（分析化学专业论文）扫描电化学显微术检测试剂刺激细胞引起细胞呼吸活性及酶活性的变化.pdf

山东大学硕士学位论文 中文摘要 第一章研究了b f ，c n 。及三种试剂对单个细胞呼吸活性的抑制情况。在 测定细胞呼吸活性时，将s e c m 探头的电位恒定于0 2 发生还原反应的电位，此时 测得的峰电流一部分是由细胞呼吸所消耗掉的0 2 引起的，另一部分是由贴壁细胞 的突起造成的负反馈引起的，我们在测定过程中扣除了细胞突起引起的负反馈电 流。通过测定试剂刺激细胞不同时间时细胞的呼吸活性研究了试剂对细胞呼吸活 性的抑制情况。 第二章研究了b r - ，c n 及n 3 三种试剂对单个活细胞中髓过氧化物酶( m p o ) 的抑制情况，用s e c m 测定了单个活细胞中的m p o 。在测定细胞内m p o 时先用 s e c m 的收集模式确定了测定m p o 的最佳条件。又利用毛地黄皂苷( d i g ) 能溶 解细胞膜上的胆固醇的性质，在细胞膜上产生微孔。此时细胞内的大分子( 如酶) 仍然被禁锢在细胞内部，而小分子物质( 如酶的底物和产物) 则可以进出细胞。 经过d i g 处理后的细胞仍能存活。这样既保证细胞形态上的完整性，又能用s e c m 来测定细胞内的m p o 。当溶液中加入m p o 的底物( h 2 q 和h 2 0 2 ) 后，它们可以 扩散到细胞内，并在细胞内m p o 的催化下发生反应生成b q 和水，生成的b q 和 水扩散到细胞外。当s e c m 探头的电位恒定于b q 发生还原反应的电位时，用 s e c m 就可以测得细胞周围b q 的还原电流。当加入抑制m p o 活性的试剂时， m p o 活性下降。通过测定试剂刺激细胞不同时间时m p o 的活性，研究了试剂对 m p o 活性的抑制情况。 第三章采用亚微米半径金电极测定了单个活性内的m p o 。用苯酚与2 7 烯丙基 苯酚电聚合法制备了用于s e c m 的金亚微米电极。比较了半径为5t a m ，6 8 0n m ， 4 3 2n r n 的金电极扫描细胞内m p o 活性的扫描曲线发现：随着探头半径的减小， 扫描曲线的峰电流降低，峰宽变窄。当探头半径降至4 3 2 n l n 时，扫描曲线的峰电 流降至5p a 。考虑到仪器噪音为1p a ，所以再减小探头的半径测定细胞内的m p o 是不可能的，即用纳米电极测定细胞内的m p o 是不可行的。 关键词：扫描电化学显微镜，单细胞分析，髓过氧化物酶，亚微米电极。 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s ，w es t u d i e dh o wt h r e er e a g e n t sb r 。，c n 。a n dn 3 i n h i b i t e dt h ea c t i v i t yo fr e s p i r a t i o ni na s i n g l el i v i n gc e l l i nt h ed e t e c t i o no fr e s p i r a t i o n a c t i v i t y , t h et i pw a sa p p l i e db yav o l t a g ea tw h i c h0 2 c o u l db ed e o x i d i z e d t h ed e t e c t e d p e a kc u r r e n to r i g i n a t e df r o mt w op a n s o n ew a s t h ec o n s u m p t i o no fr e s p i r a t i o n ，t h e o t h e rw a st h es t u c kc e l l ss a l i e n c el e a d i n gt on e g a t i v ef e e d b a c k d u r i n gd e t e c t i n g r e s p i r a t i o na c t i v i t y , w eg o tr i do ft h ec u r r e n tf r o mt h en e g a t i v ef e e d b a c k b yr e c o r d i n g t h er e s p i r a t i o na c t i v i t yo f t h ec e l ls t i m u l a t e db yr e a g e n t sa td i f f e r e n tt i m e s ，t h ei n h i b i t i o n e x t e n to f r e a g e n t st or e s p i r a t i o na c t i v i t yw a so b t a i n e d i nc h a p t e rt w o ，w es t u d i e dh o wt h r e er e a g e n t sb r ，c n 。