（植物学专业论文）h2o2ca2在盐胁迫信号转导中的作用研究.pdf

河南大学预士学位论文 摘要 土壤盐渍化对我们农业生产造成的危害日益严重，而解决该问 题的主要措施是培育抗盐碱品种。因此，植物抗盐的生理机制就成为 目前该领域的研究热点。本文以抗性不同的两个小麦品种9 3 0 2 9 4 ( 不 抗盐碱) 和9 0 6 4 ( 抗盐碱) 为研究材料，用激光共聚焦扫描显微镜、 膜片钳、紫外可见分光光度计、电导仪等实验技术研究了盐胁迫下 小麦细胞的生理反应及信号转导途径，得到了如下结果： l 用d d s j 一3 0 s 型电导仪、紫外一可见分光光度计测定n a c i 对膜 的伤害。陷果显示，当用1 0 0 m m o l l n a c i 处理材料时，9 3 0 2 9 # 的膜 渗漏率、m d a 含量增加。盐处理时另加o 4 m m o l l c a 2 + 或l0 m m o l l c a 2 + 后，其渗漏率、m d a 含量增加幅度减小：而且膜渗漏率、 m d a 含量的变化趋势一致。这说明n a c i 对膜的伤害是膜脂过氧化 作用引起的，外源c f + 能够维持膜稳定性和完整性，从而起到缓解 盐害的作用。、 2 n a c i 作用下，m d a 含量、膜透性均有所增加，但外加2 m m o l l v c 时其增加幅度变小，说明n a c i 对膜的伤害可能是由活性氧介导的。 为了进一步证明这个问题，我们用c o n f o e a l 测定了盐胁迫下小麦根 毛内h 2 0 2 含量的变化。穗果发现，用1 0 0 m m o u l n a c l 处理时，9 3 0 2 9 、 品种的根毛内h ：o 。含量突然增加，且一直呈上升趋势，而外加c a 2 + 时h ：o ：含量增加的幅度变小。这同样可以说明盐胁迫下h ：o ：的产生 是导致膜脂过氧化的主要原因。耐盐碱的9 0 6 4 品种在受到n a c l 处理 时，其根毛内h 2 0 ：含量有一个猝发，然后又逐渐呈下降趋势，但是 盐胁追下，膜透性和m d a 含量几乎都没有变化。因此，在9 0 6 * 细胞 内h ：o 。可能仅仅是作为一种信 反应，从而达到抗盐的自的：厂 号，由它启动了胞内一系列的防御 3 用c o n f o c a l 技术研究了盐胁迫下胞内 7 、 的信号转导途径。蛹 l o o m m o l l n a c i 处理小麦9 0 6 4 ，发现根毛细胞内h 2 0 2 、c a 2 + 含量均 增加；用l o m o l j l h ：o ：直接处理小麦幼根时胞内c a 2 + 浓度也增加， 河南大学硕士学位论文 且变化情况和1 0 0 m m o l l n a c i 处理时基本一致。但是在孵育荧光探 针f l u o 3 a m 时加入c a t 发现n a c i 处理时胞内c a 2 + 含量变化不明 显。这说明盐胁迫下c a 2 + 水平的增加可能是由h ：0 ：介导的。7 关键词：2 盐胁迫、c a n 、h 2 0 ：、 信号转导、小麦 2 一 塑堂查堂婴圭堂垡丝茎一一 ab s t r a c t s a l i n i t y s t r e s si so n eo ft h em o s ts e r i o u sf a c t o r sl i m i t i n g t h e p r o d u c t i y i t y o f a g r i c u l t u r a l c r o p s s e l e c t i o na n d b r e e d i n g f o rs a l t t o l e r a n c ei nap a r t i c u l a rc r o ps p e c i e sw i l lb ef a c i l i t a t e di fw e c a ni d e n t i f y a n du n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fs a l tt o l e r a n c ea n dt o x i c i t y f o rt h a t s p e c i e s i no u rp a p e r s ，w ef o c u s e do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh 2 0 2a n d c a 2 + i nn a c is t r e s ss i g n a lt r a n s d u c t i o nw a yb yt w os p e c i e so fw h e a tt h a t h a v i n gd i f f e r e n tr e s i s t a n c et os a l t f i r s t l y ，w es t u d i e dt h ed a m a g eo fm e m b r a n eu n d e rn a c is t r e s s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em e m b r a n ep e r m e a b i l i