（微生物学专业论文）产表面活性剂采油菌株发酵条件的优化.pdf

中文摘要 中文摘要 微生物三次采油( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y , m e o r ) 技术是通过微生 物代谢产物的作用来提高原油采收率的项综合性技术。其中，生物表面活性剂 以其卓越的驱油效率、低毒、无污染、可生物降解、廉价等特点，展现了良好的 应用前景，引起了人们的广泛关注。因此，筛选高效生物表面活性剂产生菌、并 对其发酵条件进行优化、以提高生物表面活性剂的产量，对于微生物三次采油的 应用研究具有重要意义。 本论文从生物表面活性剂产生菌的筛选、菌种鉴定、发酵条件优化几方面进 行了研究，主要研究结果如下： 1 采用血平板初筛、排油圈复筛的方法，筛选出一株产生物表面活性剂性能最 强的采油菌d n 4 3 ，经薄层层析( t l c ) 分析确定该菌株所产表面活性剂为脂肽类 生物表面活性剂。 2 对筛选得到的d n 4 3 菌株进行系统鉴定，通过形态学观察、生理生化实验 和1 6 sr d n a 序列分析，表明该菌株与枯草芽孢杆菌有9 8 以上的相似性，鉴定该 菌株为枯草芽孢杆菌d n 4 3 。 3 在单因素影响实验的基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 设计和响应面分析法相 结合的方法，对该菌株的摇瓶发酵工艺进行优化，确定最佳发酵培养基配方和培 养条件为：葡萄糖2 7 8 3 9 m 、酵母浸粉2 7 3 9 l 、n a c l2 3 7 9 l 、k h 2 p 0 49 9 l 、k 2 h p 0 4 3 9 l 、c a c l 20 1 6 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l 、接种量为4 、种龄1 6 h 、装液量 2 5 0 m l 5 0 0 m l 、温度3 7 ( 2 、初始p 7 0 、摇床转速16 0 d m i n 、发酵7 2 h ，脂肽产量 达到最大值1 0 2 5 9 8 m g l ，比优化前菌株合成脂肽的产量提高了3 5 4 3 。 关键词：生物表面活性剂；微生物三次采油菌；发酵条件优化；脂肽 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i c r o b i a le n h a n c e do i l r e c o v e r y ( m e o r ) w i l l sac o m p r e h e n s i v et e c h n i q u e ， , 矿h i c hc o u l dr a i s eo i lr e c o v e r ye f f i c i e n c yb ym e t a b o l i t e so ft h em i c r o o r g a n i s m a so n e f i n do fm e o r , b i o s u r f a c t a n th a sd e m o n s t r a t e daf a v o u r a b l ea p p l i c a t i o np e r s p e c t i v ea n d t t t r a c t e dw i d e s p r e a da t t e n t i o n sb e c a u s eo fi t so u t s t a n d i n gc h a r a c t e r i s t i c s ：e x c e l l e n t t i s p l a e e m e n te f f i c i e n c y ，l o w e rt o x i c i t y ，n oc o n t a m i n a t i o n ，h i g h e rb i o d e g r a d a t i o n ，l o w e r t r i c e t h e r e f o r e ，t h e r eh a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c eo fe x p l o r a t o r yd e v e l o p m e n to ft h e v l e o rt os c r e e nt h eh i 曲p e r f o r m a n c ep r o d u c i n gs t r a i n , t oo p t i m i z ei t sf e r m e n t a t i o n r e n d i t i o n s ，a n dt or a i s et h ey i e l do ft h eb i o s u r f a c t a n t t h i sa r t i c l ed i dc o m p r e h e n s i v er e s e a r c h e si nf o l l o w i n ga s p e c t s ：s c r e e n i n gt h e p r o d u c i n gs t r a i no fb i o s u r f a c t a n t ，i d e n t i f y i n gt h