（微生物学专业论文）海洋放线菌活性菌株的筛选及1023菌株次级代谢产物的研究.pdf

摘要 海洋放线菌分布广，种类多，可产生许多结构新颖、功能独特及毒副作用较 低的次级代谢产物，是寻找新药或先导化合物的重要资源。本论文对13 株分离 自深海底泥和海洋动植物体的海洋放线菌的抗菌、抗乙酰胆碱酯酶和抗肿瘤等活 性进行了分析，并对其中一株具有较强体外抗肿瘤活性菌株的次级代谢产物进行 了较系统的研究，旨在发掘具有潜在应用前景的活性化合物，为开发新的微生物 药物奠定基础。 采用改进的e i i m a n 法，微量液体稀释法和m t t 法，分别对1 3 株海洋放线 菌的3 种培养基发酵液乙酸乙酯提取物的抗乙酰胆碱酯酶活性、抗菌活性和体外 抗肿瘤活性进行检测，结果表明：有9 2 3 的提取物( 浓度为1 0 0l g m l ) 对a c h e 的抑制率大于5 0 ，其中0 1 菌株的海水改良y s p 培养基提取物和1 8 菌株的 海水y m g 培养基提取物具有较强的活性，当提取物浓度降到2 0l g m l 时，对 a c h e 的抑制仍分别可达5 1 2 和5 3 1 ；有9 个提取物对大肠杆菌或枯草芽 孢杆菌有抑制作用，占总供测样品的2 3 1 ，其中对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 有抑制作用的分别为5 1 和2 0 5 ；有1 4 个提取物( 浓度为1 0 0 1 咀g m l ) 具有体 外抗肿瘤活性( 对k b 或h e p g 2 的抑制率- - s o ) ，占总供测样品的3 5 9 ，其中 菌株10 2 3 具有很强的活性，它的3 个培养基提取物在2 0 蜒j m l 时对肿瘤细胞 k b 的抑制率都在以上。 采用形态学鉴定方法及16 s r d n a 序列分析技术对10 2 3 菌株进行鉴定，将 其归类为链霉菌属( s t r e p t o m y c e ss p ) 。 以半海水高氏一号为培养基，2 0 0l 发酵罐发酵制备1 0 2 3 菌株发酵液1 2 0 l 。采用硅胶柱层析、中压反相柱层析、s e p h a d e xl h 2 0 凝胶柱层析和重结晶 等方法从发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离到8 个化合物( m p m 7 ，h w x l 3 ， h w x 2 3 ，h w x 2 7 ，h w x 2 9 ，h w x 3 3 ，h w x 3 5 ，h w x 3 9 ) 。利用m s ，n m r 和红外 等波谱技术，鉴定它们的结构。化合物m p m 7 为v a l i n o m y c i n ，其余7 个为含有 n o n a c 【i ca c i d 及其衍生物：h w x l 3 ，h w x 2 7 ，h w x 2 9 ，h w x 3 3 ，h w x 3 5 ， h w x 3 9 分别是h o m o n o n a c t i ca c i d ，f e i g r i s o l i d ec ，n o n a c t i ca c i da c e t a t e ， h o m o n o n a c t i cm e t h y l e s t e r ，n o n a c t i cm e t h y l e s t e r ，和n o n a c t i ca c i d ，h w x 2 3 的结构鉴定为m e t h y l2 - ( 5 ( 3 - h y d r o x y b u t y l ) 一t e t r a h y d r o f u r a n 一2 - y 1 ) p r o p a n o a t e ， 是新化合物。 对这8 个化合物进行了生物活性的测试。m p m 7 对h e l a 细胞的i c 为3 0 4 n g m l ，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和结核分枝杆菌的m i c 均为5 0p g m l ，对 白色假丝酵母的m i c 为1 5 6p g m l ，对啤酒酵母的的m i c 为6 2 5p g m l 。其 余7 个化合物没检测到明显的生物活性，新化合物h w x 2 3 的其它活性有待进一 步的研究。 本文的研究结果表明，海洋放线茵中蕴藏着较丰富的抗菌和抗肿瘤活性物质 产生菌，具有产生新结构化合物和强生物活性代谢产物的能力，是开发微生物药 物的重要资源。 关键词：海洋放线菌：细胞毒活性；n o n a c t i ca c i d a b s t r a c t m a d n e d e d v e da c t i n o m y c e t e sa r et h eg r e a t c o m p o n e n te l e m e n to f m i c r o b ei nm a r i n e t h e r ea r ei n n u m e r a b l ek i n d so fm a r i n e d e n v e d a c t i n o m y c e t e s ，w h i c hd i s t r i b u t ew i d e l yi na l lk i n d so fm a r i n ee n v i r