t yo fw i l dw h e a t ( 9 3 0 2 9 “) i s i n c r e a s i n g w h e nt r e a t e dw i t h10 0 m m o l ln a c iw h e nc o m p l e m e n t e d w i t h04o r10 m m o l lc a ”t h e i n c r e a s i n ga m p l i t u d e o fm e m b r a n e p e r m e a b i l i t yi sd e c r e a s e d s oe x o g e n o u se a “c a nm a i n t a i nt h ei n t e g r i t y a n ds t a b i l i t yo fm e m b r a n e w ea l s om e a s u r e dt h ec o n t e n to fm d a ，o n eo f m e m b r a n e l i p i dp e r o x i d a t ep r o d u c t s u n d e r s a l ts t r e s s b y u v s p e c t r o p h o t o m c t e r w i t hn a c is t r e s s ，m d ac o n t e n to f9 3 0 2 9 “i n c r e a s e d ， a n di th a dt h es i m i l a rt r e n dw i t hm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ed a m a g eo fm e m b r a n ei si n d u c e db ym e m b r a n el i p i d p e r o x i d a t i o n s e c o n d l y ，w e f o u n dt h a tw h e nw h e a tw a s d a m a g e d ，t h e m d a c o n c e n t r a t i o nw a sr a i s e db u tw h e ns u p p l e m e n t e dw i t h2 m m o l lv e ，t h e s p e e do fi n e r e a s m e n tw a sl o w e r t h i si m p l i e dt h a t i t m a yb ea o s t h a t d a m a g e dt h em e m b r a n es y s t e m t oi n v e s t i g a t e dt h ec a u s ef u r t h e r ，w e m e a s u r e dt h eh 2 0 2c o n t e n to fr o o th a i r so f9 3 0 2 9 ”b yc o n f o c a l t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee o u t e n to fh 2 0 2i i n c r e a s i n gp r o c e s s i v e l yw h e n t r e a t e dw i t h1 0 0 m m o l ln a c i i ta l s ot e s t i f i e dt h a th 2 0 2d a m a g e dt h e m e m b r a n e b u tt o9 0 6 4 ，t h em d ac o n t e n th a dn o tv i s i b l ei n c r e a s e m e u t a n dt h eh 2 0 2c o n t e n th a dab u r s tw h e nt r e a t e dw i t hn a c ia n dt h e nf e l l 河南大学硕士学位论文 g r a d u a l l y s oh 2 0 2 ，i n d u c e db yn a c i ，m a yb eas i g n a lm o l e c u l a r ，a n d t h e nc a u s e das e r i e so fd e f e n s i v er e a c t i o n t h i r d l y ，w es t u d i e dt h es i g n a lt r a n s d u c t i o no fr o o th a i ru n d e rs t r e s s t h eh 2 0 2a n dc a ”l e v e la r ea l lr a i s e dw h e n c h a l l e n g e d w i t hn a c i t r e a t e dw i t h1 0 - 5 m m o l lh 2 0 2d i r e c t l y ，t h ec a 2 + c o n t e n ta l