（微生物学专业论文）南极菲尔德斯半岛某些地衣抗氧化活性的测定.pdf

摘要 摘要 本研究采用组织分离培养法对6 8 份采自南极菲尔德斯半岛的地衣进行共生菌藻的 分离培养，共有微孢衣属( a c a r o s p o r a ) ，石蕊属( c l a d o n i a ) ，夹心果衣属( h i m a n t o r m i a ) ， 球粉衣属( s p h a e r o p h o r u s ) ，珊瑚枝衣属( s t e r e c a u l o n ) ，松萝属( u s n e a ) ，石耳属 ( u m b i l i c a r i a ) 7 属、地衣分离得到2 2 株共生菌藻。 本研究讨论采自南极菲尔德斯半岛的石蕊属( c l a d o n i a ) ，夹心果衣属 ( h i m a n t o r m i a ) ，树花属( r a m a l i n a ) ，球粉衣属( s p h a e r o p h o r u s ) ，珊瑚枝衣属 ( s t e r e c a u l o n ) ，松萝属( u s n e a ) ，石耳属( u m b i l i c a r i a ) 7 属、2 4 份地衣甲醇提取物的 体外抗氧化能力，采用亚油酸氧化体系、二苯代苦味酰自由基体系、还原力试验对其抗 氧化活性进行测定，并同维生素c 、丁基甲氧基苯酚进行比较。结果显示供试地衣具有 相当高的抗氧化活性，且呈剂量依赖关系；其中，簇花石萝提取物的脂质过氧化抑制率 最高，还原力最大，石蕊提取物d p p h 自由基清除能力最大。这些种类的地衣可作为高 效抗氧化剂的新资源，应做更深入的研究。 分离自簇花石萝的松萝酸抗氧化试验结果显示：提取物松萝酸具有抗氧化活性，但 活性远低于簇花石萝提取物。 地衣共生菌的抗氧化试验结果显示：共生菌提取物的抗氧化活性远低于同种地衣体 提取物。 关键词簇花石萝松萝酸石蕊共生菌提取物 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et i s s u ec u l t u r eo f6 8l i c h e n sf r o mf i l d e sp e n i n s u l a , a n t a r c t i c aw a ss t u d i e d i nt h e r e s u l t ，2 2m y c o b i o n t sa n dp h o y o b i o n t sw e r ei s o l a t e df r o mg e n e r aa c a r o s p o r a ，c l a d o n i a ， h i m a n t o r m i a ，h i m a n t o r m i a ，s p h a e r o p h o r u s ，s t e r e c a u l o n ，u s n e aa n du m b i l i c a r i a t h i ss t u d yd e a l e dw i t ha n t i o x i d a n ta b i l i t yo fe x t r a c t sf r o m2 4o ft h ea n t a r c t i cl i c h e n s t h e a n t i o x i d a n ta b i l i t yw e r ed e t e c t e db yt h el i n o l e i ca c i d ，d p p ha n dr e d u c i n gp o w e rs y s t e m sa n d w a sc o m p a r e d 、析t ht h a to fc o m m e r c i a la n t i o x i d a n tv ca n db h a t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ee x t r a c t sw a sc o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t i nt h es t u d y , u s n e a a u r a n t i a c o a t r aa p p e r a n t e dt h em a x i m u mi n h i b i t o r yr a t i oo fl i p i dp e r o x i d a n t i o na n dt h e m a x i m u mr e d u c i n gp o w e ，c l a d o n i as p s h o w e dt h em a x i m u m s c a v e n g i n ga c t i v i t yo nd p p h f r e er a d i c a s u c hs p e c i e ss h o u l d b ee x p l o r e da sn o v e ls o u r c e so fe f f e c t i v ea n t i o x i d a n t m e t a b o l i t