o n m e n t m a r i n e d e r i v e da c t i n o m y c e t e sm i g h tp r o d u c ed i f f e r e n tt y p e so fb i o a c t i v e c o m p o u n d s t h e ya r eap r o l i f i ca n de x t r a o r d i n a r yr e s o u r c ef o rt h ed i s c o v e r yo f n e w d r u g s t h i st h e s i sc o v e r sp r e l i m i n a r ys t u d yo nt h ea n t i b a c t e r i a l ，c y t o t o x i t i ca n d a c h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo f13m a r i n e - d e r i v e da c t i n o m y c e t e s f u r t h e r m o r e ，w e i n v e s t i g a t e dt h em e t a b o l i t e so ft h eo n eo ft h e m ，t h es t r a i n10 2 3 ，w h i c h e x h i b i t e dp o t e n ta n t i t u m o ra c t i v i t i e s t h eg o a lo ft h i st h e s i sr e s e a r c hw a st o e x p l o i tn o v e lb i o a c t i v es e c o n d a r ym e t a b o l i t e st h a tw i l lc o n t i n u et ob ea n i m p o r t a n ts o u r c eo fn e wm e d i c i n e s w ec u l t u r e dt h e13m a d n e - d e d v e da c t i n o m y c e t e sw i t ht h r e ed i f f e r e n t m e d i a ，t h e ni n v e s t i g a t e dt h ea n t i b a c t e d a l ，c y t o t o x i ca n da c h ei n h i b i t o r y a c t i v i t i e sf o rc r u d ee x t r a c t so ft h e m t h er e s u l ts h o w e dt h a t9 2 3 o ft h et o t a l e x t r a c t si n h i b i t e dt h ea c h ea c i t i v i t yb ym o r et h a n5 0 a t10 0l 上g m l t h e r e w e r e2 0 5 a n d5 1 o ft h et o t a le x t r a c t ss h o w e da n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a g a i n s te s c h e d c h i ac o l ia n db a c i l l u ss u b t i l i sr e s p e c t i v e l y t h e r ew e r e14 e x t r a c t s ( 3 5 9 o ft h et o t a le x t r a c t s ) s h o w e dc y t o t o x i ca c t i v i t ya g a i n s tk bo r h e p g 2c e l ll i n e s ，a m o n gt h e m ，s t r a i n10 2 3w a sf o u n dt oh a v ep o t e n tc y t o t o x i c a c t i v i t i y , t h r e ee x t r a c t so ft h a ti n h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o no fk bb ym o r et h a n6 0 a t2 0 删m l t a x o n o m i cs t u d i e s ，i n c l u d i n gm o r p h o l o g i c a ls t u d ya n du s i n gs e q u e n c e a n a l y s e so ft h e16 s r d n aa n dm a t c h i n go ft h er e s u l t i n gs e q u e n c ea g a i n s tt h e d a t a b a s e ，i n d i c a t e dt h a ts t r a i n10 2 3b e l o