s or a i s e da n d h a dt h es i m i l a rt e n d e n c yw i t ht h a tt r e a t e dw i t hn a c ia l o n eb u tt h ee f f e c t o nf l u e 3f l u o r e s c e n c ew a sa t t e n u a t e db yp r e t r e a t m e n tw i t hc a t s ow e c a nc o n c l u d et h es i g n a lt r a n d u c t i o nw a yo fs a l i n i t ys t r e s s n a c ic a u s e s h 2 0 2b u r s t ，t h e ni n d u c e sc a ”l e v e lc h a n g e k e yw o r d s ：s a l i n i t ys t r e s sc a 2 + h 2 0 2 s i g n a lt r a n s d u t i o n w h e a t 河南大学硕士学位论文 a o s a s a c a r c a t d g d m s o g r i p ， m d a p l p i p ， p o d s o d t b a a c t i v eo x y g e ns p e c i e s a s c o r b i ca c i d c a f l o t e o e c a t a l a s e d i a c y l g l y c e r o l 缩写 d i m e t h y ls u l f o x i d e g l u t a t h i o n er e d n c t a s e l n o s i t o l 1 ，4 ，5 一t r i p h o s p h a t e m a l o n d i a l d e h y d e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h a t i d y i i n o s i t o l - 4 ，5 - b i s p h o s p h a t e p e r o x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u a s e t h i o b a r b i t u r i ca c i d 活性氧 抗坏血酸 胡萝h 索 过氧化氢酶 二酰甘油 二甲基亚砜 谷胱甘肽还原酶 肌醇三磷酸 丙二醛 磷脂酰肌醇 磷脂酰肌醇= 磷酸 过氧化物酶 超氧化物歧化酶 硫代巴比妥酸 河南大学硕士学位论文 1 前言 近几十年来，随着现代化工业的迅猛发展和人口的急剧膨胀，我 国可耕地面积锐减。另外，在我国1 5 亿亩耕地中，盐碱地约占l 亿 亩，另外还有3 亿亩盐碱荒地；在灌溉地区，次生盐渍化田地还在继 续增加( 汤章城，1 9 9 2 ) 。这些盐碱地对我国农业生产造成的危害难 以估计。因此，如何开发和利用这些盐碱地对于增加我国农业生产， 促进国民经济发展，提高人民的物质生活水平，具有十分重要的意义。 在改良和利用盐渍土壤中，以往主要是采用淡水冲洗土壤的办 法，结果往往使土壤中的天然肥力降低，物理化学性质变劣，有时还 会出现对植物有害的残余盐类。有些地区没有淡水，用矿质化高的水 灌溉，结果更提高了植物体内的含盐量。这说明单纯依赖和强调土壤 的改良措施，而忽视生物学措施的研究是不妥当的。应当和生物学措 施一培养抗性品种、提高植物的抗盐性等结合起来，才能取得更大的 效果。而生物学措施的主要任务，就是要开展植物抗盐生理机制的研 究。 近年来有关耐盐性的研究也取得了明显的进展。菸草耐盐性细 胞系培育与再生植株成功、渗透调节基因的分离和转移、野生植物抗 盐基因的利用、盐生植物的开发等方面已获得可喜的成果。离子定位 技术的不断改进，从植物整体、器官、组织、细胞和分子等不同层次 上比较耐盐性不同的植物之间的生理差别。目前人们更加莺视盐分的 吸收、运输、分配、调节以及细胞膜结构功能和耐盐性的关系。 1 1 盐胁迫的种类及植物的抗盐性 盐胁迫对植物产生的伤害，一般可分为两类一原初盐害和次生 盐害( 见图1 ) 。在原初盐害中又可分为直接原初盐害和间接原初盐 害。直接原初盐害主要是指盐胁迫对质膜的直接影响。质膜作为外界 盐分进入细胞的第一道屏障，是植物有机体的活性部分最先接触到盐 胁迫的部位。质膜受到盐胁迫影响后，将发生一系列的胁变，它的组 分、透性、运输、离子流等都将受到影响而发生变化，佳膜的正常生 一6 一 河南大学硕士学位论文 理功能受到伤害。膜结构的破坏将进一步影响细胞的代谢，从而不同 程度地破坏细胞的生理功能，这就是间接原初盐害。 盐胁迫对植物产生的另一类盐害一次生盐害，是由于土壤盐分过 多，提高了土壤溶液的浓度，使土壤水势进一步降低，从而对植物产 生渗透胁迫，这种渗透胁迫可引起植物细胞脱水，膨压降低，使植物 生长受到抑制。另外，由于离子间的竞争引起的某种元素的缺乏，可 进一步干扰植物的新陈代谢。 