es t r a 虹o p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o n ：, o n d i t i o n s t h em a i nr e s e a r c ha n de x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea l sf o l l o w s ： 1 m i c r o o r g a n i s ms t r a i nd n 4 - 3w h i c hc o u l ds y n t h e s i z eb i o s u r f a c t a n tw i t ht h e h i g h e s tp e r f o r m a n c eh a db e e ns c r e e n e di nt w os t e p s ：a s s a y i n gh e m o l y t i ca c t i v i t yo n b l o o da g a rp l a t e si nt h ef i r s ta n dt h e na s s a y i n go i ld i s p l a c e m e n ta c t i v i t yf r o mo i ls l u r r y t h er e s u l to ft l c a n a l y s i ss h o w e dt h a tb i o s u r f a c t a n tg e n e r a t e db yt h es t r a i nd n 4 - 3w a s l i p o p e p t i d e 2 t h es t r a i nd n 4 - 3w a si d e n t i f i e db yt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f c o l o n y , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i so f16 s rd n a t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ts t r a i nd n 4 - 3h a dm o r et h a n9 8 p e r c e n t h o m o g e n o u s 晰mb a c i l l u ss u b t i l i s ，t h e r e f o r e ，s t r a i nw a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s d n 4 3 3 b a s e do nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o na n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d 锻f o l l o w sb yp l a c k e t t b u r m a nd e s i g na n d r e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s ：g l u c o s e2 7 s 3 e g l 、y e a s te x t r a c tp o w e r2 7 3 9 l 、 i i a b s t r a c t n a c l 2 3 7 9 l 、k h 2 p 0 49 9 l 、k 2 h p 0 43 9 l 、c a c l 20 16 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l 、 i n o c u l a t i o na m o u n t4 、s e e da g e1 6 h 、m e d i u mv o l u m e2 5 0 m l 5 0 0 m l 、t e m p e r a t u r e 3 7 c ，i n i t i a lp h7 0 、r o t a t i o ns p e e d1 6 0 r m i n ，f e r m e n t a t i o np e r i o d7 2 h 。u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o s ，t h es t r a i nd n 4 - 3p r o d u c e d10 2 5 9 8 m g ll i p o p e p t i d ew h i c hi n c r e a s e d a b o u t3 5 4 3 t h a nb e f o r e k e yw o r d s ：b i o s u r f a c t a n t ；b a c t e r i ao ft h em e o r ；o p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ；l i p o p e p t i d e i i i 