d hp l c a l s o a ff i r ms t h ea c i d c o m p o s i t i o n . t h e u p p e r a n a l y s i s i n d i c a t e s l y s e t c . t h a t t h e p r o d u c t i s a l i p o p e p t i d e , w h i c h i s c o m p o s e d b y f a t t y a c i d a n d p e p t i d e . i t h a s b e e n a p p r o v e d t h a t u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s : n a c l c o n c e n t r a t i o n 0 - 1 5 %, t e m p e r a t u r e 2 5 - 1 2 0 c , p h 4 - 1 2 , c a c o n c e n t r a t i o n 0 - 0 . 4 % , t h e b i a s h o w s h i g h s u r f a c e a c t i v i t y . a l l th e s e s p e c i f i c p r o p e r t i e s h a v e d i r e c t r e l a t i o n w i t h t h e d o u b l e s t r u c t u r e o f t h e l i p o p e p t i d e b i a . a t t h e s a m e t i m e , i t h as b e e n p r o v e d t h a t b i a h a s t h e a b i l i t y t o i n c r e a s e t h e s o l u b i l i t y o f t h e o i l , a n d t h e a b i l i t y t o h e lp t h e o i l b r e a k o f f t h e r o c k a s w e l l as t h e a b i l i t y t o d e c r e a s e t h e v i s c o s it y o f t h e o i l ( t h e r a t e o f v i s c o s i t y d e c r e as e c a n b e a s h i g h as 5 0 % ) . b i a a l s o c a n e m u l s i f y a n d d i s p e r s e t h e o i l w it h h i g h w a x a n d d e c r e as e t h e h a r d n e s s o f i t . s o w e c a n m a k e a c o n c l u s i o n t h a t b i a i s v e r y b e n e f i c i a l t o me o r . k e y w o r d s : b a c i l l u s l i c h e n if o r m i s , l i p o p e p t i d e , b i o s u r f a c t a n t , me o r 生物表面活性剂提高石油采收率的研究 前言 表面活性剂是一种具有表面活性的物质，它可以改变气一 液、液一 液以 及固 一 液界 面的 特征， 使 界 面张 力 降 低 。 生 物表 面 活性 剂 ( b i o l o g ic a l i n t e r f a c i a l a g e n t , b i a )是微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的具有表面活性的 代谢产物，它是集亲水基和僧水基于一身的两亲化合物。非极性憎水基是一长链 脂肪酸或是一个a一 烷基，p一 轻基脂肪酸;亲水基可以是糖、磷酸、氨基酸、 环肚或醇等构成。 许多微生物具有产生表面活性剂的能力， 可通过培养基表面张 力的下降观察并判定。表面活性剂的效能是通过其浓度对表面张力的影响显示出 来的。c mc( 临界胶束浓度)是测定表面活性剂效率最常用的数值。