a n dn 3 i n h i b i t e dt h e a c t i v i t yo fm y e l o p e r o x i d a s ei nas i n g l el i v i n gc e l l am e t h o df o rd e t e c t i n gm p oa c t i v i t y i ns i n g l el i v i n gc e l lb ys c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ( s e c m ) w a sd e v e l o p e d f o rt h ed e t e c t i o no fm p ow ea s c e r t a i n e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o no fd e t e c t i o nb yt h e g e n e r a t i o nm o d e d i g i t o n i n ( d i g ) i np b sc o u l d d i s s o l v ec h o l e s t e r o lo nt h ec e l l m e m b r a n ea n df o r mm i c r o h o l eo i li t l o wm a s sm o l e c u l e sc o u l dp a s st h r o u g ht h e m e m b r a n ew h i l em a c r o m o l e c u l e ss u c ha se n z y m ew e r es t i l lw i t h i nt h e c e l l c o n s e q u e n t l y , h 2 qa n dh 2 0 2c o u l de n t e rt h ec e l la n dr e a c tt op r o d u c eb qa n dh 2 0 u n d e rt h ec a t a l y s i so fm p o t h ep r o d u c e db qa n dh 2 0d i f f u s e do u t s i d ef r o mt h ec e l l w h e nt h et i pw a sm o v e da b o v et h ec e l ls u r f a c e ，i tc o u l dd e t e r m i n et h ec h a n g e so ft h e b qc o n c e n t r a t i o n ，f m dc e l l sa n dd e t e c t t h ea c t i v i t yo fi n t r a c e l l u l a rm p ob ys e c m w h e nr e a g e n t sw a sa d d e d ，m p oa c t i v i t yd e c r e a s e d b yr e c o r d i n gt h em p oa c t i v i t yo f t h ec e l ls t i m u l a t e db yr e a g e n t sa td i f f e r e n tt i m e s ，w eg o tt h ei n h i b i t i o ne x t e n to f r e a g e n t s t o m p o i nc h a p t e rt h r e e ，w ed e t e c t e dm p oi ns i n g l e l i v i n gc e l lb yu s i n g as u b m i c r o e l e c t r o d e w ef a b r i c a t e ds u b - m i c r o e l e c t r o d eb yp h e n o l a l l y l p h e n o lc o p o l y m e r i n s u l a t e dw a y a f t e rc o m p a r i n gt h es c a n n i n gc u r v e su s i n gt h et i p sw i t hr a d i u so f5g m ， 6 8 0n ma n d4 3 2m nr e s p e c t i v e l y , w ef o u n dt h a tt h ep e a kh e i g h td e c r e a s e da st h et i p s r a d i u sd e c r e a s e d w h e nt i p sr a d i u sw a s4 3 2n l n ，p e a kh e i g h tw a s5p a s m a l l e rt i pt o d e t e c tm p oi ns i n g l ec e l lw a si m p o s s i b l eb e c a u s et h en o i s ei s1p a s on a n o e l e c t r o d e s c o u l dn o tb eu s e dt od e t e c tm p oi ns i n g l ec e l li nt h ep r e s e n tm e t h o d i i 坐查查堂堡主堂竺堕苎一 k e y w 。r d s ：s c a n n i n g e l e c t r 。c h e m i c a lm i c r o s c o p e ，s i n g l e c e l l a n a l y 3 i s ， m y e l o p e r o x i d a s e ，s u b m i c r o e l e c t r o d e 1 l i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：盗至至日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 ：学位论文。 。( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：圣兰兰导师签名：金塞、赫期：乏! 堕：兰兰 山东火学硕：l 学位论文 刖吾 1 扫描电化学显微镜及其特点 8 0 年代末，a j b a r d 小组【1 在超微电极( u l t r a m i c r o e l e c t r o d e ，u m e ) 和 扫描隧道显微镜( s t m ) 2 】的基础上提出和发展了一种新型扫描探针显微镜 技术( s p m ) 一扫描电化学显微术( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y , s e c m ) ， 它是一种分辨率介于普通光学显微镜与扫描隧道显微镜之间的电化学现场检测 技术。它把一支能够进行三维移动的超微电极作为探头插入电解质溶液中，在 离固干h 基底表而非常近的位置进行扫描，来研究基底的形貌和固液界面的电化 学性质。e h - - j 二其具有化学灵敏性，不但可以用来研究探头与基底上的异相反应动 力学及探头和基底之间溶液层中的均相反应动力学，分辩电极表面微区的电化学 不均匀性，给出导体和绝缘体表面的形貌，而且还可以对材料进行微米级加工及 研究许多重要生物过程等，从而弥补了s t m 或原予力显微镜( a f m ) 不能直接提 供电化学信息的不足。 2 实验装置及s e c m 探头 常规的s e c m 实验装置如图1 所示，主要由电化学部分( 电解池、探头、基 底、参比电极、辅助电极和双恒电位仪) ，用来精确控制、操作探头位置的压电 驱动器以及用来控制操作、获取和分析数据的计算机( 包括接口) 三部分组成。 把探头固定在山三维马达控制的爬行器上，通过控制爬行器，可以使探头在基 底上方沿x 、y 、z 轴方向精确移动。基底固定在电解池的底部，爬行器及固定 电解池的载物台都放置于一个稳固的平台上。通过双恒电位仪可控制探头和基 底的电位。计算机通过位置控制器来控制x y z 三维爬行器在基底上方移动。 s e c m 探头就是电化学研究中常用的u m e 和离子选择性微电极。s e c m 实 验中所得到的信息主要与所用的探头大小和类型有关。在s e c m 早期的研究中， 大多采用各种金属和碳纤维圆盘电极作为探头，这种探头至今仍是最常用的 s e c m 伏安式( 或称之为安培式) 探头，这就限制了s e c m 仅可应用到有电活 性样品的研究中。为了检测c i 一，n h 4 + 、a c 一( 乙酰胆碱) 及碱金属和碱土金属 离子等非电活性物质，人们又制作了固体或以微米管为基础的电位式的离予选 择性微电极来作探头。与伏安式探头相比，电位式探头选择性较好，但其图像 分辨率较低，也不能给出距离基底距离的信息。 山东人学硕。i ? 学位论文 a 图1s e c m 仪器装置示意幽 a 装置方框示意图；b ，爬行器示意图。 b 3 工作模式 s e c m 是以电化学原理为基础的，具有以下两个优点：( 1 ) 能够用于反应机 理的研究和探测界面现象；( 2 ) 分辨率高，在微米级和纳米级范围内，传质速 度快，可以在稳态条件下研究快速反应过程。s e c m 可以以多种模式进行实验， 如反馈模式、产生收集模式、穿透模式、离子转移反馈模式、平衡扰动模式、 电位测定。在此仅简单介绍一下反馈模式和产生收集模式。 3 1 反馈模式 反馈模式是s e c m 实验中最常用的，也是可用于定量分析的一种工作模式 ( 见图2 ) 。在反馈模式中，u m e 做为三或四电极体系中的工作电极，相当于其 它扫描探针显微镜中的探头。最常用的探头是外部包着绝缘玻璃的微米圆盘电 极，有时根据实验需要还选用圆锥形、球形及凹形电极作为s e c m 的探头。探 头的电位是相对于参比电极的电位，电荷在探头和对电极之间流动。所要研究 的样品通常称之为基底，基底也可以作为第二个工作电极。在这种情况下，用 一个双恒电位仪来控制探头和基底电极的电位。所有电极都浸泡在含有氧化还 原介质的电解质溶液中。 以还原型介质( r ) 为例，当探头上所加的电位足够正时，r 在探头上发生 氧化反应( 见反应式( 1 ) ) 。 r n e 一一o ( 1 ) 此时电极反应速度是受r 扩散到探头上的速度控制的( 见图2 a ) 。当探头离基 2 山东火学硕： ：学位论文 底很远时，探头上的稳态扩散电流打。符合公式( 2 ) 。 f t 。= 4 n f d r c r ( 1 ( 2 ) 式中h 是电子转移数，是法拉第常数，d r 是r 的扩散系数，f r 是r 的浓度， a 是探头的半径。 公式( 2 ) 不仅适玎于微圆盘探头，还适用于其它形状的小探头。当探头向 导体基底逼近至探头与基底的距离( d ) 大约为几个a 时，在探头上所产生的被 氧化的物质( o ) 就可以扩敝到基底上并能在基底上重新还原成r 。这种使探头 上的电流( ，r ) 增加的过程被称为f 反馈，即f t f l 。( 见图2 b ) 。d 越小，f t 越 大。当基底反应是个快反应时，如果( 一0 ，则f t m 。反之，当基底是绝缘体 时，探头产生的物质( o ) 则不能在其表面上发生反应。绝缘体在此仅起到一个 阻碍r 从本体溶液扩散到探头上的作用，此时i t 随d 的减少而降低，即f t f t 。 这个过程称为负反馈( 见图2 c ) 。当探头在基底上方扫描时，探头的电流随基 底的起伏和性质的变化而发生相应的变化。对于导体基底，d 很小时，探头与基 底问的传质速度很快，因此可用此模式来研究探头与基底电极上的快速异相电 予转移反应。 1 1 a ab 二二= = = c 图2s e c m 的反馈模式 a ，探头远离基底：b ，探头接近导体基底；c 探头接近绝缘体基底。 