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉逛太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：荔，硗勉 签字日期：玉扣年二月厶日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉堑盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：易) 秘锰 导师龇每蓥 签字日期：石占年占月扣e l 签字日期：磊扫年占月p 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章绪论 i mm m 第1 章绪论 表面活性剂是类由非极性的亲油基团和极性的亲水基团组成，在溶液表面 能定向排列，即使在浓度很低的情况下也能显著降低表( 界) 面张力的化合物。 表面活性剂这种特殊的结构赋予了其既亲水又亲油，却又不整体亲水或亲油的特 性。素有“工业味精”美称的表面活性剂由于其品种多样、用途广泛，在各个工 业领域中具有非常特殊的重要地位【l 】。 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是产表面活性剂微生物在一定条件下培养， 在其代谢过程中分泌的集亲水基和疏水基于一体，具有一定表面活性的次级代谢 产物1 2 , 3 。 与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂分子的化学结构更为复杂和 庞大、单个分子占据更大的空间，因而具有较低的临界胶束浓度【4 】。除具有用量少、 反应产物均一，可引入化学方法难以合成的新基团的优点外f 5 】，生物表面活性剂还 具有以下优点：无毒或低毒；易于生物降解，对环境无污染【6 】；高效的乳化 活性、高起泡性、高选择性、更好的环境相容性【7 8 】；高效的表面活性和生理活 性【9 】，许多生物表面活性剂耐高温、高盐，能在广泛的p h 范围内保持活性7 , 1 0 ； 可利用工业废弃物进行生产，用于环境治理工程【1 1 1 ；不致敏，可消化，可用 作化妆品、食品和功能食品的添加剂。 由于这些优点和特性，生物表面活性剂已被广泛应用于食品工业、制药工业、 化妆品工业、石油工业等众多工业领域【1 2 , 1 3 】。尤其是在石油工业领域，生物表面 活性剂在提高原油采收率、生物降黏、重油污染土壤的生物修复等方面发挥了重 大的作用眩1 4 蚓。 近年来，随着人们环保意识的增强，现代生物技术的迅猛发展，生物表面活 性剂的开发和应用倍受重视，除在原有工业领域的应用越来越广泛，也逐渐向其 它领域渗透【1 7 1 ，我们有理由相信生物表面活性剂具有巨大的应用发展前景。 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 生物表面活性剂的种类及其微生物来源 多数生物表面活性剂由细菌、酵母菌、真菌( 霉菌) 等微生物产生。根据亲 水基的不同可将生物表面活性剂分为五类：糖脂类，如鼠李糖脂、槐糖脂； 酰基缩氨酸类，如脂肽、脂蛋白；磷脂类，如磷脂酰乙醇胺；脂肪酸类，如 甘油脂、脂肪酸；结合多糖、蛋白质及脂的聚合物，如脂多糖复合物【l 列。产生 物表面活性剂的微生物有地衣牙孢杆菌、假单胞菌和热带假丝酵母等。表1 1 列出 了一些常见的生物表面活性剂的种类及其微生物来源0 2 , 1 9 。 表i 1 生物表面活性剂的种类及其微生物来源 t a b 1 - 1t h et y p e so f b i o s u r f a c t a n t sa n di t sm i c r o o r g a n i s m so r i g i n 生物表面活性剂微生物来源举例 鼠李糖脂 海藻糖脂 槐糖脂 纤维二糖脂 脂肽 粘液菌素 短杆菌肽 多粘菌素 脂肪酸、磷脂 多聚表面活性剂 铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 红串红球菌( r h o d o c o c c u ae r y t h r o p o l i s ) 灰暗诺卡氏菌( n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s ) 球拟酵母( t o r u l o p s i s6 d 所6 泐，口) 茂物假丝酵母( c a n d i d ab i g a r i e n s i s ) 玉米黑粉菌( u s t i l a g oz e a e ) 地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 枯草芽孢杆菌( 最s u b t i l i s ) 荧光假单胞菌( p f l u o r e s c e n s ) 短牙孢杆菌( 盈6 聊括) 多粘芽孢杆菌( b p o l y m y x a ) 红串红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) 氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 热带假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 乙酸不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i u s ) 第1 章绪论 1 2 生物表面活性剂的生产方法 1 2 1 微生物发酵法 按利用不同的碳源，生产生物表面活性剂的菌种有三类：以烷烃为碳源的微 生物如棒状杆菌、以水溶性底物为碳源的微生物如杆菌、以烷烃和水溶性底物为 碳源的微生物如假单胞菌。