一般说来， 当表面活性剂浓度超过 c mc值时，表面张力就不会再明显下降。据推测，此时 增加的 多余表面活 性剂分子 会聚 集成“ 泡相”( b u l k p h a s e ) ， 而不再进一 步改 变 界面张力。目 前己知分离并鉴定的几种不同类型的b i a包括: 糖脂、 脂肤、 磷脂 和中性脂等。 .b i a的特点及应用 b i a 具有如下性能:它能明显降低表面张力 ( 特别是油水界面相间张力)， 形成胶束溶液，使烃类乳化、改变岩石表面的憎水性。水驱后的油藏，因为油同 岩石间的毛细管作用，使原油残留于岩石孔隙中， 表面活性剂通过降低表面张力 和界面张力而减弱毛细管作用力，使被束缚的原油通过进一步的水驱被开采出 来，这是微生物提高石油采收率 ( me o r )的重要机理之一。b i a用于三次采油 的优点是:易溶于水， 在油水界面上具有良 好的表面活性;易于润湿含油岩石的 表面，洗掉岩石表面及孔隙中的残油;对原油具有较强的乳化分散能力，被储层 固体表面吸附数量少。b i a之所以具有很强的驱油能力正是因这些特点造成的。 据 专 家 预 测， b i a 成本 只 是 化 学合 成 表面 活 性 剂( c h e m i c a l in t e r f a c i a l a g e n t , c i a ) 成本的3 0 %，从环保角度看， 前者较后者易为生物所降 解d 1 ，降 低污染负荷，并 且 微 生 物 表 面 活 性 剂 对极 端的 温 度、 p h , 盐 浓 度 12 .3 1等 不 太 敏 感。 此 外， 从 经济 上考虑，用廉价可再生底物为原料生产表面活性剂较之用日 渐减少的烃资源生产 有着更广阔的前景。因此，近年来对b i a的兴趣日 见增长。 特别是在m e o r方 面， b i a可以有效地降低油一 水表面张力和界面张力， 有助于油一 水乳化，防止 油滴凝聚， 提高高粘、 高蜡油的 采收率。 例如， 用多聚体 b i a e m u l s a n 14 1 处理 v e n e z u e l a n 的重质原油， 粘度由2 0 0 0 降 至1 0 0 m p a - s 。 处理后， 使经化学处理无 效的油可以 输送2 6 k m . 有些油田从传统采收法的角度看己经被认为是枯竭了，但当用b i a与其它技 术配合使用时， 便可使这类油田 获得增采， 这是非常有意义的。 但是， b i a在大 规模应用上，也存在着某些问题: 有些b i a的提取和纯化存在某些难点， 有可能 使价格升高，限制了其应用范围.比如放线菌纲细菌的b i a产物， 其活性受细胞 壁束缚， 而其它细菌的b i a主要分泌于胞外， 这些因素直接影响到产物的回收及 回收成本。基于上述问题，可采用以下方式解决: ( 1 ) . 在工厂利 用发酵罐 在需 氧条件下大量生产b i a ，由 注水 井或油井注入油藏。 既可以利用经过分离提纯的胞外和胞内b i a ， 也可直接利用含有胞外b i a的 发酵液. ( 2 ) . 将产生b i a的高产菌株 ( 兼性厌氧菌) 和营养直接注入油藏， 通过其生长代 谢生成大量b i a。为此必须保证该种微生物在油藏中的发育条件。 二. b i a的类型及产生菌 一般说来，c i a是按照其极性基团分类的。而b i a则不同，它按照化学构成 及其来源分类。 b i a主 要 类型 有: 糖 脂 15 1 、 脂 肤和 脂蛋白 16 . i磷 脂 和脂 肪 酸18 .9 1 、 多 聚 体 1 10 1等。 常见的糖脂及其产生菌 ( 1 ) 鼠 李糖脂: j a r v i s j o h n s o n ( 1 9 4 9 ) 最先发现r a e r u g i n o s a 可产生鼠 李 糖脂。 它 可将正十六烷同水的界面张力由 4 0降低到 1 m n / m ，水的表面张力降低到 2 5 -3 0 m n / m o i t o h 和s u z u k i ( 1 9 7 2 ) 分离到p . a e r u g in o s a 的两个突变株p u - 1 和 p u - 2 ， 它们无法在含烷烃的培养基上很好生长， 在补加鼠李糖脂的培养基 上恢复正常 ( 2 )海藻糖脂: 来自r . e r y t h r o p o l is 和a r t h r o b a c t e r s p . ， 可将培养基表面张力、 界 面张力降 低至2 5 -4 0 , 1 -5 m n / m o ( 3 )槐糖脂: 主 要由 酵母菌t o r u l o p s is b o m b i c o l a , t .p e t r o p h i l u m和t a p i c o l a 产生 它可将正十六烷同 水的界面张力由4 0 降至5 m n / m ， 并对p h及温度的 变化 有显著的稳定性。 