3 2 产生收集模式 产生收集模式是指s e c m 的一个工作电极产生的物质被第二个工作电极收 集到的一种工作模式( 见图3 ) 。它又分为二类：( 1 ) 基底产生，探头收集模式 ( s g t c 模式) ，( 2 ) 探头产生基底收集模式( t g s c 模式) 。对于后一种模式， 由于探头的直径远小于基底的直径，因此对探头产生的稳定物质基底的收集效 率接近1 0 0 。这种模式应用不太广泛，主要用于研究溶液中的均相反应【3 7 】。 s g t c 模式通常被用来测定基底上产生或消耗的物质的流量和浓度分布图。这 种模式不同于反馈模式和t g s c 模式那样整个氧化还原过程只能局限于探头和 山东大学g i ：l ：学位论文 基底之间的一层很薄的溶液层之间，而足探头在基底产生的一个很厚的扩散层 中进行测定。事实上，早期s e c m 就以测定这样的扩散层为目的的【8 1 0 】。 如果探头是电流型电极，探头上发生的电极反应消耗了基底产生的物质， 这会使基底的扩散层发生明显的扰动。另外，移动探头所引起基底扩散层的搅 动和较低的收集效率( i , r i s ，i s 是基底的电流) 都限制了s g t c 模式的应用。如 果探头改用电位型电极，则不会消耗被测物质，因而对基底所产生的电活性物 质的浓度分布图的影响非常小。 厂一、 r ro r r r _ j _ 止 幽3s e c m 的产生收集模式 4s e c m 图像 大多数己报道的s e c m 图像是应用等高模式得到的 1 1 ，1 2 。此模式的工 作原理是探头在基底表面进行等高的x ，y 方向扫描，同时记录探头在不同位 置的电流大小。探头电流的大小反映出z 方向的高低，从而可得到基底的三维 图像。可获得的图像的分辨率主要与探头的大小和探头与基底之间的距离有关。 应用纳米级的探头可使图像的分辨率从g m 提高到3 0 5 0n m 【1 l ，1 2 ，这已接近 其理论极限。因为进一步提高图像的分辨率需要将探头移到离基底在1 0n m 之 内，可以引起电子在探头和导体基底之间的隧道电流，此时s e c m 过渡到了s t m 的范畴。 对于导电性不均匀的基底，应用等电流模式可以避免等高模式所引起的探 头可能碰到基底而损坏的问题【1 3 ，1 4 】。目前应用s e c m 所得到的最高的分辨 率是在空气中研究绝缘基底。当一个原子级平整的云母放在湿润的空气中，在 其表面有一个零点几纳米厚的水层。当用纳米级的探头进行研究时，其探头的 有效面积仅是浸在水相中的那部分探头。 5 在细胞研究中的应用 s e c m 从开发的初期，人们就在不断尝试将其应用拓展到生物领域。继b a r d 山东大学硕士学位论文 小组 1 5 ，1 6 首次用反馈模式做出了草和l i g u s t r u ms i n e n s i s 叶子表面的形貌 图以及用收集模式测定了e l o d e a 叶片上光合作用产生的氧气和气孔释放氧气分 稚图之后，细胞的形态和性质逐渐成为s e c m 研究的热门课题之一。s e c m 用 于研究单细胞有其独特的优势：( 1 ) 对细胞的形态及活性无太大影响，可以实 现细胞活体测定：( 2 ) 只对有电活性的物质有响应，选择性好：( 3 ) 可测定跨 膜电荷传递的速度，进而研究细胞内的氧化还原活性。 近十年，m a t s u e 小组和m i r k i n 小组围绕单细胞做了一系列的工作。m a t s u e 小组测定了c n 对活的人体癌细胞( s w 4 8 0 ) 呼吸活性的影响【1 7 】。用双微圆 盘电极通过同时测定两种电活性物质一k 4 f e ( c n ) 6 和0 2 ，同时得到了原生质细 胞的形貌图和光合作用产生0 2 的s e c m 图 18 】。研制了一种固定有细胞的生 物微芯片，研究了两种抗生素一安比西林和链霹素对大肠杆菌活性的影响 1 9 】。 测定了单个牛胚胎在培养状态下各个分裂阶段氧的消耗速度【2 0 】。还研制一种 有阵列微孔的硅片，把二种癌细胞一k 5 6 2 ，抗阿霉素k 5 6 2 用胶原固定在微孔 中。用s e c m 在微孔上方扫描，测定细胞团的呼吸活性以及抗癌物质对细胞活 性的影响 2 i 】。m i r k i n 小组利用溶液中不同种类的氧化还原介质在细胞膜上与 活细胞内的氧化还原物质有可能进行电子交换的原理，用s e c m 探测了单个哺 乳动物细胞 2 2 ，2 3 的氧化还原活性和酸碱活性及具有双层膜的紫色光合作用 菌( p u r p l ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 的氧化还原活性 2 4 】。并且进一步研究了哺 乳动物细胞中电荷转移反应的机理【2 5 ，提出了根据氧化还原活性区分正常细 胞和癌细胞的新思路 2 6 】；。他们所采用的是在s e c m 探头上产生还原型氧化 型介质，这些介质有可能进入细胞并在其内部再被氧化还原，这个过程就会被 探头收集，产生电流的增加( 正反馈) 。此过程随氧化还原介质的种类、浓度及 细胞的种类而变化。另外h e n g s t e n b e r g 【2 7 研制了一种利用剪力传感器控制探 头和基底之间高度的s e c m 。用这种方法得到了神经细胞株p c i 2 的s e c m 图。 并把探头固定在细胞上方，记录了加入k + 后所产生的胞吐过程。l i e b e t r a u 【2 8 】 用负反馈模式测定了p c i 2 的形貌图，并选用合适的氧化还原介质及不同类型的 探头，实时监测了p c i 2 细胞形态的变化。