n g st ot h es t r e p t o m y c e sg e n u s w es t u d i e dt h em e t a b o l i t e sf r o mt h es t r a i n10 2 3 e m p l o y i n gs i l i c ag e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , m i d d l e p r e s s u r er e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e xl h 一2 0d e x t r a ng e lc h r o m a t o g r a p h ya n dr e - c r y s t a l ，w e h l i s o l a t e de i g h tc o m p o u n d s ( m p m 7 ，h w x l3 ，h w x 2 3 ，h w x 2 7 ，h w x 2 9 ， h w x 3 3 ，h w x 3 5 ，h w x 3 9 ) f r o mt h es t r a i n t h es t r u c t u r e so ft h ee i g h t c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e d t h es t r u c t u r eo fm p m 7i sv a l i n o m y c i n ，a n dt h e o t h e rs e v e nc o m p o u d sa r en o n a c t i ca c i da n di t sd e r i v a t i v e s t h es t r u c t u r e so f h w x l3 。h w x 2 7 h 、，) ( 2 9 ，h w x 3 3 ，h w x 3 5a n dh w x 3 9w e r ei d e n t i f i e da s h o m o n o n a c t i ca c i d 。f e i g r i s o l i d ec ，n o n a c t i ca c i da c e t a t e ，h o m o n o n a c t i c m e t h y l e s t e r ，n o n a c t i cm e t h y l e s t e ra n dn o n a c t i ca c i dr e s p e c t i v e l y h w x 2 3w a s i d e n t i f i e da sm e t h y l2 - ( 5 ( 3 - h y d r o x y b u t y l ) - t e t r a h y d r o f u r a n 2 y 1 ) p r o p a n o a t e ， w h i c hi san e wc o m p o u d i nt h el a t e ri n v e s t i g a t i o no fa n t i t u m o ra n da n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s m p m 7 s h o w e dp o t e n tc y t o t o x i c i t yt ot h eh u m a nc e r v i c a lc a n c e rc e l ll i n eh e l a ( i c s o 3 0 4 n g m l ) t h i sc o m p o u n ds h o w e dp o t e n ta n t i f u n g a la c t i v i t ya g a i n s t c a n d i d aa l b i c a n sw i t hmi co f1 5 6p g m la n da l s oi n h i b i t e ds a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ( m i c = 6 2 5l 上g m l ) t h eo t h e r7c o m p o u n d s s h o w e dn ob i o a c t i v i t y i no u r t e s t o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tm a r i n e - d e n v e da c t i n o m y c e t e sw e r er e l i a b l e r e s o u r c e sf o rn o v em e t a b o l i t e sw i t ha n t i t u m o ra n da n t i m i c r o b i a lb i o a c t i v i t y t h e y a r eau n i q u es u o m ef o rn e wm e d i c i n e s k e yw o r d s ：m a r i n e - d e r i v e da c t i n