m 女磊一蕊土卜墩，_ “、 随接盐害间接盐害，_ 一、 ( 质滕变化)( 代澍变化) 渗翟效应 营养缺乏 ll l 透性或运输变化_ i f 9 犬蛋j 质的疏 脱i 水 l 燃髓魏 i l 质的静电键强度 i 。一 i 降在膨压 离子外渗 t ：二：二： 酶活化或钝化生化抑制 其它脱水效应 l 图l 盐害类型及其相互关系 植物的抗盐性( s a l tr e s i s t a n c e ) 包括两方面，即避盐性( s a i t a v o i d a n c e ) 和耐盐性( s a l tt o l e r a n c e ) ，抗盐性= 避盐性+ 耐盐性。所 谓避盐性，即在盐胁迫和被盐胁迫植物之间设置某种障碍，从而防御 或部分防御胁迫作用。耐盐性是指植物承受全部或部分盐胁迫作用而 不引起或只引起比较小的伤害的能力。植物的耐盐性是一种复杂的性 河南大学硕士学位论文 状，具有生理生化方面的功能，受多个基因的控制，而且，环境和土 壤因索还强烈地影响着它的表达。植物抗盐性的大小不仅与外界条件 列植物施加的胁迫的大小( 盐浓度的大小) 有关，还与植物对外界胁 迫所作出的反应一胁变有关，即抗性( r e s i s t a n c e ) = 胁迫( s t r e s s ) 胁变( s t r a i n ) 。当胁迫不变时，胁变的程度即可表明植物的抗性，胁 变越小，抗性越大。显然减小胁迫对植物的作用的途径，主要是降 低胁迫和减小胁变。 一 1 2 盐胁迫对植物的伤害 i 2 1 盐胁迫引起的胞内生理生化反应 对于盐胁迫，高等植物有一系列的生理反应如细胞壁的变化， 蛋白质合成及钾离子含量的下降，钠及有机溶质如脯氨酸、甜菜碱、 多元醇的增加等等。高浓度的n a c i 可以置换质膜和细胞内膜系统所 结合的c a ”。膜所结合的离子中n a + c a 2 + 比增加，膜结构完整性及膜 功能发生改变，促进细胞内k + 、磷和有机溶质的外渗，细胞k + n a + 比下降，抑制液泡膜h + p p a s e ( 焦磷酸酶) 活性和胞质中h + 的跨膜 运输，跨液泡膜的p h 梯度下降，液泡碱化不利于n a + 在液泡内积 累，并且还诱导气孔关闭等。其中有些变化是适应性的，使植物对盐 胁迫产生抗性；但还有许多是盐胁迫直接或间接造成的伤害。 1 2 2 活性氧的产生与清除 活性氧( a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a o s ) 是指氧的某些代谢中间产 物及其衍生的含氧物质，具有较活泼的化学性质，主要包括超氧阴离 子( 0 2 。) 、过氧化氢( h ：o ：) 、单线态氧( 0 2 ) 、羟自由基( o h ) 等 ( f r i d o v i c h ，1 9 7 8 ) 。活性氧的形成与氧获得单一电子有关，可因酶 促或一般的氧化还原反应引起，其产生及代谢途径如图2 ( d o k e n ，1 9 9 7 ) 。过氧化物酶体、线粒体、叶绿体以及细胞质膜氧化还原系 统( p m r e d o xs y s t e m ) 等均是产生活性氧的重要部位( a u h & m u r p h y ， 1 9 9 5 ：l o w & m e r i d a 1 9 9 6 ) 。 河南大学硕士学位沦文 细 ! 信号传递+ 基因表达 瞍2 援性氧蚂产生足代谢进程p l a ：代表磷酸醑酶az tl o x 代曩腊氧合薛 r 代表有机酸，x 代表卤素，l 代表不饱和脂肪酸 环境胁迫导致活性氧的产生，主要包括h ：0 2 和0 2 。高水平的 话性氧导致膜脂过氧化，损伤生物大分子，诱导细胞死亡。同时，适 性氧也可以以有益的方式参与一些代谢过程( d o k e ，1 9 9 7 ) 。在活性氧 代谢过程中，由于h ：o ：存在的寿命长，具有较高的跨膜透性且能在 表皮细胞间迅速扩散( a l l a ne ta l ，1 9 9 7 ；a l v a r e ze ta l ，1 9 9 8 ) ，其作 为植物细胞氧化信号的研究已倍受关注( n e u e n s e h w a n d e rue t a l ，1 9 9 5 ) 。植物在外界环境胁迫的条件下( 如干旱、水淹、冷害等) 活性氧增加。有人认为h 2 0 ：可作为第二信使，启动系列反应。首 先发现h ：0 ：可促进气孔的关闭，是由于质膜流动性的改变所致( 邱 金龙等j9 9 8 ) 。同时h ：o ：可引起烟草细胞内游离c a 2 + 浓度的增加， 启动钙信使系统( l e v i n ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。近年来，随着植物病原体相互 作用的深入，h ：0 ：在植物抗病信号转导巾蝻作用研究已取得了重大 河南大学硕士学位论文 的进展，但这些研究主要是针对一些悬浮细胞，在某种程度上并不能 完令反映活体细胞的f 常代谢过聒! 。 生物体为了减轻和防止活性氧的毒害，已经形成了复杂的氧化 应激机制。细胞可以通过酶促反应如过氧化氢酶( c a t ) 、超氧化 物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 等 清除活性氧，也可以通过非酶促反应如还原性谷胱甘肽( g s h ) 、 抗坏血酸( a s a ) 和胡萝h 索( c a r ) 等系统，清除过量的活性氧 ( m e h e d ye t a 1 t1 9 9 6 ；s c a n d a l i o s ，1 9 9 3 ) 。