根据不同的微生物和目标产物，具体可采用生长细胞 法、代谢控制细胞法、休止细胞法和加入前体法 2 0 1 。微生物发酵法工艺简单，成 本低廉，在技术和经济上都非常可行，具有良好的工业应用价值。 1 2 1 1 生长细胞法 生长细胞法中底物的消耗、细胞的生长、表面活性剂的生成都是同步进行的。 培养基的碳源很重要，不同的碳源对表面活性剂的产量和成分都有影响。其他一 些因素，如培养基中氮源种类、p h 值、温度、搅拌速度，以及氧气在气液界面的 传输速度等，也对表面活性剂的生成有一定的影响1 2 1 1 。 该法操作简便，由于底物的存在诱导体内产生大量的酶，从而提高了细胞的 转化活力。缺点是发酵过程易感染杂菌，此外该法还要求底物对细胞的生长不能 有抑制作用【2 l 】。 1 2 1 2 代谢控制细胞生长法 代谢控制法是通过限制一种或几种培养基成分以获得较高产量，通常是限制 培养基的氮源。 此外，也可以通过抑制培养基的碳源，或者是多价微量元素成分，如铁离子、 镁离子或钙离子等来提高产量【2 2 1 。 1 2 1 3 休止细胞法 休止细胞法是将正在培养的、处于生长期的细胞通过离心或过滤的方法从培 养液中分离出来，悬浮在缓冲液中保持其活性，再加入底物进行转化合成表面活 性剂的一种方法瞄l 。 这种方法的优点是细胞的生长和底物的生物转化是在不同条件下进行的，排 除了底物和产物对细胞生长可能存在的不利影响；反应体系较简单，副产物少， 1 黑龙江大学硕士学位论文 i 易分离纯化；并且分离出的菌体还可以继续使用1 2 1 1 。 1 2 1 4 加入前体法 加入前体法是向培养基中加入表面活性剂的前体，诱导微生物发酵产生表面 活性剂。 由于加入前体法可以通过改变碳源，生产出具有不同物理、化学性质的新型 生物表面活性剂，因此这种合成生物表面活性剂的方法越来越受到人们的重视【2 3 1 。 1 2 2 酶合成法 与微生物发酵法相比，通过酶法合成的生物表面活性剂多是一些结构相对简 单的分子，如单酰化甘油酯类、糖脂类、氨基酸类、磷脂类和烷基糖苷类生物表 面活性剂【2 4 1 。 酶合成法的生产条件相对粗放、反应具有专一性、可以获得高含量的目标产 物、产物易回收，且产品结构的修饰具有较大的灵活性，这使得酶催化法合成生 物表面活性剂同样具有很大的发展潜力圈。 1 3 生物表面活性剂提取和分析 1 3 1 生物表面活性剂的提取方法 生物表面活性剂提取方法的选择需视表面活性剂的性质而定，常用的主要方 法如下： 1 3 1 1 萃取 萃取因其操作简便，得到了广泛的应用。常用的萃取剂有氯仿甲醇( 体积比 2 ：1 或1 ：1 ) ，乙醇乙醚( 体积比3 ：1 ) ，二氯甲烷甲醇，丁醇，乙酸乙酯，戊烷，己 烷，乙酸，乙醚等。如分支杆菌( m y c o b a c t e r i u ms p p ) 和节杆菌属( a r t h r o b a c t e r p a r a f f i n e u s ) 等产生的海藻糖脂，许多酵母菌产生的槐二糖脂，假单胞菌 ( p s e u d o m o n a ss p p ) 产生的鼠李糖脂等，都是应用溶剂萃取表面活性剂的范例 2 6 - 2 s 。 第1 章绪论 1 3 1 2 结晶与沉淀 结晶与沉淀是利用样品各组分在溶剂中溶解度的差异，将其从溶液中分离出 来，是一种很有效的纯化物质的方法。沉淀最终用离心或过滤取出沉淀物，必要 时可在溶解后用重结晶或重沉淀进一步纯化【2 9 1 。 1 3 1 3 超滤 超滤法是从发酵液中提取生物表面活性剂的一种新方法。这种方法速度快、 回收率高，在国外应用较为广泛【3 0 - 3 2 。超滤法最大的优点是产物损失少，许多高 分子生物表面活性剂可以将其溶液经半透膜过滤来进行浓缩。 1 3 1 4 泡沫分离法 除了上述几种方法，还可以采用“随程提取”的方法提取表面活性剂，它是 在培养微生物的同时，从培养液中转移产物的方法。微生物发酵过程都会产生泡 沫，生物表面活性剂的生成过程尤为显著。发酵产生的泡沫会造成产品和营养成 分的流失。d a v i s 等用泡沫分离法对生物表面活性) 葶u s u r f a c t i n s 进行了提取和浓缩， 证明了泡沫分离方法的有效性，并且将泡沫分离和发酵过程相结合，建立了连续 生产过程【3 3 】。“随程提取 方法避免了发酵过程终产物的抑制作用，降低了溶剂和 废水处理的成本，并能使产物降解减至最小【3 4 1 。分离提纯生物表面活性剂的方法 多种多样，为了得到较好的效果，在实际操作中通常选择多种方法一起提纯【3 5 1 。 1 3 2 生物表面活性剂的分析方法 1 3 2 1 轴对称液滴分析法 轴对称液滴分析( a d s a ) 法是由v a nd e rv e ：g t 等提出用于筛选及评价产表面 活性剂菌株的方法，该方法是将培养基液滴放置在氟化次乙基丙烯表面，液滴的 轮廓由轮廓检测仪检测，根据液滴的轮廓用轴对称方法计算其表面张力，筛选和 评价菌株代谢表面活性剂的状况1 3 6 1 。 