o m y c e t e s ；c y t o t o x i ca c t i v i t y = n o n a c t i ca c i d 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研 究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成 果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论 文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ： 雀俸酲 妒7 年2 月j e l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规 定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交 论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的 少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论 文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题 和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密() ，在年解密后适用本授权书。 ， 2 不保密( 力 y ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：稻泓期： 硼年 g 月j 日 导师签名：却妙埒日期御年g 月日 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 刖罱 _ - 一 天然产物一直是新药的最重要来源，目前已上市的药物有许多是来自天然产 物，例如已应用于临床的抗癌和抗感染新药物中分别有6 0 和7 5 是直接或间 接来源于天然产物【1 1 。长期以来，人类开发天然产物药物的重点一直集中在陆生 生物资源，现有的已上市的天然产物来源的药物大多数也都来自陆生生物。然而， 随着陆地生物资源开发利用日趋达到极限，目前从陆生生物代谢产物中发现新药 物或先导化合物的几率大幅度地下降，例如，近年来从陆生微生物分离到的活性 代谢产物有9 5 以上都是已知的化合物。因此，自上世纪6 0 年代来，人们开 始重视海洋天然产物的研究开发。在过去的几十年间。全世界已从海洋动植物及 微生物中发现了超过1 5 0 0 0 种的海洋天然产物，包括3 0 0 0 种以上具有不同的 生物活性的化合物冈。其中，已有几十个化合物作为候选药物进入临床或临床前 研究 3 - 4 1 。目前，海洋天然产物的越来越受关注，已成为天然药物研究的热点。 1 海洋天然产物研究概况 海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的7 1 ，海水总体积占地球总 水量的9 7 。海洋生态系统多样，有滨海湿地生态系统( 主要包括盐沼生态系、 河口生态系和红树林生态系) 、珊瑚礁生态系统、上升流生态系统和深海生态系 统等 5 1 。各种生态系统都有其独特的生境，丰富多样的生境导致了生物的多样性。 据估计，有记载的海洋动植物物种有接近3 0 0 0 0 0 种 s t j 。海洋微生物的种类更是 多得惊人，运用分子生物学的方法，估计海洋微生物有1 0 6 1 0 9 个类群 8 1 ，然 而，目前对这类微生物的了解还非常有限。海洋有多种特殊的生境，例如高盐度、 高压、低营养、低温、局部高温和无光照等等。独特的生境使得海洋生物已发展 出独特的代谢方式，与此同时，这些生物为了捕食或防止被捕杀、为了共生或寄 生、为了竞争食物也会产生结构新颖、活性独特的化合物【1 0 1 ，其中有些化合物 要么毒性很高，要么选择性很强。因此，海洋动植物和海洋微生物是发现新结构 化合物的极好资源，也是开发新药、寻找活性先导化合物的重要药源。 在过去的几十年里，每年都有许多海洋天然产物被发现，尤其是近年来，分 离到的新化合物的数量呈逐年递增的趋势( 2 0 0 3 年报道的有6 5 6 个、2 0 0 4 年报道 的有7 16 个、2 0 0 5 年报道的有8 12 个) p 1 - 1 3 。 对海洋天然产物药物的研究开发，最初的主要研究对象是集中在海鞘、珊瑚、 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 海参、棘皮动物海绵、海藻等不同的海洋动植物上，并从中分离到了许多具有不 同生物活性的新天然产物。 a i e l l o 等从采集自撤丁岛海岸的海鞘( a p l i d i u mc o n i c u m ) = p 分离得到两个含 硫的醌类化合物t h i a p l i d i a q u i n o n ea 和t h i a p l i d i a q u i n o n eb 【1 4 1 。这两个化合物能进 入肿瘤细胞作用于线粒体，从而诱导细胞凋亡。a p p l e t o n 等从采集自新西兰北部 海域的海鞘( l i s s o c l i n u mn o 蚴中分离到三个新的化合物i s o d i p l a m i n e 、c y s t o d y t i n k 和l i s s o c l i n i d i n e 。