c a t 、s o d 、p o d 、和 g r 等酶被称为防御酶( d e f e n s i v ee n z y m e ) ( s e a n d a l i o s ，1 9 9 3 ) 。c a r 、 g s h 、a s a 被称为内源抗氧化剂。由于活性氧易诱发膜脂过氧化， 因此，保护酶和内源抗氧化剂也被称为膜保护系统( s a l i n ，1 9 8 7 ) 。 1 2 3 活性氧伤害 早在8 0 年代以前，就发现盐渍影响植物的光合、呼吸和蒸腾等 生理过程及蛋白质、核酸和脂类代谢，影响细胞的各种氧化还原反应。 直到8 0 年代才逐渐重视对盐渍下植物活性氧作用的研究，但对盐渍 下植物活性氧的产生和清除情况缺乏系统的认识。 在六十年代末m c c o r d 和f r i d o v i c h ( 1 9 6 9 ) 指出了生物自由基伤 害假说来解释膜伤害现象，引起了许多学者的重视。迄今已形成了生 物氧毒害的超氧物学说，其主要内容是：在通常情况下，需氧生物在 还原o ：到h 。0 的过程中会产生有毒害作用的氧自由基o ，一，而且还 可以诱导其它毒物，如过氧化氢( h ：0 2 ) 及羟自由基( o h ) ( h a l l i w e l l e t a 1 ，1 9 8 9 ) 。在正常代谢过程中植物体细胞内自由基的产生和清 除处于动态平衡状态，因此不会对植物细胞造成伤害。而当植物处于 逆境胁迫下，这种平衡就会被打破。此时，植物细胞中产生的活性氧 不能被及时地转换和清除，而是在细胞中积累这样就会破坏生物大 分子，影响植物体内的代谢与调控。首先易遭受攻击的便是膜系统， 膜中的不饱和脂肪酸被过氧化分解，膜中的蛋白质分子被引发脱去h + 而不断发生加成反应，最后导致细胞膜系统发生变性。丙二醛( m d a ) 一l ( 卜 河南大学顿上学位论文 就是脂质过氧化的二e 要产物之一。人们常以m d a 积累量作为判断膜 脂过氧化作用的一个重要指标( s t e w a r te ta l ，1 9 8 0 ) 。许多关于逆境 的研究结果表示，活性氧( 包括h ：o 。) 介导了植物膜脂的过氧化作 用( 陈拓等，1 9 9 9 ；陈小勇等，1 9 9 4 ；许长成等，1 9 9 3 ；m i s h r a n pe t a l 、1 9 9 3 ) 。活性氧代谢失调是逆境下需氧生物受害的普遍表现，也是 逆境损伤的重要原因。 盐渍一般抑制植物的呼吸，但对磷酸戊糖途径和糖酵解途径有刺 激作用，对0 2 吸收影响也小但由于呼吸链电子传递受阻和n r 、n i r 及其它还原酶受抑制，也引起n a d p h + 或n a d p + 累积。刺激h ，o ，和 0 ：产生。h e r n a n d e z 等发现，盐渍也使细胞色素c 氧化酶活性降低， 也引起o ：一累积。在盐胁迫下植物的光能利用和二氧化碳同化受抑 制，促进了活性氧的生成和脂质过氧化，并对蛋白质和核酸等造成损 伤。水稻、大麦和小麦( 龚明等，l9 8 9 ) 的幼茁在盐胁迫下叶片细胞 膜渗漏率的增加与脂质过氧化产物丙二醛( m d a ) 含量的增加呈极 显著的正相关，并且与耐盐性的基因型密切相关。高盐胁迫下植物叶 片活性氧的大量积累可能与c a t 活性下降相关，保持高水平的s o d 和p o x 活性是自然盐渍环境巾盐生植物生存所必需的( m o o n sae t a 1 1 9 9 5 ) 。 盐渍也可抑制正常的光合磷酸化，n a c i 刺激环式光合磷酸化， 但抑制n a d p h 形成，因而抑制c o ：同化。s a t o h 等研究发现盐渍抑 制水光解后电子向p s i i 的传递，光能从p s i i 向p si 转移和电子从p s i 向n a d p + 的流动。盐渍还刺激乙醇酸氧化酶，使光呼吸增加，但 也引起光呼吸中间产物累积，可能与叶绿体结构和功能受损导致光呼 吸循环反应受阻有关。s c h w a r t z 等就发现叶绿体的光氧化接替抑制 羧基丙酮酸还原酶( h p r ) 等光呼吸酶类的生成，正常光合过程受阻 引起p q h ! 、f d 和三线杏叶绿紊3 c h l 累积，促进活性氧生成： i ) 2 p q h 2 + o2 - 一2 p q h + h 2 0 ： 2 p q h + 2 0 2 2 p q + o2 。+ h 2 0 2 一i i 河南大学硕士学位论文 2 ) f d 。+ 0 2 一0 2 + f d 3 ) 3 c h l + 0 2 一c h l + 0 2 20 2 - + 2 h + 一h 2 0 2 + 0 2 o 2 - + a + 一a + 0 2 而光呼吸异常则可能导致n a d h + 累积，与乙醇中毒相似，可引起活 性氧形成： n a d h + + 2 0 2 一n a d + + h 2 0 2 + 0 2 。 i 3 盐胁迫过程中c a 2 + 的作用 1 3 1 外源c a 2 + 对盐害的缓解作用 淡土植物的抗盐性取决于根系对盐分的选择性吸收和盐分在器 官、组织和细胞三个层次的区域化( e p s t e i n 1 9 8 7 ) 。