1 3 2 2 薄层色谱法 薄层色谱法( t h i n kl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 可以借助不同的展开剂和显 色剂对微生物代谢生成的表面活性剂直接进行快速表征鉴定。该方法较为快速且 黑龙江大学硕士学位论文 不需要专门的仪器，只是实验前的准备较为费时 3 7 1 。 1 3 2 3 超声波振荡法 超声波振荡法主要用来测定菌落发酵液的乳化性能，c o o p e r t f h g o l d e n b e r g 将等 体积的煤油和微生物发酵液样品进行震荡或超声波处理后测量乳化相、油相和水 相的体积，依次评价其乳化效果f 3 8 1 。 1 3 2 4 比色法 s i e g m u n d 和w a g n e r t 3 纠以及h a i l s e l l 等【删分别报道了产鼠李糖脂和烃类降解菌的 筛选。将比色法与苯酚硫酸法相结合检测糖脂类表面活性剂方法非常有效，该方 法也适用于对糖、多糖及其衍生物的分析。 1 4 微生物采油技术 石油作为极其重要的战略资源在人类的生产生活中扮演着十分重要的角色。 目前，我国正面临能源消耗快速增长与大量石油资源未能有效开发的突出问题。 预计2 0 1 0 年、2 0 1 5 年和2 0 2 0 年我国的石油需求量分别为3 7 9 亿吨、4 2 9 亿吨和 4 8 5 亿吨，到2 0 2 0 年将有5 8 7 6 的原油依靠进口，石油缺口将越来越大。随着石 油供需缺口逐年增加，我国对国外资源的依赖程度不断加大，这对我国石油供给 安全构成重大威胁i 4 1 1 。在能源日趋紧张的情况下，如何提高已开发油田的石油采 收率已成为石油开采研究的重大课题。 微生物采油( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y ，m e o r ) 技术是继热力驱、化 学驱、聚合物驱等方法之后，利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收 率的一项综合性技术【4 2 1 。 早在1 8 9 5 年，m i y o s h i l 4 3 】就首先记载了微生物作用烃类的现象。1 9 2 6 年，美 国人b e c k m a n 最早提出了用微生物提高原油产量的想法【伽。1 9 4 3 年，z o b e l l 首先 申请了把细菌直接注入地下以提高石油采收率的专利【4 5 1 ，1 9 4 6 年又提出了一套应 用厌氧硫酸盐还原菌进行三次采油的现场实施方案。1 9 4 7 年，b e c k 进行了首次工 业试验。1 9 5 3 年，z o b e u 又利用其它类型细菌进行提高原油采收率的一系列实验 研究【蛔。此后又进行了多方面大量的研究，奠定了细菌采油的基础。 第1 罩绪论 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii il i n mi n t om_ i in ni i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 随着研究内容和领域的不断深入及拓展，m e o r 技术已从室内研究走向矿场 试验，取得了令人瞩目的成就。 1 4 1 微生物提高原油采收率机理 微生物采油技术是目前国内外发展迅速的一项提高原油采收率的技术，也是 2 1 世纪一项高新生物技术，该技术是利用微生物在油藏中的代谢作用和代谢产物 的作用改善原油在油藏中的流动性，从而提高产量和采收率f 4 7 】。微生物提高原油 采收率技术的作用机理十分复杂，一般认为主要分为微生物调剖和微生物提高洗 油效率两大类【4 8 】： ( 1 ) 微生物调剖 微生物在地下发酵过程中产生的生物聚合物，可选择性封堵高渗透带，扩 大注入水的波及体积，提高原油采收率。 微生物菌体自身也可以选择性封堵高渗透带，扩大注入水的波及体积，增 加产油量。 ( 2 ) 微生物提高洗油效率 有些微生物可裂解原油中的重质组分( 如重质烃类和石蜡) ，从而降低原油 粘度，改善原油在地层中的流动性能，降低原油的流动阻力，提高采收率。 微生物代谢产生的生物气( 如c 0 2 、n 2 、h 2 、c h 4 等) 能够增加底层压力， 降低原油粘度，其中c 0 2 还能溶解碳酸盐矿物，增加渗透性。 微生物代谢产生的低分子量的有机溶剂( 如醇类、酮类及酯类等) 可溶于 原油中，降低原油粘度，或作为助表面活性剂，改善原油流动性。 微生物所产生的生物表面活性剂会降低油水界面张力，改变油藏岩石润湿 性，从而提高采收率。 微生物代谢产生的有机酸可溶蚀孔喉中岩石表面的碳酸盐矿物或无机垢， 改善地层的渗透性，提高采收率。 黑龙江大学硕士学位论文 1 4 2 微生物采油的优势与不足 1 4 2 1 微生物采油的优势 在石油工业中，微生物采油技术作为一项新兴的三次采油技术，不仅可以提 高原油采收率，还具有解堵、降黏及清蜡等其它作用，有着其它三次采油技术难 以比拟的优势 4 9 4 3 】： ( 1 ) 微生物资源丰富，功能多样，为选择适合各种油藏条件的m e o r 菌种提 供了良好的基础。 ( 2 ) 对边际生产油田具有经济吸引力，所需设备简单，成本低，见效周期长。 ( 3 ) 微生物是自主复制体系，可在油藏中不断地繁殖，长时间发挥作用。 ( 4 ) 微生物体积小，运移能力强，能进入其他采用工艺不能触及的地层死角 和裂缝。 ( 5 ) 微生物培养液成本低廉且不受原油价格影响，只要中断入注培养液，便 可使微生物的活动停止。 ( 6 ) 适用于各种类型的原油，能广泛应用于重质油和轻质油。 ( 7 ) 不损害地层，可以在同一油井中多次应用，不污染环境。 ( 8 ) 多种驱油机理可以同时作用，使用范围广。 1 4 2 2 微生物采油的不足 尽管m e o r 技术具有诸多优势，但由于微生物采油技术的前沿性和复杂性， m e o r 技术仍然存在着一些不足之处1 4 9 , 5 4 - 5 8 ： ( 1 ) 采油机理尚未完全探明，微生物采油机理研究滞后是限制m e o r 技术大 面积推广应用的主要原因之一。需要进行室内配伍性测试，以及合理的工程设计 证实。 ( 2 ) 菌株性能是制约m e o r 技术的一个关键因素。由于微生物在地下生长的 条件不易把握，在温度较高、盐度较大、重金属离子含量较高的油藏条件下易遭 到破坏，需要筛选耐温耐盐性能更强的采油菌株。 ( 3 ) 采油菌种数量偏少，且单项功能不突出，具备良好生长代谢特性和遗传 第1 章绪论 稳定性的优质高效菌种稀少。 ( 4 ) 预测现场的地层模拟技术和数值模拟技术还不成熟，尚未开发出能预测 现场应用效果的储层模型。 ( 5 ) 特定油层的微生物最佳应用工艺尚在建立之中。 ( 6 ) 矿场应用的筛选标准有待改进。 1 5m e o r 用生物表面活性剂 m e o r 技术是生物表面活性剂应用的一个重要领域。生物表面活性剂的驱油 效率较人工合成的表面活性剂高3 5 8 倍，而价格却仅为人工合成的表面活性剂的 3 0 。因此，生物表面活性剂作为一种理想的提高原油采收率用的化学剂已引起了 人们的广泛关注，许多国家已把利用产生物表面活性剂的微生物进行三次采油作 为油田长期开发的攻关课题【5 6 1 。 1 5 1 m e o r 用生物表面活性剂的特点 生物表面活性剂的种类很多，研究表明，m e o r 用的生物表面活性剂应具有 以下特点【5 9 缶1 】： ( 1 ) 具有较高的界面活性，能使油水界面张力降至0 0 1 0 0 0 1 m n m 以下。 ( 2 ) 具有适宜的溶解度和p h 值，能降低岩层对原油的吸附性。 ( 3 ) 在岩石固体表面上的被吸附量小。 ( 4 ) 在含油岩石表面润湿性好，能剥离油膜，分散原油，具有较强的乳化原 油的能力。 ( 5 ) 具有耐高温、耐高盐以及抗二价c a 2 + 、m 9 2 + 离子的能力，不易出现沉淀。 ( 6 ) 具有阻止其他化学剂发生副反应的能力，即所谓的“阻化性质”。 ( 7 ) 生物降解性好、无污染、常温溶解性好、稀释配制方便。 ( 8 ) 具有较高的经济价值，投入产出比具备优势。 黑龙江大学硕士学位论文 1 5 2 生物表面活性剂驱油机理 驱油剂的波及效率和洗油效率是影响石油采收率的关键因素。通过考察表面 活性剂分子在油水界面的作用特征、水驱后残余油的受力情况以及表面活性剂对 残余油受力状况的影响表明，生物表面活性剂提高原油采收率的机理主要有以下 四种【6 2 侧。 ( 1 ) 降低油水界面张力机理 理想的生物表面活性剂具有良好的界面活性，可以显著降低油水界面张力， 从而大大降低或消除地层的毛细管作用，减少剥离原油所需的粘附力，提高洗油 效率。 ( 2 ) 乳化机理 生物表面活性剂的乳化能力可迅速将岩石表面的原油分散、剥离，形成水包 油型乳状液，从而改善油水两相的流度比，提高波及效率。 ( 3 ) 润湿反转机理 驱油效率与岩石的润湿性也密切相关。表面活性剂可以增大原油与岩石间的 润湿接触角，使岩石表面由油湿性向水湿性转变，从而降低油滴在岩石表面的粘 附力，提高原油采收率。 ( 4 ) 聚并形成油带机理 地层表面洗下的油滴在向前移动时相互碰撞，而生物表面活性剂可以使这些 油珠聚并形成油带，油带又和更多的油珠合并，促使残余油向生产井进一步驱替。 1 5 3m e o r 用生物表面活性剂国内外研究进展 1 5 3 1m e o r 用生物表面活性剂国内研究进展 我国对生物表面活性剂的研究始于八十年代，九十年代中期开始m e o r 采油 用生物表面活性剂的研究。我国对采油用生物表面活性剂的研究主要还处于室内 模拟阶段，随着研究的不断深入，已经逐步开展现场试验，生物表面活性剂在采 油中的应用己扩展到小规模成片油田【6 5 1 ，并取得了显著良好的效果。 有报道，大庆油田勘探开发研究院分离的产脂肽生物表面活性剂的枯草芽孢 - 1 0 第1 章绪论 i i 杆菌z w - 3 ，可耐高温高盐、p h 适应范围广，该脂肽表面活性剂具有较强的乳化 作用和发泡性能，其发酵液可提高原油采收率5 1 ，与1 0 n a o h 溶液复配进行 驱替模拟实验可提高原油采收率9 2 6 6 1 。牛明芬等 6 7 1 从油泥中分离得到3 株能够 产生生物表面活性剂的细菌b 2 2 ，b 2 4 ，b 2 5 ，试验表明，三种细菌产生的生物表 面活性剂可耐高温高盐、p h 适应范围广，用其产生的生物表面活性剂处理油泥 7 2 h ，去除率分别达到6 2 3 1 ，8 1 6 9 和7 1 3 8 ，为原油增采和运输提供了良好 的驱油剂，也为石油污染土壤治理提供了一种有效的方法。吉占军等人1 4 8 】针对低 渗透油藏开发出了生物表面活性剂菌液，一系列室内实验表明该菌液具有较低的 界面张力，较好的原油降粘率、防蜡率和洗油能力。