其 p i s o d i p l a m i n e 与已知化合物d i p l a m i n e 的结构相似，就是 硫甲基的位置不同，d i p l a m i n e 对b s c 1 细胞的毒性很强，而i s o d i p l a m i n e 对 b c s - 1 却没什么毒性悯。t o r r e s 等从采集自巴西的海鞘( 咖f 0 懈d e l l e c h i a j e t ) 中分离得到两个新的多环结构的生物碱类化合物s e b a s t i a n i n e st 。 s e b a s t i a n i n e sa 和b 都对人结肠癌细胞h c t - ”6 有一定的细胞毒活性，而且重要 的是其作用的强弱与p 5 3 的存在与否有关。 近年，有很多关于从珊瑚中分离到有生物活性新结构化合物的报道。例如， 2 0 0 6 年，b i s h a r a 等从采集自肯尼亚南方海域的珊瑚( x e n i an o v a e b r i t t a n n i a e ) 的 乙酸乙酯提取物中分离得至：l j 7 个新的二萜类化合物。其中化合物x e n i o l i d ei 具有 较强的抗大肠杆菌和抗枯草芽孢杆菌的活性，化合物n o v a x e n i c i na 能够诱导细 胞凋亡p s l 。e l a g a m a l 等从采集自台湾绿岛附近的软珊瑚( x e n i au m b e l l a t a l a m a m k ) + 分离得到1 1 个新的二萜类化合物。其中，化合物u m b e l l a c i n sb 、d 、 e 、f 、h 和l 对a 5 4 9 ( 人肺癌细胞) 和h t - 2 9 ( 人结肠癌细胞) 没有明显的细胞毒性， 而对鼠p 3 8 8 白血病细胞株有很强的细胞毒作用【1 s l 。a h m e d 等从采集自台湾垦 丁海岸的珊瑚( s i n u a r i a ng r a n d i l o b a t a ) 的乙酸乙酯抽提物中分离得到4 个新的甾 醇类化合物s i n u g r a n d i s t e r o l sa - d 【1 9 1 ，这四个化合物对多株肿瘤细胞都有一定的 细胞毒活性。 近年，从海星纲、海百合纲、海参纲、海胆纲和蛇尾纲等棘皮类动物门中分 离到有生物活性新结构化合物的报道也不少。例如，2 0 0 5 年，m i s c h e n k o 等从采 集自俄罗斯彼德大帝海湾的海胆( s c a p h e c h i n u sm i r a b i l i s ) 中分离得到两个氨基 化的萘醌类化合物e c h i n a m i n e sa 和b 2 0 。这两个化合物表现出很强的清除d p p h 自由基的能力，表明它们有很强的抗氧化作用。2 0 0 6 年，h a n 等从一种采集自 冲绳的海星( l i n c k i al a e v i g a t a ) 中分离得到6 个新的固醇糖苷类化合物 2 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 l i n c k o s i d e sf - k f 2 1 l 。2 0 0 7 年，h a n 等再从这种海星( l i n c k i al a e v i g a t a ) 中分离得 到5 个新的固醇糖苷类化合物l i n c k o s i d e sm q 圈。这11 个化合物是类似物，能 够不同程度地引起神经细胞p c 12 分化而长出轴突。 最近，从海绵中分离得到有生物活性的新结构化合物的报道也很多。例如， 2 0 0 5 年，e s t e b a n 等从采集自墨西哥托波洛班波( t o p o l o b a m p o ) 海湾的一种新的 海绵( d y s i d e as p - 2 ) 中分离得到4 个新的化合物。其中两个化合物对a - 5 2 9 ( ) k 肺癌 细胞) 、h t - 2 9 ( ) k 结肠癌细胞) 和m d a - m b 2 3 1 ( 人乳腺癌细胞) 有较好的细胞毒活 性网。2 0 0 7 年，r u b i o 等从采集自巴布亚新几内亚的m i l n e 海湾的海绵 ( c a c o s p o n g i as p ) 中分离得到一个新的化合物( + ) 一i s o j a s p i ca c i d 2 4 。该化合物具 有较强的抗表皮葡萄球菌( s e p i d e r m i d i s ) 活性。 此外，还从软体动物、红藻、蓝藻和绿藻等海洋动植物中分离得到不少结构 新颖活性化合物 2 s - i s 。在s a l o m o n 等2 0 0 4 年的综述中，2 4 个源自海洋生物并进 入临床或临床前研究的化合物中，有2 3 个来自海洋动物嘲。 已有的研究结果表明，海洋动植物可产生结构新颖的化合物，是先导化合物 或新药的重要来源。但利用海洋动植物天然产物开发药物也受到了多种因素的制 约 2 s - 3 0 ：首先，绝大多活性天然产物在原生海洋动植物中仅有微量存在，加上因 种类、产地、季节不同，其量与质都有明显的变化，因此，由原生海洋动植物直 接提取化合物的方式很难满足药物开发的要求。