有 趣的是t p e t r o p h i l u m在含烷 烃或植物油 等非 水溶性介 质培养 基上可 产生槐 糖脂，同 t b o m b i c o t a产生的槐糖脂在化学结构上相同， 可是没有乳化效果。当 t .p e t r o p h i l u 。在含葡萄糖一 酵母提取物的 培养基上生长时却可以 产生一种有效的 含蛋白的烷烃乳化剂，这似乎同微生物产乳化剂和表面活性剂是为了摄取非水溶 性物质的传统观点相矛盾。 脂 肚 和 脂 蛋白 : 由b .s u b t il is 产 生 的 环 脂 肤 11 1 是 最 有 效 的b i a 之 一， 在5 0 p p m 这 样 的 极 低 浓 度 下， 可 将 表 面 张 力由7 2 降 至2 7 .9 m n / m e b .i ic h e n if o r m is 2 1产 生 几种对温度、 p h , 盐浓度有较强稳定性的表面活性剂。 在以 下内容中， 将作详细 介绍。 脂肪酸、磷脂、中 性脂: 几种细菌和酵母菌可在正烷烃培养基上生长并产生 脂肪酸和磷脂型表面活性剂。 多 聚 体: 研 究 最 透 彻的 多 聚 体b i a是e m u l s a n 11 3 1 , l ip o s a n 、 甘露 糖 蛋白 114 1 以 及其它多聚糖蛋白。 e m u ls a n 在1 0 - 1 0 0 p p m的 低 浓 度下， 仍 具 有 很强 的 乳 化能 力， 它是 迄 今为 止 最佳的乳化稳定剂。 n a v o n v e n e z i a等人( 1 9 9 5 ) 分离到一产阴离子型含亮氨酸的杂 多 糖 蛋白b i a ( a l a s a n ) 的 菌 株a c in e to b a c te r r e d i o r e s is t e n s k a - 5 3 。 并 发 现a la s a n 1 15 1 在中性或碱性条件下加热到1 0 0 *c ，活性提高2 .5 - 3 倍。 三. b i a的研究历史及现状 早在4 0 年代z o b e 1 1 11 s ,1 7 1 就提出， 微生物产生表面活性剂是m e o r的重要机 制 之 一 。 随 后， 捷 克d o s ta le k 和s p u m y 11 8 1根 据 实 验室 结 果 ， 把。 e s u lf o v i b r io 和 p s e u d o m o n a s同糖蜜一起注到油层中， 观察到原油产量提高，他们认为，这可能 是因细菌产生的表面活性物质，改变了岩石 一 油一 水系统的界面张力所致。但上 述作者均未提取出微生物产生的表面活性物质。 6 0 年代以后，石油发酵工业开始发展，微生物对烃类乳化机制的研究引起关 注，并提取到几种 b i a,就其结构、化学性质、生物合成及调控方面进行了广泛 研究. 近年来， 大量的b i a方面的研究集中在发展快速、 有效地筛选高产菌株并 评估其潜力等方面， v a n d e r v e g t ( 1 9 9 1 ) 进行的 轴对称液滴分析 ( a d s a ) 非 常 有效。其它比 较简单的 方法: ( 1 ) 快速液滴破裂实验: ( 2 ) 对 b i a产生菌落直接 进 行薄 层层 析 i 9 1 ; ( 3 ) 用比 色 法 优 选 解 烃菌 及 产鼠 李 糖脂 菌。 用微生物生产b i a是7 0 年代后期生物工程领域中发展起来的一个新课题。 加 拿大、英国、德国、前苏联等先后进行了研究与开发，多数处于室内研究阶段， 主要研究各种新型b i a ，并搜索最适发酵条件、b i a的结构剖析和改性、物化性 能测试、室内 驱油物理模拟等。 j .e .z a j i 。 实验室开 展的工作较多，几个产品己 商 品化。 m .e . s i n e r 实验室用h - 1 3 细菌，以正 烷烃为唯一碳源时， 产生一种胞内 和 胞外糖脂化合物b i a ，它能将重油粘度降低 9 5 %以上，并形成稳定的水包油乳状 液。 中科院上海有机化学所是国内首先研究b i a的单位。 从1 9 8 6 年开始， 经微生 物菌种筛选和条件优化， 已 推出的糖脂型化合物有: 槐糖脂， 海藻糖脂和多糖脂。 