总体上说，现在用s e c m 来研究细 胞主要采用二种方法：( 1 ) 加入可逆型氧化还原介质利用反馈模式得到细胞的 形貌图；( 2 ) 通过测定细胞产生或消耗的氧气利用收集模式来进行研究。除此 之外，a l a i n 等研究了用血管舒缓肽素刺激脐带血管内皮细胞后细胞释放n o 的 情况 2 9 1 。 山东大学硕f ：学位论文 6 参考文献 【1 】b a r d ，a j ，f a n ，e - r e ，k w a k ，j ，l e v , 0 s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y i n t r o d u c t i o n a n dp r i n c i p l e s j a n a lc h e m 1 9 8 9 ，6 l ( 2 ) ，1 3 2 一l3 8 【2 】l i u ，h y ，f a n ，f r f ，l i n ，c w ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a la n dt u n n e l i n g u l t r a m i c r o e l e c t r o d e m i c r o s c o p e f o r h i g h r e s o l u t i o ne x a m i n a t i o n o fe l e c t r o d es u r f a c e si n s o l u t i o n j a m c h e m s o c 1 9 8 6 ，1 0 8 ( 1 3 ) ，3 8 3 8 - 3 8 3 9 3 】u n w i n ，p r ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 9 t h e o r ya n da p p l i c a t i o no f t h ef e e d b a c km o d et ot h em e a s u r e m e n to ff o l l o w i n gc h e m i c a lr e a c t i o nr a t e si n e l e c t r o d e p r o c e s s e s j j p h y s c h e m 1 9 9 1 ，9 5 ( 2 0 ) ，7 8 1 4 - 7 8 2 4 【4 】z h o u ，f ，u n w i n ，p r ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 1 6 s t u d yo f s e c o n d 。o r d e rh o m o g e n e o u sc h e m i c a lr e a c t i o n sv i at h ef e e d b a c k a n d g e n e r a t i o n c o l l e c t i o n m o d e s j je h y sc h e m 1 9 9 2 ，9 6 ( 1 2 ) ，4 9 1 7 - 4 9 2 4 【5 】z h o u ，f ，b a r d ，a j d e t e c t i o no f t h ee l e c t r o h y d r o d i m e r i z a t i o ni n t e r m e d i a t ea c r y l o n i t r i l er a d i c a l a n i o nb ys c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j ，a mc h e ms o c1 9 9 4 ，1l6 ( 1 ) ，3 9 3 3 9 4 【6 】t r e i c h e l 。d a ，m i r k i n ，m v ，b a r d ，a j ，s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 2 7 a p p l i c a t i o no f as i m p l i f i e dt r e a t m e n to f a ni r r e v e r s i b l eh o m o g e n e o u sr e a c t i o nf o l l o w i n g 【7 】u n w i n ，pr ，b a r d ，a j ，d e m a i l l e ，c s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 3 3 a p p l i c a t i o n t o t h es t u d yo f e c e d i s pr e a c t i o n s j ，e h y s c h e m 1 9 9 6 ，1 0 0 ( 3 3 ) ，1 4 1 3 7 - 1 4 1 4 3 8 】e n g s t r o m ，r c ，w e b e r , m ，w u n d e r , d j ，b u r g e s s ，r ，w i n q u i s t ，s m e a s u r e m e n t sw i t h i nt h e d i f f u s i o nl a y e ru s i n gam i c r o e l e c t r o d ep r o b e j a n a l c h e m 1 9 8 6 ，5 8 ( 4 ) ，8 4 4 - 8 4 8 f 9 】e n g s t r o m ，r c ，m e a n e y , i ，t o p i c ，r ，w i g h t m a n ，r m s p a t i o t e m p o r a ld e s c r i p t i o no ft h e d i f f u s i o nl a y e rw i t ham i c r o e l e c t r o d ep r o b e j a n a l c h e m 1 9 8 7 ，5 9 ( 1 5 ) ，2 0 0 5 - 2 0 1 0 【1 0 】e n g s t r o m ，r c ，w i g h t m a n ，r m ，k r i s t e n s e n ，e wd i f f u s i o n a ld i s t o r t i o ni nt h em o n i t o r i n g o f d y n a m i ce v e n t s j a n a l c h e m 1 9 8 8 ，6 0 ( 7 ) ，6 5 2 - 6 5 6 【1i 】b a r d ，a j ，f a n ，e r f ，p i e r c e ，d t ，u n w i n ，p r ，w i p f , d o ，z h o u ，fc h e m i c a li m a g i n go f s u r f a c e sw i t ht h es c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e j s c i e n c e 1 9 9 1 ，2 5 4 ，6 8 7 4 【1 2 ja r e a ，m ，b a r d ，a j ，h o r r o c k s ，b r ，r i c h a r d s ，tc ，t r e i c h e l ，d a a d v a n c e si ns c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y p l e n a r yl e c t u r e j a n a l y s t1 9 9 4 ，119 ( 5 ) ，719 - 7 2 6 【1 3 】w i p f , d o ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 1 5 i m p r o v e m e n t si ni m a g i n g v i a t - p p o s i t i o n m o d u l a t i o na n d l o c k - i nd e t e c t i o n j a n a l c h e m 1 9 9 2 ，6 4 ( 1 3 ) ，1 3 6 2 - 1 3 6 7 【1 4 】w i p f , d o ，b a r d ，a j ，t a l l m a n ，d e s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 2 1 c o n s t a n t c u r r e n ti m a g i n gw i t ha na u t o s w i t c h i n gc o n t r o l l e r j a n a l c h e m 1 9 9 3 ，6 5 ( 1 0 ) ， 1 3 7 3 1 3 7 7 6 山东大学硕：l 学位论文 i5 】l e e ，c ，k w a k ，j ，b a r d ，a j a p p l i c a t i o no fs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y t o b i o l o g i c a ls a m p l e s j j p r o cn a t l a c a d s c iu s a 1 9 9 0 ，8 7 ，17 4 0 1 7 4 3 【16 】t s i o n s k y , m ，c a r d o n ，z g ，b a r d ，a j ，j a c k s o n ，r b p h o t o s y n t h e t i ce l e c t r o nt r a n s p o ni n s i n g l eg u a r dc e l l sa sm e a s u r e db ys c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j p l a n tp h y s i 0 1 1 9 9 7 ，1 1 3 ，8 9 5 9 0 i 7 】y a s u k a w a ，一，k o n d o ，v ，u c h i d a ，1 m a t s u e ，ti m a g i n go fc e l l u l a ra c t i v i t yo fs i n g l ec e l l sb y s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j c h e ml e t t1 9 9 8 ，8 ，7 6 7 - 7 6 8 【18 】y a s u k a w a ，t ，k a y a ，t ，m a t s u e ，丁h n a g i n go fc e l l u l a ra c t i v i t yo fs i n g l ec e l l sb ys c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j a n a l c h e m 1 9 9 9 ，7 1 ，4 6 3 7 4 6 