其次，野生的海洋动植物在自然 界存在的数量不多，作为药源很难满足生产需求，而且大量采集会造成自然生态 环境的破坏，同时很多产活性化合物的海洋动植物生长环境特殊，人工养殖成本 高；此外，由原生海洋动植物产生的活性物质往往结构也比较复杂，因此通过人 工全合成获得目标化合物也相当困难。 海洋微生物也是海洋生物的重要成员，这类海洋生物不但物种多样性比海洋 动植物更丰富，而且与其他海洋生物一样可产生与陆栖生物结构不同的药理活性 物质。此外，海洋微生物还具有可利用现代微生物发酵技术进行生产、不会破坏 生态环境、无原材料的后顾之忧、较易实现产业化等优势，被认为是最具开发前 景的可持续性利用药源。因此，近年来，国外许多研究单位及大制药企业已将海 洋天然产物的研发重点转向海洋微生物。 3 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 2 海洋放线菌资源及其活性代谢产物的研究 在微生物中，放线菌是天然产物研究的重要类群。原核微生物5 3 个门中， 只有其中的5 个门能产生各种生物活性化合物的。在这5 个门中，放线菌门的放 线菌目( a c t i n o m y c e t a l e s ) 的微生物( 通常称为放线菌) 产生了大约7 0 0 0 个具有抗 菌、抗肿瘤等活性的化合物，而其中的8 0 是由链霉菌产生的。放线菌具有无 可比拟的生物合成能力，在已知的抗生素、抗肿瘤药物、酶抑制剂和免疫抑制剂 等有生物活性的次级代谢产物中有一半都来自放线菌唧铷。 在过去五十多年里，人类开发放线菌天然产物药物的重点一直集中在陆生资 源，现有的已上市的放线菌来源的天然产物药物大多数也都来自陆生放线菌。然 而，随着陆地放线菌资源开发利用日趋达到极限，目前从陆生放线菌代谢产物中 发现新药或先导化合物的几率大幅度地下降。因此，自上世纪8 0 年代以来，人 们开始重视海洋放线茵的研究开发嗍。经过二十几年来的努力，许多新的海洋 放线菌类群被发现，从海洋放线菌中分离得到许多结构新颖生物活性强的代谢产 物。 2 1 海洋放线菌的分布 海洋放线菌在海洋中有着广泛的分布，而且其栖息地类型多样。从海洋深渊 到表面，在海洋的各种深度都有放线菌的分布。 a g o g u e 等了从法国及西班牙海域中采集y 3 0 多个海洋微表层( s m l ) 的海水 样品，并研究其中可培养微生物的种群，发现放线菌在所研究的样品中都有分布， 且是主要类群之一网。 从海洋动植物体中也能找到与其共附生的放线菌。中科院大连化学物理所的 张海涛等从采集自黄海海域的繁茂膜海绵( h y m e n i a c i d o np e r z e v e ) d p 分离至l j l0 6 株放线茵。通过16 s r n a ；基因扩增片断长度多态性分析发现这些可培养的放线菌 分别属于链霉菌属和小单孢菌属等7 个不同的属，其中有几株可能是新种嗍。清 华大学的张荣庆等从采集自渤海的；可豚( f u g ur u b 咖e s ) 的卵巢中分离j u t 能产 河豚毒素的拟诺卡氏属菌株( n o c a r d i o p s i sd a s s o n v i l l e ) 3 5 。 在深海海水中也能发现放线菌。g r o s s a r t 等从德国沃顿海( w a d d e ns e a ) 收 集了深海海水，这些海水样品中可培养微生物有1 0 是放线菌，同时这些放线菌 中有8 0 具有抗菌活性闭。 4 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 海洋底泥是海洋放线菌重要的栖息地。m a l d o n a d o 等从日本海沟、c a n a r y 4 海盆和挪威海湾采集了底泥样品，从中分离到了8 0 0 多株放线菌，其中包括一些 稀有放线菌。这些稀有放线菌一般的方法难以培养，并一度认为不存在于海洋底 泥中。他们的实验证实了海洋底泥放线菌具有丰富的多样性网。 为了寻找新的放线菌，各种各样来自海洋的样品被采集和研究。从深海海床 到浅海的珊瑚礁、从海洋底泥到海洋无脊椎动物和植物，各种各样的海洋样品作 为分离筛选海洋放线菌的研究对象。在各国科学家的努力下，许多新的放线菌种 群被发现。2 0 0 4 年，m a g a r v e r y 等从巴布亚新几内亚的俾斯麦群岛和所罗门群岛 的海域中采集了1 9 2 个底泥样品，用人造海水配制的合成培养基筛选其中的放线 菌。从中分离得j ! j j l 0 2 株放线菌，并通过形态分析、细胞化学成分分析和1 6 s r r n a 基因序列等分子生物学的方法证明了其中有两个属于小单孢菌科( m i c r o m o n o s p o r a c e a e ) 的新属，其中一个新属被命名为。s o l w a r a s p o r d 期。在他们分到的7 5 株。s 棚s 卢l d 眉冲有抗真菌、抗细菌或细胞毒等活性的菌株达到8 0 ，其中有 4 株的代谢产物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( m r s a ) 和耐万古霉素肠球菌( v r 日 有抑制活性。 2 0 0 4 年，f i e d l e r 和r i e d l i n g e r 等从日本海2 8 9 米处收集到的底泥中分离到 一株十分稀有的放线菌删。