中科院感光所测定了由 有机所提供的六种搪脂样品的界面性质，优选了三种耐盐 3 % -5 % 、耐温4 0 -8 0 的 糖脂， 用多 糖与槐糖脂或鼠 李糖脂复配时呈现 “ 超加 合”现象，可将界面张力降得更低。 1 9 6 8 年a r im a 等i i i 首次 发现枯草芽 胞杆菌( b a c i l l u s s u b t i l is ) i f 0 3 0 3 9 产生的 脂肪多肤类b i a ， 呈晶体状， 商品名为表面活性素 ( s u r f a c t i n ) ， 最初被分离并鉴 定为纤维蛋白凝集抑制剂，后来发现它能够溶解红细胞及某些细菌的原生质体， 可显著降 低水的表面张力 ( 从 7 2 m n / m降到了2 7 m n / m )， c m c值达到 1 .2 8 x 1 0 s m o l / l ， 是迄今己 报道的 最强的b i a之一， 具有广 泛的 应用前景， 如 油类回收 及感光乳剂的稳定等。s u r f a c t i n 是由一个含7 个a 氨基酸的多肤及一个同源系列 ( 带有1 3 . 1 4 或1 5 个碳原子) 的轻基脂肪酸构成的 大内 脂环. 此后， 又相继发 现 几 种 氨 基 酸 酷 有 明 显 的 表 面 活 性 。 b . b r e v is l2 0 i和b .p o ly m y x a h 1产 生 的 十 肤 及 脂 肤 抗生素、 p .r u b e s c e n s 和t h i o b a c i l l u s 产生的鸟氨基酸醋， g l u c o n o b a c t e r c e r i n u s 生 成的 含鸟氨酸和牛磺酸的酷 ( c e r i l ip in ) 12 1 1 以 及a g r o b a c t e r i u m t u m ef a c i e n s i f 0 3 0 8 5 1 生成的 赖氨酸酷 等均是 很有效的b i a 和地衣芽抱杆菌产生的环脂肤有着更强的效力， 。同以上氨基酸脂相比较，枯草 这类物质对极端的温度， 浓度显示出良 好的稳定性。可以 溶解哺乳动物的血红细胞，利用该特性， 血平板检测出表面活性剂。 p h,盐 可借助 近 年来， 随 着 测 试 技 术的 不断 提高， 新的b i a 相继 被发 现。 m i c h a l m .12 3 1等， 在1 9 9 5 年发现一株名为地衣芽抱杆菌b a s 5 0 的菌， 该菌存活于地下一千五百米， 耐盐、 耐热， 可产生一种名为地衣菌素的b i a ， 这是一种分子量在1 0 0 6 至1 0 3 4 d a 的环脂肤，脂基部分含有十四种线形或分枝的p轻基脂肪酸，含碳数目为 c 1 2 - c 1 肤基部分为5 种共7 个氨基酸构成的肤环。该脂肤可以将表面张力由 7 2 m n / m降 至2 8 m n / m , c m c 值低达1 2 m g / l . 由 于 脂肤类b i a具有高 效的 表面活 性，国外学者给予了极大的关注。 目 前，国内 有关的 研究多 集中 于糖脂类12 4 ,2 5 1 ， 另有文献报道， 王修垣、田 新 玉等12 6 1 发现一种新的b i a ，因未发现脂肪酸成分，故认为属多肤类。 四.月 旨 肚类物质生物合成的 遗传机制 在研究 s u r f a c t i n生物合成过程及酶结构的同时，人们也同时进行控制其生物 合成的遗传机制研究。迄今为止的实验表明， 调控s u r f a c t i n 的合成至少有两个遗 传位点， 它们分别为s f p 和s r f a o s 印基因 编码了一种产生s u r f a c t i n 的关键蛋白 质。 s r f a 2 1 1 是枯草芽抱杆菌中 产生s u r f a c t i n 、 感受态发育及高效抱子形成的一个操纵 子。 c o s m in a 2 8 1进 一步 发 现了 枯草 芽 抱 杆菌中 含有 完 整 操 纵子、 s f p 以 及 两者 之间 的 4 0 0 0个碱基对的染色体区段，并进行了全序列分析和功能描绘。以上研究有 利于人们掌握及创造有利s u r f a c t i n 最大作用的条件，因此对其应用有着重要的理 论意义。 材料和方法 .材料 1 ， 菌 种: x 3 地 衣芽 抱 杆 菌 ( b . l ic h e n if o r m is ) 。 由 本室 保藏 菌 种选出。 2原油: 高胶油 1 2 6 5 - 1含胶质沥青 2 5 %) ， 高蜡油 中8 - 7 2 ( 含石蜡 2 5 %) 来自 大港油田。 