e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tu s n i ca c i di s o l a t e df r o mu s n e aa u r a n t i a c o - a t r ah a ss o m e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yb u tr a t h e rl o w e rt h a nt h a to fe x t r a c tf r o m u s n e aa u r a n t i a c o a t r a a st ob ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo fm e t h y la l c o h o le x t r a c to ft h em y c o b i o n t sw a sr a t h e rl o w e r t h a nt h a to ft h ee x t r a c ti s o l a t e df r o mt h el i c h e ns p e c i e s k e yw o r d s u s n e aa u r a n t i a c o - a t r au s n i ca c i dc l a d o n i a m y c o b i o n t e x t r a c t s 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：龟盘盐日期：丞! 乙年厶月卫日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“4 ”) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为“南极菲尔德斯半岛某些地衣抗氧化活性 的测定”的学位论文，是我个人在导师魏江春研究员指导并与导师合作下取得的研究成 果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助 下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法 律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：壅盘丛日期：盟年之月旦日 作者签名：盘丕垄垫日期：边年丛月卫日 导师签名侄锄l 眺节年月止日 引言 引言 地衣是由真菌与藻类或蓝细菌结合在一起而构成的稳定共生复合体。共生的真菌大 多数为子囊菌类，少数为担子菌类。藻类和蓝细菌含有叶绿素，能进行光合作用而为整 个地衣体制造养分；真菌则吸收外界水分和无机盐供给藻类，使之保持一定的湿度和得 到光合作用所需原料。地衣体虽无根茎叶等分化，但环境适应力极强，能耐高温，低温， 干旱等。 南极的气候酷寒、干燥、风大、日照量极少、营养缺乏和生长季节很短等因素严重 制约了大型高等植物的生长和发育，致使南极群岛仅有两种高等植物。但地衣因其极强 的环境适应力，广泛分布于南极大陆的沿海地带及其附近岛屿。 生物体代谢过程中发生一系列氧化还原反应，产生超氧阴离子、羟基自由基等代谢 中产物【1 】。这些物质易引起膜脂过氧化反应，导致脂质过氧化物的堆积，引起膜结构和 功能的紊乱。这些物质自身的过氧化产物及其次级氧化产物，具有很高的反应活性，能 与生物酶底物，如蛋白质、氨基酸、脱氧核糖核酸发生反应【2 】，引起蛋白质交联、酶活 性改变、损伤d n a ，引起突变掣引。 适当补充外源性抗氧化剂可清除自由基，阻断脂质过氧化反应，保持食物品质，治 疗或缓解病症。因此，抗氧化剂在食品和医药工业中的作用很重要。目前，合成抗氧化 剂，如丁基甲氧基苯酚( b u t y l a t e dh y d r o x y a n i s o l e ：b h a ) 、丁基甲基苯酚( b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e ：b h t ) 和叔丁基对苯二酚( t e r t i a r yb u t y l a t e dh y d r o q u i n o n e ：t b h q ) 广泛应 用于食品工业，但是，b h a ，b h t 曾被怀疑会引起肝损伤和癌症【4 巧】，其安全性已引起 人们的质疑。所以，发展和应用更多有效的天然来源抗氧化剂正日益受到人们的关注。 地衣由于其独特的生理生化特性，正日益受到学者的关注。许多地衣，如岛衣 c e t r a r i ai s l a n d i c a ( l ) a c h 6 等，其相关研究显示地衣所含物质有较强的抗氧化能力。目 前，南极生物特别是地衣的抗氧化活性的报道比较少【7 】，迄今尚无来自簇花石萝：u s n e a a u r a n t i a c o a t r a ，南极石萝：u s n e aa n t r c t i c a ，夹心果衣：h i m a n t o r m i al u g u b r i s ，球粉衣： s p h a e r o p h o r u sg l o b o s u s 等地衣抗氧化能力的相关报道。