汪宗立等( 1 9 9 0 ) 认为盐分胁迫条件下植物体内k + 、n a + 积累的数量和比例是不同植物 问膜伤害存在差异的原因。盐离子在植物体内的有效分布和积累，是 植物提高其抗盐性的重要机制( s h a r m a ，1 9 9 5 ) 。在维持细胞质膜结构 的稳定性和完整性方面，c a 2 + 具有非常重要的作用。c a 2 + 减轻盐害及 其降低盐害机制的报道较多，证实其可减轻黄瓜( 史跃林等，1 9 9 5 ) 、 玉米( 龚明等，1 9 9 4 ) 、h 薯、石榴、桃( 汪良驹等，1 9 9 5 ) 、棉花( 赵 可夫等，1 9 8 9 ) 、高粱( 裴真明1 9 9 5 ) 、菠菜、菜豆、水稻和小麦( 赵 可夫等，1 9 9 3 ) 的盐害。对于其作用机理的认识可归纳为：( 1 ) 改变 膜脂组分，降低不饱和脂肪酸指数( 吕芝香等，1 9 9 3 ；赵可夫等，1 9 9 3 ) ： ( 2 ) 降低膜脂过氧化作用；( 3 ) 提高s o d 酶活性：( 4 ) 调节a t p 酶活性和改善离子运输不平衡状态( 吕芝香等，1 9 9 3 ：r a s i c a l d o g o n a fe ta 1 ，1 9 8 0 ) ；( 5 ) 降低细胞内n a + 、c l 一含量和k + 的外渗，抑制n a + 、 m g “的吸收( c r a m e ro r e ta l ，1 9 8 6 ；l a h a y er a ，1 9 7 1 ；l e v i t tj ，1 9 8 0 ； l e wr re ta 1 ，1 9 9 0 ) 。但y e o 等( 1 9 8 5 ) 报道，钙对于维持膜稳定性 无作用。 1 3 2c a 2 + 信使系统与盐胁迫 自从在动物中提出第二信使c a m p 概念后，人们在动物细胞的 一1 2 河南大学坷! 士学位论文 研究中确认r 局一个胞内信号分子c a “。h e i l b r u n n 在1 9 3 7 - 1 9 5 2 年 发表的著作中提出了c a ：+ 在生物系统中复杂和多功能性的观点，认 为利用c a z + 是所有活细胞的基本特征。在他提出的“细胞刺激理论” 中认为：当细胞受到备种刺激时，细胞内原来浓度很低的c a 2 + 水平 明显增高。 钙离子起作用是基于细胞溶质中c a 2 + 浓度时空依赖性的变化。 因此测定静止态和激发态细胞溶质中的c a 2 + 浓度十分重要。理论 一卜，对细胞内的c a 2 + 测定方法有如下要求：第一，在使用c a 2 + 特定 指示剂时，指示剂对c a 2 专一结合性强、亲和力高，可以测定低c a 2 + 浓度；第二，应能获得c a 2 + 浓度的绝对值；第三，对c a 2 + 水平改变 的反应必须比细胞内c a 2 + 信号引起相关的生理反应要快；第四，指 示剂与c a 2 + 结合不损害细胞内正常的生理生化过程：第五，容易进 入细胞并在细胞溶质内扩散，但为了测定细胞溶质部分的c a ：+ 浓度， 指示荆不应跨过内膜系统而进入细胞器；第六，有可能显示胞内c a 2 + 分布( 孙大业等，1 9 9 8 ) 。实际上，符合所有上述要求并适合各种试 验要求的方法是很困难的。人们常常根据各种方法的优点和局限性， 根据具体的实际要求选择不同的方法。 c a 2 + 对植物细胞的结构和生理功能有重要作用，能维持细胞壁、 细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，参与胞内稳态( h o m e s t a s i s ) 和生长 发育的调节过程，在细胞内起第二信使的作用。触摸、病原物侵染、 植物激素、逆境( 包括盐胁迫、氧化胁迫、 氐温、高温、干旱等) 均 能引起胞内c a 2 + 水平的变化。这种变化通过启动胞内生理生化过程， 超着传递和放大信号的作用( b u s hd s ，1 9 9 5 ) 。c a 2 + 水平的变化包括 两种情况：是受到环境信号刺激后，胞内c a 2 + 浓度上升( 瞬间上 升或持续上升) 或下降( 瞬间降低或持续降低) 。其中以c a ：+ 浓度上 升这一方式居多( 如盐胁迫、冷激、病原物侵染等) ( b e t h k ep cc t aj ，j 9 9 5 ) 。另一种是c a 2 + 浓度振荡( o s c i l l a t i o n ) 。振荡的方式( 如振 幅、振频) 取决于接受信号的细胞类型以及刺激的强度和性质( 章文 一1 3 河南大学硕士学位论文 华等，2 0 0 0 ) 。 采用c a 2 + 荧光探针l n d o 1 ，l y n c h 等( 1 9 8 9 ) 证实，盐胁迫诱导 蕞米原生质佛胞内c a z + 水平升高，j 1 ：持续几分钟。这与高温胁迫相 似。触摸和冷激在l5 s 内引起植物细胞质中水平一个尖峰，缺氧诱导 胞质c a 2 + 水平的提高达几小时。备种逆境诱导的c a ”水平提高在时 空、程度上的差异可能是植物细胞区分逆境种类，诱导不同基因表达 以及适应相应逆境的机理之一( k n i g h tm re ta l ，1 9 9 1 ) 。