这株放线菌属于一个十分新的属垤m ，c o s 僻) o 陀 属，该属的第一个菌株v e r r u c o s i s p o r ag i f h o r n e n s i sd s m4 4 3 3 7 在19 9 8 年才 被描述。他们通过形态分类法、化学分类法和16 s r r n a 基因序列测序等方法证 实他们分离到的编号为a b 18 0 3 2 的放线菌是v e r r u c o s i s p o r a 属的第二个被发 现的菌株。 s c r i p p s 海洋研究所f e n i c a l 课题组从多种海洋样品中分离到了许多放线菌， 从中发现了1 3 个( m a r l 1 3 ) 海洋放线菌的新类群，其中包括了被命名为 s a l i n o s p o r a 和m a r i n o p h i l u s 的两个新的属，而另外的”个类群可能是新的属 或亚属【删。这13 个类群分别属于放线菌目的6 个科。m a r 1 ( 即s a l i n o s p o r a ) 属于小单孢菌科，m a r 一2 ( m a r i n o p h i l u s ) 、3 、4 、8 属于放线菌科，m a r - 5 、6 、 1 0 属于高温单孢菌科( t h e r m o m o n o s p o r a c e a e ) ，m a r 7 属于诺卡氏菌科 ( n o c a r d i a c e a e ) ，m a r 一9 和11 属于拟诺卡氏菌科( n o c a r d i o p s a c e a e ) ，而m a r 一12 和1 3 属于假诺卡氏菌科( p s e u d o n o c a r d i a c e a e ) 。该课题组还报道了s a l i n o s p o r a 5 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 的3 个种，它们分别是s t r o p i a 、s a r e n i c o l a 和s - p a c i f i c a 。在该课题组研究 的10 0 多株s a l i n o s p o r a 菌株中，超过8 0 的菌株具有抑制人肿瘤细胞生长的 活性，超过3 5 的菌株抑制人病原耐药茵的活性。 2 2 海洋放线菌活性代谢产物的研究 海洋放线菌在海洋中有着广泛的分布，有着多种多样的生境。海洋放线菌的 类群也多种多样，物种的多样性导致了化学的多样性。已有的研究结果表明，海 洋放线菌蕴涵着极其丰富的化合物资源，已从中分离得到许多结构新颖，生物活 性高的化合物。 2 2 1 抗肿瘤活性化合物 寻找新的抗肿瘤的化合物一直以来都是天然产物研究的一个重点。近年来人 们从海洋放线菌中发现了多种具有抗肿瘤的活性物质。其中有些化合物不但结构 独特，而且具有很强的细胞毒活性，具有良好的开发前景。 近几年人们从海洋链霉菌中分离到不少抗肿瘤化合物。y a m a d a 等从分离自 布氏海猪鱼( h a l i c h o e r e sb l e e k e n ) 的吸水链霉菌s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s o u p s - n p 9 2 中分离得到一个新的大环内酯化合物h a l i c h o b l e l i d e ( 1 ) 4 1 1 。化合物 1 对p 3 8 8 ( 1 刍血病细胞) 等肿瘤细胞有很强的细胞毒活性。 l l o p e z 等从一株分离白海洋的放线菌中分离得到3 个新的吲哚类化合物 2 _ 4 4 2 。该菌株分离自墨西哥的一种无脊椎动物，通过形态学分析、脂肪酸测定 和1 6 s r d n a 测序的方法鉴定该放线菌属于链霉菌属。测定了这三个化合物对1 4 株肿瘤细胞的细胞毒活性，化合物2 对白血病肿瘤细胞k - 5 6 2 的g l s o ( 半数生长 6 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 抑制浓度) 是8 4 6l 上r n o l l ：化合物3 对所有测试细胞株都有很强的细胞毒活性。 2r = c h 2 0 h 3r = c h = n o h 4r = c n r 5r = c h 3 6r = c h z c h 3 r s t r i z k e 等从一株分离自红树林底泥的白浅灰链霉菌b 6 0 0 7 中分离得到两个 新的己内酯类化合物5 和6 嗍。化合物5 对h m 0 2 ( 胃癌细胞) 、h e p g 2 ( 肝癌细 胞) 和m c f 7 ( - 孚l 腺癌细胞) 的g l s o 分别是2 7l 工m o l l 、2 2l m l o l l 和0 11l m l o l l ， 对这些细胞的t g i ( 1 0 0 地抑制细胞生长的浓度) 分别是6 1i i m o l l 、6 8i j x n o l l 和4 0i 土r n o l l 。化合物6 对h m 0 2 、h e p g 2 和m c f 7 的g 分别是1 9l m 1 0 l l 、 1 4l j j r n o l l 和0 12 “m o l l ，其t g i 是5 6l 皿n o l l 、5 7i i m o l l 和2 6 “m o l l 。 