3 .培养基 菌种斜面培养基: n a c l 0 .5 % ， 蛋白 膝 0 .2 % ， 酵母粉 0 .2 %，牛肉膏 0 .4 %， 琼脂粉 1 .2 %, p h 7 .5 e 血平板培养基14 5 1 : 牛肉 膏 0 .3 % , n a c l 0 . 5 % ，蛋白 陈 1 .0 % ，血细 胞 悬液 ( v / v ) 5 - 1 0 % , 琼 脂 粉 1 .2 % , p h 6 .5 . 摇瓶 种子 培 养 基: 蔗 糖2 % , n h 4 c 1 0 .6 % , m g s 0 4 0 .0 2 % , c a c 1 2 7 .0 x 1 0 6 m, k h z p 0 4 0 .4 1 % , n a 2 h p 0 4 1 .4 % , n a 2 e d t a 4 .0 x 1 0 6 m , 酵母粉 0 .0 5 % , p h 7 .5 . 基 础 发 酵 培 养 基 12 3 1 : 淀 粉 2 % , n h 4 c 1 0 .6 % , m g s o 4 0 .0 2 % , c a c 12 7 .0 x 1 0 6 m , k h 2 p o 4 0 .4 1 % , n a 2 b p 0 4 1 .4 % , n a 2 e d t a 4 .0 x 1 0 -6 m , 酵母粉 0 . 0 5 %, p h 7 . 5 . 4 .主要实验仪器、设备: 界面张力仪承德市材料实验机厂 n d j - 7 9 型旋转式粘度计同济大学机电厂 s h i m a d z u g c - 7 a型气相层析仪日 本岛津 s h i m a d z u c - r i b 型数据处理仪日 本岛津 旋转薄膜蒸发器 ( z f q - 1 0 l )天津玻璃仪器厂 7 2 1 分光光度计上海第三分析仪器厂 d y y - 1 1 1 2 8 a型垂直板电泳槽北京六一仪器厂 水浴振荡器常州国华电器有限公司 n i c o l e t傅立叶变换红外分光光度计1 7 0 s x f t l r 微量注射器( 1 11 1)上海医 用激光 仪器厂 高速离心机美国b e c k m a n j 2 - m c 真空冷冻干燥器美国l a b c o n c o 光学显微镜日 本o l y m p u s 笔式酸度计葡萄牙 h a n n a公司 高 效液相色谱仪 ( 4 2 1 c o n t r o l l e r美国b e c k m a n 1 6 0 a b s o r b a n c e d e t e c t o r , m o d e l 1 0 a p u m p a 七 ) s s i 柱幅温箱 a n a s t a r色谱工作站 气质谱联用仪 g c - m s 5 .主要试剂 i ) 菲林 试剂12 9 ,3 0 ) : 菲林试剂甲:4 % c u s o 4 溶液 菲林试剂乙: 2 0 % 酒石酸钾钠、1 5 % n a o h 用前取等体积甲、乙液混合 0 . 1 % 葡萄糖标准液 2 ) 脂肤脂肪酸部分的甲 醋化12 3 ,3 4 1 , 5 % h c i - c h 3 0 h溶液 b f 3 - c h 3 0 h( 1 :2 ， 重量比) 乙醚 3 ) 肤的 水 解 13 11 : 6 n h c l 4 ) 氨基酸的纸层析 ( p c ) 展开系统及显色剂13 2 ) , p c展开系统: 正丁醇: 乙 酸: 水 = 4 : 1 : 1 ( v l v ) 显色剂:0 .5 %m三酮乙醇溶液 5 ) 血红细胞 悬液13 3 1 6 ) t r p 检测 试 剂: d a b 试剂 13 0 1 一 对二甲 基 氨基 苯甲 醛 ( d a b ) 溶 液: 6 0 0 m g d a b溶于1 8 0 m l 2 1 a n h 2 s o ; 中， 溶液终 浓度达1 5 m g 1 4 . 5 m l 0 . 0 4 % n a n0 2 1 0 0 微克 / 毫升的 色氨酸标准液 7 ) t r i s 、 甘氨酸、 s d s 等天象人生物公司 8 ) c h 2 c 1 2 、正十六烷等均为国 产a .r .试剂 二，方法 1 . b i a高产菌株的 筛选 从血平板上根据溶血圈大小对 1 4 6 株菌进行初筛，选有溶血圈较大的菌。将 选出的菌分别接种液蜡、 含糖培养基， 分别培养3 6 h r , 2 4 h r 后， 离心取上清， 测 表面张力( y s ) ，选出y s 最低的菌株. 