盐胁迫诱导 c a 2 + 水平的变化依赖于盐浓度，当介质中n a c i 浓度为9 0 1 2 0 m m o l l 时，c a 2 + 水平陡然上升，超过这个浓度范围则变化不明显，表明胁迫 信号感受系统受特殊的胁迫水平所激活。 植物细胞通过c a 。+ 通道和c a 2 + 泵调节胞内c a 2 + 水平变化。植物细 胞质膜和液泡膜上存在c a “通道，而内质网上是否存在c a z + 通道尚 有争议。目前发现在质膜上存在三种能让c a z + 进入胞内的通道：一 是d i h y d r o p r y i d i n e ( d h p ) 敏感的c a “通道，当膜去极化时被激活；一 是拉伸激活的c a ”选择性通道；还有一类是非选择性的阳离子通道， 吐三能让少量的c a 2 + 进入胞内( m o a i n s hm re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。液泡膜上也 有三类c a 2 + 通道：类是受液泡膜两侧膜电位控制的c a 2 + 通道，当 液泡内与细胞质之间的膜电势差为正值时，该通道打开；一类是受环 腺苷二磷酸( c a d p r ) 门控的c a 2 + 通道；还有一类受i p 、门控的c a 2 + 通道。c a 2 + 经通道从液泡进入胞质( m u i ls re ta l ，1 9 9 7 ) 。 在动物上，环境或激素信号通过质膜上的受体激活磷脂酶c 。这 种激活作用可以是直接的，如酪氨酸激酶偶联受体直接激活磷腊酶 c ，或者需要通过g t p 结合蛋自( g 蛋白) 。一旦被激活，磷脂酶c 水解p i p 。产生i 和二酯酰甘油( d g ) 。前者可以起第二信使的作 用，! i 能促使胞内c a “库释放c a 2 + ( b e t h k ep c ，】9 9 5 ) 。早在1 9 5 5 年 就发现植物中存在磷脂酶c 。昂近研究发现，当植物受到光、a b a 、 植物毒素等刺激时。细胞内f 玛水平增加。利用c a 2 + 显像法证实，当 笼形( c a g e d ) i p 3 导入胞内后，诱导鸭趾草保卫细胞以及小麦根原生 一1 4 一 河南大学硕士学位论文 质休内c a ：+ 水平瞬时增加，这提示ip 3 诱导胞内钙库释放c a ”。采用 电生理和生化手段，发现i n 能诱导液泡膜微囊，甚至完整液泡释放 c a ”，这又说明液泡可能是受l p ，调控的主要c a 2 + 库。另外，人们从 甜菜和大豆中发现并已得到捉纯的i 结合蛋白，此种结合蛋白存在 于植物膜系统上( s c a n l o nc he ta l ，1 9 9 6 ) 。结合上述研究成果，人们 认为i 结合蛋白存在于液泡膜上，其生理作用是门控c a 2 + 通道。l y n c h ( 1 9 8 9 ) 等实验证明，l j 降低诱导的c a 2 + 水平的增加。由于l i 是抑 制磷酸肌醇再生的，因此推测由n a c i 诱导的c a 2 + 的增加来源于胞内 c a 2 + 库。： 近来利用分予生物学手段对c a “信使系统调节n a + k + 选择吸收 的研究取得了突破性的进展。据报道，拟南芥s o s 3 突变体对n a + 超 敏感。在盐胁迫下，它比野生型植株积累更多的n a + ，同时抑制k + 吸收。增加培养基中的c a 2 + 水平能部分抑制s o s 3 植株对n a + 的超敏 感作用，同时完全逆转k + 吸收的抑制作用。这一结果提示s o s 3 基 因产物可能是盐胁迫下c a 2 + 作用途径中的重要组成部分。测序分析 表明，s o s 3 蛋白可能含有3 个c a ”结合位点。s o s 3 突变体由于缺失 一个高度保守的区域而不能促成c a 2 + 与第2 个e f 手形c a 2 + 结合位点 的结台。通过测序比较发现，s o s 3 基因产物与钙调磷酸酶b 亚基( 具 有4 个e f 手形的c a 2 + 结合位点) 和动物神经c a ：+ 传感蛋白很相似。 盐胁迫下，酵母细胞中的钙调磷酸酶能启动由低亲和向高亲和k + 吸 收系统的转换，从而提高n a + - k + 选择吸收。而位于动物脑和光受体 细胞中的传感蛋白则主要起激活蛋白磷酸酶或抑制蛋白激酶的作用。 因此，l i u 和z h u ( 1 9 9 s ) 推测植物细胞内s o s 3 蛋白应答c a 2 + 信号 的机制可能是激活蛋白磷酸酶或抑制蛋白激酶( 或两个过程同时进 行) ，从而调节k + 和n a + 转运系统。e p s t e i n ( 1 9 9 8 ) 在评价这一研究 的意义时指出，这一结果为在调节植物细胞n a + 一k + 选择性吸收中具 有重要作用的看法提供了分子基础上的依据，并对推动培育耐盐作物 具有潜在的作用。 15 河南大学砸士学位沧文 盐胁迫诱导胞内c a 2 + 水平迅速升高从而引起一系列生理反应。 ( l y r t e hj 1 9 8 9 ；k n i g h th e ta 1 1 9 9 7 ) 。那么控制胞内c a 2 + 水平的上游 因子又是什么昵? c o w a n 等( 1 9 9 7 ) 的研究表明，盐胁迫初期，由 _ 了二细胞失水而使膨压降低，导致a b a 的分布发生改变，即胞内a b a 水平降低和质外体a b a 水平升高。