李富超等从一株分离自中国胶州湾底泥的海洋链霉菌m 0 4 5 中分离得到两 个新的化合物c h i n i k o m y c i n s a ( 7 ) 和b ( 8 ) 嗍。化合物7 和8 对m a x f4 0 1n l ( 乳 腺癌细胞) 的i c 5 0 ( 半数抑制浓度) 分别为2 4 1p g m l 和3 0 4l 且g m l ，它们对l x f a 6 2 9 l ( 肺癌细胞) 、l x f l5 2 9 l ( , q i 每癌细胞) 和u x f11 3 8 l ( 子宫癌细胞) 的i c s o 均大 于6 0l 上g m l ，表明这两个化合物对肿瘤细胞具有一定的选择毒性。 oo h 7 h n h n o o oo 8 a s o l k a r 等从一株分离自圣地亚哥沿海底泥的链霉菌c n q 0 8 5 中分离得到 7 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 4 个新的有一定细胞毒活性的化合物d a r y a m i d e sa - c ( 9 - 1 1 ) 和含有两个双键的 氨基酸( 1 2 ) 【硐，这四个化合物结构与抗肿瘤药物手霉素类似。测试了这四个化合 物的抗菌活性，它们对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌没明显的抗菌活性，化合物 9 和1 0 有微弱的抗真菌活性。化合物9 有很好的细胞毒活性，对人结肠癌细胞 h t c - 11 6 的i c s o 为3 t 5l g m l 。 她一 9 o 1 1 1 h o 一 o h 2 n 丫ov 吖i m i t c h e l l 等从一株链霉菌中分离得到一个带侧链的2 2 元大环内酰氨 a u r e o v e r t i c i l l a c t a m ( 1 3 ) i 删。这株放线菌先液体培养4 天，然后在向培养物加入 树脂x a d 1 6 后再培养3d 。化合物1 3 从其发酵液的萃取相中分离得到。化合 物1 3 表现出较好的细胞毒活性，它对h t - 2 9 ( 人结肠瘤细胞) 、b 1 6 - f 1 0 ( 鼠黑色 素瘤细胞) 、j u r k a t ( 人白血病癌细胞) 的e c s o 分别是3 6t m l o l l 、2 2p , m o l l 和 2 3l m o l l 。 o h 1 3 8 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 m a c h e r l a 等从一株分离自阿拉斯加底泥中的链霉菌n p s 0 0 1 5 8 3 中分离得 到了3 个新的萜类化合物g l a c i a p y r r o l e sa ( 1 4 ) 、b ( 1 5 ) 和c ( 1 6 ) 4 7 1 。化合物1 4 有一定的细胞毒活性，对h t - 2 9 ( 人结肠癌肿瘤细胞) 和b 1 6 - f i o ( 人黑色素瘤细 胞) 的i c s o 是1 8 0 m o l l 。 1 4 从海洋小单孢菌中也分离到新的抗肿瘤化合物。h e 等从一株分离自海鞘 ( p o l y s y n c r a t o n ，纳0 s 打d f 的小单孢菌属新种( m i c r o m o n o s p o r ai o m a i v i t i e n s i s ) 的放线菌中分离到两个新化合物l o m a i v i t i c i n sa ( 17 ) 和b ( 1 6 ) 1 4 田。 1 1 7 1 8 这两个化合物有很强的抑制肿瘤细胞活性，对2 4 株肿瘤细胞株的i c s o 为 0 0 1 9 8 n g m l 。他们的研究表明，化合物1 7 和1 8 对细胞d n a 有很强的损伤能 9 厦门大学硕士论文：海洋放线菌活性菌株的筛选及1 0 2 3 菌株次级代谢产物的初步研究 力，提示它们的作用机理可能与已知的阿霉素嵌合到d n a 双链的机理不一样。 进一步的实验证实化合物17 在还原性强的体系下能够剪切双链d n a 。 f e n i c a l 课题组发现了1 3 个( m a r l 1 3 ) 海洋放线菌的新类群，其中包括了 被命名为s a l i n o s p o r a 和m a r i n o p h i l u s 的两个新的属，他们从这些新筛选到的放 线茵中分离得到很多具有抗肿瘤活性的新化合物。其中，进入了一期临床研究的 抗肿瘤候选药物s a l i n o s p o r a m i d ea 是其中最受瞩目的一个。2 0 0 3 年该课题组 的f e l i n g 等了从新属s a l i n o s p o r a 中的一株菌s t r o p i c ac n b 3 9 2 中分离得到 了一个新化合物s a l i n o s p o r a m i d ea ( 1 9 ) 和另一已知的内酰氨类化合物 o m u r a l i d e ( 2 0 ) 【柏】。这株放线菌分离自巴哈马群岛c h u b 珊瑚礁的红树林底泥。 化合物1 9 对人肿瘤细胞有极强的选择毒性，对h c t - 11 6 ( 人结肠癌细胞) 的i c 5 0 达到1 1n g m l 。对n c i 的6 0 株测试细胞株的平均g l s o 低于1 0n m o l l ，对该 化合物敏感细胞株和耐受细胞株的l