2 . 培养基的 优化 通过红血细胞 破裂法13 3 1 ， 由 单因 子实验选出 最 佳组合: 取发酵液0 .5 m l ， 加入 经处理以等渗盐水悬浮的血细胞4 . 5 m l , 3 7 0c 2 0 m i n , 2 5 0 0 r / m i n 离心2 0 m i n ，上 清于o d 5 4 0 n m 测吸光度。 以产物千重法为主要判定因素， 取四因素三水平进行正交实验13 5 1 ，经验证后 确定优化培养基组成。正交实验的表头设计如下: 表头设计 列号 a b i a xb! c! a xcd i a xd 1 2 1 3 1 4 5 1 6 i 71 8 1 9 1 0 1 1 1 1 1 2 1 3 3 . 菌体生长、 产物量、残糖量曲 线， p h变化、 表面张力变化曲 线 在发酵过程中，定时取样测定; 用稀释平板法测菌浓，绘出菌体生长曲线; 取发酵液上清加h c i 沉淀， 将沉淀千燥至恒重， 精确称得粗产物量; 取发酵液l m l ， 加水4 m l , 6 n h c 1 5 m l 于l 0 0 m l 锥形瓶， 沸水浴1 5 m i n ， 取出， 加 l o m l 3 n n a o h并放冷至室温， 用菲林试剂测定发酵液中的残糖量; 取发酵 液上清，用界面张力仪测定发酵过程中丫 s 的变化。 4 . 菌种鉴定13 6 1 14 2 1 依据伯杰氏 手册 ( 第八版)， 就x 3 各项特性进行实验， 确定其分类地位。 形 态特征:菌落形态、菌体大小、产芽抱情况、运动性;各项生理生化反应:培养 基的p h范围、 最高生长温度、 淀粉水解、 n a c l 的耐受浓度、 v .p .及m.r反应、 硝酸盐还原、糖发酵、好气性、柠檬酸盐利用。 5 提取 和纯 化13 7 1 ( i ) 粗产物提取: 取3 7 0c , 4 0 h r 培养物， 8 0 0 0 r / m i n 离心2 0 m i n 除菌体两次，上 清液用浓h c l 调p h 2 ，出 现絮状沉淀， 4 0c 静置过夜，1 0 0 0 0 r / m in离心3 0 收 集沉淀， 用p h 2 的酸溶液洗涤一次。 将沉淀溶于n a o h溶液，使终p h = 7 , 冷冻干燥。 ( 2 ) 分析样品的 制备: c h 2 c 1 2 抽提冻干的 样品， 搅拌l h r ， 不溶物 用双层滤纸过滤 除去， 抽提液于3 7 0c - 4 0 减压蒸干， 得灰白色粉状物， 加适量n a o h溶液溶 解至中 性， w h a t m a n n o .4 滤纸过滤， 滤 液加浓h c l 调至p h 2 ， 出 现沉淀， 离 心1 5 ,0 0 0 r / m i n 3 0 m i n ，收集沉淀并干燥，即得分析样品。 6 . 产物性质的鉴定 ( 1 ) 产物的 聚丙烯酞胺凝胶电 泳: 用聚丙烯酞胺凝胶垂直板电 泳法 分离脂肤13 8 1 ， 方法如下: a .凝胶的配制:本实验采用7 . 5 % 分离胶，2 . 5 % 浓缩胶。 b .样品预处理与加样: a . 样品 预染: 取1 8 0 11 1 样品， 加入饱和乙 酞苏丹黑13 0 1 溶液2 0 u 1 , 置3 7 水浴 3 0 m i n ，冷至室温，3 0 0 0 r / m i n ,离心 l 0 m i n ，除去沉淀。 b . 加样:取预染乙酞苏丹黑样品3 0 1 1 1 ，加等体积4 0 %蔗糖溶液混合后，取 4 0 i1 1 加至样品槽中。 c缓 冲 液为t r i s - g ly 电 泳 缓 冲 液( 表1 ) ， 详 见文 献 13 8 1 表1 .凝胶溶液的配制 t a b l e 1 c o m o o u n d i n e o f g e l s o l u t i o n 试剂名称 用量/ n u 2 0 m l 分离胶 终浓度 ( 7 . 5 %) p h 8 . 9 t r i s - h c i 缓冲液 ( t e me d) 3 0 % a c r - 0 . 8 / o b i s 贮液 重蒸水5 .02 .5 充分混匀后，置真空干燥器中，抽气 1 0 分钟 分离胶 0 . 1 4 %过硫酸钱 ph6.7 tris-hci 94纷m1 win(temed)10%acr-0.8%bis v940% m 1 0 . 0 终浓度 1 . 0 ( 2 . 5 %) 分钟 20-4.0一10 充分混匀后，置真空干燥器中，抽气 浓缩胶 0 .0 0 4 % 核黄素 7 .