采用该菌液驱油，室内人造 岩心和天然岩心物理模拟实验采收率增加幅度分别为9 1 0 0 o 1 7 2 7 和 5 3 9 1 0 5 6 。 宋芳屯油田低渗透区块，将产生物表面活性剂的菌种n 8 0 和产乙酸的菌种 d q 0 2 混合，在确定了各项工艺参数后进行微生物驱油矿场试验，7 口试验井日增 原油1 3 t ，增产效果显著【6 引。 将生物表面活性剂与化学表面活性剂进行复配产生协同效应也是现今m e o r 用生物表面活性剂的研究重点之一。大庆油田将脂肽类生物表面活性剂与化学合 成表面活性剂复配并对体系性能进行研究。结果表明，在相同注入流程下，复配 体系物理模拟驱油实验提高采收率2 7 3 5 ，比化学驱提高4 3 5 。由于脂肽表面 活性剂替代了部分化学合成表面活性剂，在提高采收率的同时降低了成本，具有 良好的应用前景【叫。 1 5 3 2m e o r 用生物表面活性剂国外研究进展 2 0 世纪2 0 3 0 年代，h o l b r o o k 提出用脂肪酸盐等表面活性剂降低界面张力， 提高原油采收率，由此产生了低张力表面活性剂驱油方法【7 0 1 。7 0 年代后期开始， 各国对生物表面活性剂进行了深入的基础研究和应用研究，并取得了许多令人瞩 目的成果。8 0 年代已经研制出不同类型的生物表面活性剂，9 0 年代在产表面活性 剂的菌种筛选，表面活性剂的结构测定和性能的评价，生物表面活性剂的最适生 产条件和室内驱油评价等方面开展了大量工作【7 1 , 7 2 。 黑龙江大学硕士学位论文 地衣杆菌j f 2 是现在研究最多的产表面活性剂的菌种，德克萨斯大学7 3 l i n s e 系统地研究了环境参数( 温度、p h 值、盐度) 对生物表面活性剂产生、代谢产物 和地衣杆菌生长的影响，部分提纯的生物表面活性剂有很高的界面活性，油水间 界面张力能达到0 0 1 6 m n m 。o k l a h o m a 大学m a r s h 【7 4 1 选择了产表面活性剂乙酰丁 醇的梭状芽孢杆菌腰2 模拟地层条件证明了生物表面活性剂在微生物提高原油采 收率中的重要作用。 西德的e w a g n c r 试验室将研制出的海藻糖脂等生物表面活性剂在北海油田进 行驱油实验，原油采收率提高了3 0 ，与化学表面活性剂相比，驱油效率提高了5 倍【铜。 此外，针对大多数储油罐缺氧的特点，人们开始关注并研究厌氧菌产生物表 面活性剂的情况，j a v a h c i 等报道了地衣芽胞杆菌j f 2 在严格缺氧的条件下可产 生多种显著降低培养基表面张力的物质，3 8 下将厌氧菌丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 加到含有重油的模型储油罐中，石油回收率提高1 2 ，这主要是由于其产生的表 面活性剂改变了原油的粘度及p h 值。 2 0 0 0 年后，m e o r 进入了快速发展阶段，美国、俄罗斯和英国等国家开展了 一系列研究工作，并取得了一定的进展。 1 5 4m e o r 用生物表面活性剂发展前景 随着微生物采油技术的日臻成熟，m e o r 户f l 生物表面活性剂展现出了良好的发 展前景【7 6 - 7 9 ： ( 1 ) 加大对传统生物表面活性剂分子结构设计、合成及性能研究等方面的研 究力度，逐步深入探究其驱油效率和采油机理，进一步推进我国三次采油技术的 发展。 ( 2 ) 开发耐高温高盐及低渗透油藏应用的新型表面活性剂，针对我国油藏油 层温度和矿化度及渗透率的现状，研制满足我国油藏条件的生物表面活性剂。 ( 3 ) 加强菌株的遗传学研究，获得更有针对性的高效生物表面活性剂；借助 基因工程手段引入新的基因，使菌株在底物的利用和生物表面活性剂的活性提高 帚1 罩绪论 方面得到进一步改善 s 0 1 。 ( 4 ) 开发廉价的生物表面活性剂，降低生物表面活性剂的生产成本，优化发 酵工艺并开发经济有效的回收方法【8 l 】。 1 6 实验目的及研究内容 1 6 1 实验目的 本实验采用p l a c k e t t - b u r m a n 法和响应面优化法相结合的方法对产生物表面活 性剂采油菌株的培养基和发酵条件进行优化，进一步挖掘其产生物表面活性剂的 潜力，为建立完善的采油菌株产表面活性剂的发酵工艺打下基础，助其早日实现 工业化生产和实际应用，并为生物表面活性剂在微生物采油的研究发展提供有力 的支撑。 1 6 2 研究内容 ( 1 ) 产生物表面活性剂采油菌株的筛选。 ( 2 ) 对筛选所得的菌株进行形态学、生理生化性质、1 6 s rd n a 的鉴定。 ( 3 ) 对菌株所产的生物表面活性剂进行定性定量的研究。 ( 4 ) 在单因素实验的基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 法和响应面优化法相结合 的方法对发酵培养基以及发酵条件进行优化。 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章菌株的筛选鉴定及定性定量分析 生产生物表面活性剂的方法有许多种，但无论采用何种方法，首先依赖的是 生产菌，菌种筛选工作是研究生物表面活性剂的基础f 8 2 1 。如何快速有效地筛选生 物表面活性剂的产生菌是研究的重点。 本实验采用血平板法和排油圈法相结合的方法对黑龙江大学生命科学学院微 生物三次采油实验室提供的3 0 株采油菌株进行筛选，得到l 株产生物表面活性剂 性能最强的菌株，作为后续研究的出发菌株。 