已有的研究结果指出，质膜外侧 和胞内均有可能存在a b a 受体( 王恒彬等，1 9 9 7 ；郑志富等，1 9 9 8 ) 。 若a b a 作用于质膜表面的a b a 受体，则被激活的a b a 受体可能进 一步作用于结合在质膜上的g 蛋白，并经后者激活磷脂酶c ，通过 磷酸肌醇系统，刺激胞内c a 2 + 库释放c a “( b l a t tm re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。也 有实验结果表明，a b a 直接作用于质膜上的非选择性阳离子通道， 促进胞外c a 2 + 流入胞内。而胞内的a b a 可能作用机制是直接影响 h + - a t p a s e ( 它位于质膜内侧) 活性，从而一方面直接影响跨膜质子 电化学梯度，另一方面通过影响胞质p h 而使胞内游离c a ：+ 浓度发生 变化，如有报道指出，当胞质p h 下降时，液泡膜上的c a 2 + 通道被打 开，向胞内释放。郝鲁宁和余叔文( 1 9 9 3 ) 报道，大麦幼苗细胞在盐 胁迫初期其质膜c a ”a t p a s e 对c a 2 + 的亲和力减小，受c a m 激活的 能力迅速降低，这可能也是提高胞质c a 2 + 浓度机制之一。因此有人 推测，c a 2 + 介导的盐胁迫信号转导的可能机制是：n a c i 促进a b a 水 平升高，激活g 蛋白和i p ，系统，开启c a 2 + 通道，胞质c a 2 + 水平随之 升高，其结果之一是激活依赖c a 2 + 的蛋白激酶( c d p k s ) ，使受c d p k s 调控的底物发生磷酸化。磷酸化可以在基因表达水平起作用，也可通 过蛋白质化学修饰调节其活性，从而改变膜上的通道或泵活性，影响 胞内离子的平衡，使植物适应盐胁迫。 除了c a 2 + 以外，胞内p h 、c a m p 、活性氧等也逐渐被认为具有第 二信使的功能。盐胁迫下可引起胞内c a 2 + 含量升高，h 2 0 ：可使依赖 c a 2 。的水母发光蛋白在持续几分钟内短暂得爆发式的产生。所以研究 盐胁迫下c a 2 + 与活性氧之间的关系也将能更全面地了解c a ：+ 在盐胁 迫信号转导中的作用。本文即从c a ：+ 和h ：o ：在盐胁迫信号转导中的 一1 6 河南大学硕士学位论文 关系出发，研究盐胁迫时的信号转导途径，揭示植物的抗盐机理，以 便培育j ：抗盐碱的优良品种来满足人民生活的需要。 1 7 一 河南大学坝_ 一学位论文 2 材料和方泫 2 1 实验材料及培养 供试小麦( t r c t w u ma e s l i v i f m ) 为耐盐碱品种( 9 0 6 。) 和普通型 品种( 9 3 0 2 9 “) ( 已由开封市农科所田间鉴定并提供) 。将精选的小 麦种子用7 5 的乙醇消毒1 0 分钟，自来水反复冲洗后用蒸馏水浸泡 2 4 小时，然后放在铺有吸水纸的培养皿中，加入l 1 0 h o a g l a n d 营养 液( 其中c a 2 + 浓度为04 m m o l l ) ，置于光照培养箱中。培养箱温度 为2 5 ，光照1 2 h ，光强3 0 0 0 i x ，相对湿度为7 5 。为保证各离子 浓度不变，每天更换两次培养液。 2 2 小麦幼根质膜透性的测定 采用电导法，使用d d s j 3 0 8 型电导仪进行测定。 将两个品种的小麦培养至一心一叶时，加入如下溶液进行处理： al 1 0h o a g l a n d 营养液( 含o 4 m m o l lc a 2 + ) ( 对照) ，b1 1 0h o a g l a n d 营养液( 含o4 m m o l lc a 2 + ) 十l0 0m m o l ln a c i ：c1 1 0h o a g l a n d 营 养液( 去c a ”) + 1 0 0m m o l ln a c i ；di 10 h o a g l a n d 营养液( 含 04 m m o l lc a 2 + ) + j0 0 m m o l l n a c l + 9 6 m m o l lc a “：el 1 0h o a g l a n d 营养液( 含o4 m m o l lc a 2 + ) 十l0 0 m m o l ln a c l + 2 m m o l l v c 。处理两 天后，取根系o2 9 ，用去离子水漂洗3 次，每次5 r a i n 吸干。将根放 在试管中，加l0 m l 去离水其空渗入于2 5 下浸提。3 h 后测定第一 次电导率e 1 然后把材料煮沸杀死，冷却至2 5 后测定第二次电导 率e 2 。根据公式e 1 e 2 1 0 0 来计算质膜的渗漏率。每个样品处理 5 次，取其平均值。 2 3 小麦幼根中过氧化脂含量的测定 参照林植芳等( 1 9 8 8 ) 的方法( 略有改动) 。 材料处理方法与测量膜透性时的处理方法相同。取lo g 小麦根， 放入研钵中，加入少量石英砂和2 m l 蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆 液转入试管中。用3m l 蒸馏水分两次冲洗研钵，合并提取液。在提 取液中加入5m l o 、5 硫代巴比墨酸( t b a ) 溶液( 溶于20 的三 一1 8 一 河南人学硕士学位论