色谱分析 ( 1 ) 产物红外吸收特征的 测定: 经提纯产物适量， k b : 压片法测i r吸收图 谱。 ( 2 ) 气质谱联用检测脂肪酸:进样测定前，首先将样品水解并甲酷化。取样品 2 0 m g ， 加5 % h c 1 - c h 3 0 h溶液约2 m 1 , 9 0 0c 密 封水 解1 5 h r ， 过滤， 将滤液中 的h c i - c h 3 0 h液挥干，乙 醚反复抽提， 加过量的b f 3 甲醇溶液， 置蒸馏设备 中回流 5 m i n 。 冷却后， 用乙 醚提取回流液三次，合并，水洗至p h近中性。 干燥后进样测定。 ( 3 ) h p l c测定氨基酸: 产物5 m g ， 加6 n h c 1 2 m l , 1 1 0 0c 密封水解2 4 h r 。 将水解 液过滤，收集至圆底烧瓶中，减压蒸发至干。蒸干物加 l m l 无离子水，使之 溶解， 抽真空至干， 重复2 次， 于4 冰箱保存， 上机分析前，以2 , 4 一 二硝 基氟苯对氨基酸样品进行衍生。 h p l c色谱条件:用o d s 柱为分离柱，流动相a为乙睛一 水溶液 ( 1 : 1 ); b为0 .0 5 m醋酸钠一 醋酸: 缓冲液:1 % d m f ; 检测波长:3 6 0 r n n ; 流速: i m l l m i n ;柱温: 3 2 c ;标准品:1 8 种氨基酸 ( 天津氨基 酸公司 ) ( 4 ) 纸 层析: 水 解液 5 u 1 点 样， 新 华 1 # 滤纸 上 展开， 展开 剂为 正丁 醇: 乙 酸:水 = 4 : 1 : 1 ， 展开时间:1 2 h r ， 展层结束后将滤纸风干，喷 ( 0 . 5 %) 荀三酮一 乙醇溶 液，吹干，置9 0 0c 烘箱显色1 0 分钟，照相。 ( 5 ) 产 物 中场 的 定 量 测 定 : 绘 制场 标 准 曲 线 13 0 1 。 将 产 物 配 成0 . 1 % 的 溶 液 ， 取 该溶液0 . 2 5 m l ， 加水0 . 2 5 m l , d a b溶液4 .5 m l 蔽光放置1 . 5 h r ， 加n a n 0 2 0 .0 5 m l 摇匀， 放置3 0 m i n ,测6 0 0 n m处光密度值。 8 . b i a的特征分析 ( 劝表面活性剂产量:以 酸沉产物干重表示留1 ) . ( 2 ) c m c 值的 测定 14 0 : 将 纯 化 产 物溶 于乙 醚， 加一 定 量的0 . 1 m o l/ 1 n a h c 0 3 后， 除去乙醚，测2 , 5 , 1 0 , 2 5 , 5 0 , 1 0 0 倍稀释后的表面张力 ( y s )。 ( 3 ) b i a的稳定性测定: 将发酵上清液分别于下列温度: 5 0 c , 6 0 0c , 7 0 0c , 8 0 、 9 0 0c , 1 0 0 0c , 1 2 0 处理1 - 2 h r 后，降至室温，测定温度对y 、 的影响; 分 别 取p h 2 - 1 2 的b i a液， 逐 一 测 定 其y ， ， 检 验p h 对 b i a的 影 响; 发 酵液上清加入n a c l 使终浓度为1 %, 4 %, 7 %, 1 0 %, 1 2 % , 1 5 %，分别测定 其丫 5 ，检验矿化度对b i a的影响; 发酵液上清中加入钙离子，使浓度分别 为4 .0 , 4 0 , 4 0 0 , 4 0 0 0 m g /l , 测 定 其y s ， 检 验c a z + 对b i a的 影响。 ( 4 ) b i a乳 化活 性 14 1 1 的 测定: 待测样: 0 . 0 2 m t r i s . c l ( p h 8 .0 ) 2 m l ， 样品2 m l ，十六烷i m l 空白 : 0 .0 2 m t r i s .c l ( p h 8 .0 ) 2 m l ， 水2 m l , + 六 烷i m l 置于纳氏管中，2 0 0 次/ m i n 振摇2 m i n ,静置3 0 m i n 后，吸取 下层液体于o i ) 5 4 0 n m 测定。 9 . b i a对原油的作用 ( 1 ) 对高粘油( 1 2 6 5 - 1 ) 的 作用:取不同浓度， p h 7 .0的 样品溶液 ( 0 .0 1 %, 0 .0 3 % , 0 . 0 6 % , 0 .0 9 % , 0 . 1 2 %, 0 . 1 5 % ) 5 0 m l ，加入原油5 0 m l ，分别于5 0 0c , 7 0 0c , 1 0 0 下振荡1 , 2 , 3 天，7 0 脱水两天，于5 0 0c 测油粘度。 ( 2 ) 对混合油( 6 9 - 8 ， 胶、 蜡含量均约为2 5 %) 的作用: 发酵液5 0 m l , 6 9 - 8油5 0 m 1 , 分别于5 0 0c , 7 0 振荡1 , 2 , 3 天，脱水2 天后，测定凝固点并于5 0 0c 测油 粘度。 ( 3 ) 对高 蜡油( 中8 - 7 2 ) 的 作 用: 取 发 酵液5 0 m 1 ， 中8 - 7 2 油5 0 m l ， 于5 0 0c , 7 0 振荡1 , 2 , 3 天，脱水两天测定原油凝固点. ( 4 ) 对固 体石蜡的 作 用: 取b i a样品0 .2 g ，固 蜡2 g ， 水1 0 0 m l , 5 0 水 浴振荡两 天，对照除不加 察其形貌，照相 b ia外，处理相同.将作用后的固蜡干燥后，于低倍镜下观 结果与讨论 一菌种筛选 1 ，初筛 首先利用血平板法对本实验室分离并保存的1 4 6 株菌进行筛选， 将菌液点接于 平板上，培养2 4 h r 后， 观察溶血圈的大小。结果大部分菌株产生了 溶血圈， 选出溶血圈较大的1 8 株菌 ( 表 2 )。 2 .复筛 分别以液蜡培养基和葡萄糖培养基培养初筛菌种，测定其发酵液的表面张力 y 5 ( m n / m )，见表2 0 表2菌株复筛 t a b l e 2 s e c o n d s c re e n i n g t e s t f o r t h e b e s t b a c t e r i u m 菌株液蜡培养基 葡萄糖培养基菌株液蜡培养基 葡萄糖培养基 空白8 5 . 07 3 . 1空白8 5 . 07 3 . 1 5 8 - 5 2 ( z ) 6 6 . 46 0 . 30 1 - 16 8 . 0 6 3 . 4 4 5 - 2 3 4 - 26 2 . 85 7 . 7 2 3 ( ) 6 4 . 05 6 . 0 苏7 - 1 56 3 . 75 4 . 8 2 3 ( 2 ) 5 9 . 36 7 . 0 1 0 36 7 . 86 5 . 2 苏7 - 1 5 ( 2 ) 6 5 . 05 3 之 g g 3 6 1 . 86 3 . 5 x 3 4 0 . 73 5 . 5 z 1 7 6 3 . 06 2 . 2 z h i o 6 8 . 16 3 . 0 8 0 / l5 7 . 06 9 . 52 37 0 . 55 8 . 5 z 1 6 - i ( 2 ) 6 2 . 55 3 . 5 7 ( 5 ) 6 8 36 6 . 5 4 5 - 2 3 4 ( 2 ) 6 7 . 06 5 . 8m6 1 . 05 9 . 6 注: 表内数字为测得的表面张力值 ( m n / m )。 结果表明， 菌株x 3 在葡萄糖培养基中表现出 极低的表面张力。 可将表面张力 值降低约5 1 %0 为筛选出高产b i a的菌株， 测表面张力的变化是最直观而有效的， 但工作量 相对较大。 b i a降 低表面张力可以间 接的通过血红细胞破裂表现出 来， 故血平板 筛选被确立为初筛方法， 但因为有些细菌亦可能产生非b i a的溶血素， 复筛时仍 应辅以表面张力的测定， 优选出将表面张力降至最低的菌株。 二，培养基组成的 优化 1 单因子实验 最佳碳、氮源、 p h以 及生长因子的选择，以 溶血实验为选择方式，测 o d 5 4 。 的光吸收:结果见表 3 . 4 0 表 3 单因子实验 碳源氮源 生r仔 (醉 母 粉) 无生长因子 葡萄糖 n h 4 n0 3 0 . 5 00 . 3 1 nh 4 c i 0 . 5 00 . 3 8 仆旧4 ) 2 5 0 4 0 . 4 60 . 4 2 n a n 0 3 0 . 1 50 . 0 0 7 蔗 糖 n h 4 n 0 3 0 .4 50 . 3 3 n h 4 c l 0 . 5 10 . 4 5 ( n h 4 ) 2 s o 4 0 . 5 00 . 4 8 na n 0 3 0 . 0 70 . 0 2 淀粉 nh 4 n 0 3 0 . 5 10 . 4 5 n h 4 c l 0 . 6 40 . 5 2 困h 4 ) 2 s o 4 0 . 5 70 . 5 3 na n 0 3 0 . 1 90 . 0 7 6 表4 p h对产量的影响 th e i n flu e n c e o f n h t o t h e ou p h值 ta b l e 4 5 . 5 产物o d