4 i ( 19 jk a y a ，丁，n i s h i z a w a ，m ，y a s u k a w a ， 1 2 ，n i s h i g u c h i ，m ，o n o u c h i ，t ，m a t s u e ，ram i c r o b i a l c h i pc o m b i n e dw i t hs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j b i o t e c h n 0 1 b i o e n g2 0 0 1 ，7 6 ， 3 9 1 3 9 4 2 0 】s h i k u ，h ，s h i r a i s h i ，t ，o h y a ，h ，m a t s u e ，下，a b e ，h ，h o s h i ，h ，k o b a y a s h i ，m o x y g e n c o n s u m p t i o no fs i n g l eb o v i n ee m b r y o sp r o b e db ys c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y j a n a lc h e m2 0 0 i ，7 3 ，3 7 5 i 一3 7 5 8 【21 】t o r i s a w a ，y ，k a y a ，丁，o y a m a t s u ，d ，n i s h i z a w a , m ，m a t s u e ，t ，s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y - b a s e dd r u gs e n s i t i v i t y t e s tf o rac e l lc u l t u r e i n t e g r a t e d i n 。s i l i c o n m i c r o s t r u c t u r e s 【j 】，a n a lc h e m2 0 0 3 ，7 5 ，2 1 5 4 - 2 15 8 1 2 2 】l i u ，b ，c h e n g ，w ，r o t e n b e r g ，s a ，m i r k i n ，mvs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p yo f l i v i n gc e l l s ：p a r t2 i m a g i n gr e d o xa n da c i d b a s i cr e a c t i v i t i e s j ，e l e c t r o a n a l c h e m2 0 0 1 ， 5 0 0 ( i 一2 ) ，5 9 0 5 9 7 【2 3 l i u ，b ，r o t e n b e r g ，s a ，m i r k i n ，mvs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p yo fl i v i n gc e l l s ： d i f f e r e n tr e d o xa c t i v i t i e so fn o n m e t a s t a t i ca n dm e t a s t a t i ch u m a nb r e a s tc e l l s j p r o cn a t l a c a ds c iu s a2 0 0 0 ，9 7 ，9 8 5 5 - 9 8 6 0 【2 4 c a i ，c x ，l i u ，b ，m i r k i n ，mv ，f r a n k ，h a ，r u s l i n g ，j fs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p yo f l i v i n g c e l l s3 r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s j a n a l c h e m 2 0 0 2 ，7 4 ，1 1 4 - 1 1 9 【2 5 jl i u ，b ，r o t e n b e r g ，sa ，m i r k i n ，mv s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p yo fl i v i n gc e l l s 4 m e c h a n i s t i cs t u d yo fc h a r g et r a n s f e rr e a c t i o n si nh u m a nb r e a s tc e l l s j a n a lc h e m 2 0 0 2 ，7 4 ，6 3 4 0 6 3 4 8 【2 6 】f e n g ，w ，r o t e n b e r g ，s ，a ，m i r k i n ，m vs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p yo fl i v i n g c e l l s 5 i m a g i n go ff i e l d so fn o r m a la n dm e t a s t a t i ch u m a nb r e a s tc e l l s j a n a lc h e m 2 0 0 3 ，7 5 ，4 1 4 8 - 4 15 4 f 2 7 】h e n g s t e n b e r g ，a ，b l o c