对该菌株进行形态学、生理生化学实验、1 6 sr d n a 序列分析确定其种属，并 对其所产的生物表面活性剂进行初步定性和定量的研究。 2 1 实验材料 2 1 1 菌株 采油茵3 0 株，由黑龙江大学生命科学学院采油微生物实验室提供。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 斜面培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， p h7 0 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 ( 2 ) 种子培养基：葡萄糖5 9 ，牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 2 9 ，去 离子水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 淀粉培养基：牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，可溶性淀粉2 9 ，琼 脂2 0 9 ，溶于1 0 0 0 m l 水中，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 明胶培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，溶于1 0 0 m l 水中， 加入明胶1 2 1 8 9 ，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌，溶化后调p h7 2 7 4 ， 1 2 1 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 ( 5 ) 石蕊牛奶培养基：牛奶粉1 0 0 9 ，石蕊0 0 7 5 9 ，溶于1 0 0 0 m l 水中，p h 6 8 ， 第2 章菌株的筛选鉴定及定性定量分析 1 2 1 蒸汽灭菌1 5 m i n 。 ( 6 ) 糖发酵培养基：蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，溶于蒸馏水1 0 0 0 m l ，调p h 至 7 6 。将上述培养基分装于试管内，试管内放置德汉氏小管，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 配制2 0 葡萄糖、乳糖溶液各l o m l ，再1 1 2 蒸汽灭菌3 0 m i n 。分别灭菌后，每 管以无菌操作加入2 0 的无菌糖溶液0 5m l 。 ( 7 ) 葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5 9 ，葡萄糖5 9 ，k h 2 p o c 2 9 ，溶于蒸馏 水1 0 0 0 m l ，调p h7 啦7 2 ，过滤分装后1 1 2 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 ( 8 ) 柠檬酸盐培养基：n h 4 h 2 p 0 4 1 9 ，k e h p 0 4 1 9 ，n a c l 5 9 ，m g s 0 4 0 2 9 ，柠 檬酸钠2 9 ，琼脂2 0 9 ，溶于蒸馏水1 0 0 0 m l 中。将上述各成分加热溶解后，调p u 至6 8 ，加入指示剂l 溴麝香草酚蓝乙醇溶液l o m l ，摇匀后用脱脂棉过滤，再分 装试管在1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 后制成斜面。 ( 9 ) 醋酸铅培养基：p h 7 4 的牛肉膏蛋白胨琼脂l o o m l ，硫代硫酸钠0 2 5 9 ， 1 0 醋酸铅水溶液l m l 。将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基1 0 0 m l 加热溶解，待冷却至 6 0 。c 时加入硫代硫酸钠0 2 5 9 ，调p h 为7 2 ，分装于三角瓶中，1 1 5 c 蒸汽灭菌1 5 m i n 。 取出后冷却至5 5 , - - 6 0 ，加入灭菌的1 0 醋酸铅水溶液l m l ，混匀后倒入灭菌试 管。 ( 1 0 ) 卵黄琼脂平板培养基：酵母膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l l o g ，琼脂2 0 9 ， 5 卵黄悬液，溶于1 0 0 0 m l 水中，用1 mn a o h 调p h 至7 0 ，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 1 1 ) 硝酸盐培养基：硝酸钾o 2 9 ，蛋白胨5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。调p h 至7 4 ， 分装于试管中，1 2 1 蒸汽灭菌1 5 m i n 。 ( 1 2 ) 血平板分离培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，琼脂1 5 9 2 0 9 ， 蒸馏水1