本研究旨在与b h a ，v c 比较中 阐明上述南极地衣的抗氧化能力；评估其应用价值和开发前景。 河北大学理学硕七学位论文 第1 章绪论 1 1 地衣共生菌藻人工培养的研究进展 1 1 1地衣的概念与生物学意义 地衣是一类与特定的藻类或蓝细菌处于稳定共生联合的专化性真菌，它与藻类或蓝 细菌形成了独特构造的地衣体并在其中占据优势，所以地衣又称为地衣型真菌，其处于 真菌分类系统中，物种学名就是共生真菌的学名捧j 。 很多地衣可以在相当极端的环境内生长，如终年积雪之山巅露岩，南北极之极地冻 原，沙漠之裸岩等。地衣作为共生生物和岩石风化、土壤形成的先锋生物具有显著的独 特性。地衣在系统掣9 】、共生进化【1 0 】、地衣化学1 1 1 、地衣多样性、土壤形成、物种分化 与形成，生物演化和群落演替等领域都具有研究价值，并占有非常重要的生态地位。此 外，地衣资源的开发日益受到关注。地衣产生的代谢产物约有6 0 0 种之多，是抗癌药物 和抗生素的重要来源。而在食用、饲料、日用香料、染料、试剂、测年、冰核降雨、环 境监测与大气质量评定【1 2 】、地质探矿等方面，地衣也都有应用前景。地衣共生真菌与共 生藻类的分离、培养、保存不仅是菌、藻共生生态系统理论研究中的重要内容，而且在 地衣资源的开发利用中具有现实意义。 南极菲尔德斯半岛常见地衣种属： 南极石萝u s n e aa n t a r c t i c a ：地衣体枝状，高2 7 ( 1 2 ) c m ，近二叉和不规则分支， 上部枝条丰茂并具尖细小枝条，纤毛稀少，枝条圆柱形，淡绿黄色，但枝条中，上部相 间染成黑色或紫黑色环纹，趋向顶端常连续染成黑色或紫黑色，表面无光泽，粗糙，乳 头状突起；髓层紧密，中轴厚，占枝条直径的0 5 至0 7 ；粉牙堆众多，平坦至弹状，白 色，部分颗粒有时皮层化呈近黑色，裂牙缺乏。子囊盘稀少或缺乏，近顶生；分生孢子 器未知。环南极种，但分布中心在南极半岛及其邻近岛屿，也出现在亚南极岛屿，菲尔 德斯半岛属亚南极，南极石萝是该半岛的优势地衣种之一，其盖度仅次于簇花石萝【1 3 】。 簇花石萝u s n e aa u r a n t i a c o a t r a ：地衣体枝状，高4 1 0 ( 1 5 ) c m ，近不等式二叉和 不规则分支，直立呈簇，上部分枝稠密，纤毛稀疏或稠密，枝条圆柱状，质地教坚硬， 淡绿黄色，枝条上部由色素染成黑色或紫黑色环纹，趋向顶部分枝尖细并呈连续黑色， 因色素深度及覆盖面的差异使地衣体个体间整体色度变化幅度较大，表面无光泽，基部 2 第1 章绪论 光滑，其余部分粗糙，疣状突起至稠密的乳头状；无粉芽和裂牙；髓层紧密，中轴较厚， 占枝条直径的05 0 7 c m ；子囊盘常见，众多，或偶无盘或盘稀少，近顶生至顶生，稀 为侧生，盘径2 - 1 0 c m ，盘面黑色或稀为暗褐色，盘托表面租糙，疣状至乳头状突起： 分生孢子器生于枝条顶端但不常见。主要分布在南极半岛西海岸延伸至南美洲的亚南极 地区，而不出现在南极大陆。广泛分布于菲尔德斯半岛，并在该半岛地衣植被中占明显 优势旧。 图1 1 南授石萝图1 2 簇花石萝 f i 9 1 1u s n e aa n t a r c t i c af i g 1 2 u s n e a a u r a n t i a c o - a t 石蕊属c l a d o n i ah i l l ：果柄皮层菌丝排列方向与果柄相垂直；果柄柱状不分枝或树 枝状多分技末端具呈杯状扩大的杯体或杯体狭窄、不规则或缺如。子囊盘腊盘型：孢 子无色，单胞，稀为平行2 - 4 胞，卵圆形，长圆形至纺锤形。共生藻为共球藻属。果柄 一般含有黑茶渍素( a n a n o f i n ) ，茶痂衣酸( p s o r o m i ca c i d ) ，松萝酸( u s m ea c i d ) ，富马 原岛衣酸( f i a n a r p r o t o c e t r a r i ca c i d ) ，巴巴酸( b a r b a t i ca c i d ) ，鳞衣酸( s q u a m a t i ca c i d ) ， 泽屋萜( z e o r i n ) i i p 4 6 0 。 树花属r a m a l i n aa c h ：地衣体灌丛枝状，直立，半直立或悬垂，枝体圆筒状，扁枝 状至扇形叶状，通常无背腹之分。子囊盘茶渍型，侧生或顶生或二者兼存；子囊内含8 孢；孢子双胞：无色，纺锤形。共生藻为共球藻属【1 4 1 p 4 5 5 。 石耳属u m b i l i c a r i ah o f f me m e n dw e i ：地衣体叶状，近圆形或不规则形，单叶型或 复叶型；上表面灰色、灰绿色、灰褐色至暗褐色；下表面中央脐粗壮，裸露或具假根。 于囊表面网衣型，表面平坦，或有柱状突起，或裂隙，或呈环纹状；子囊内含8 孢，偶 见6 孢：孢子无色单胞，或有时后期变为褐色砖壁型多胞【1 “p 4 7 4 。 河北大学理学硕十学位论文 珊瑚枝衣属s t e r e o c a u l o n ( s c h e r b ) h o f f m - 初生地衣体壳状，往往消失；拟果柄枝状， 发育良好，表面分布有各种形状小瘤芽及囊状或粒状衣瘿。子囊盘网衣状，有时( 早期) 茶渍型，顶生或侧生；子囊内含8 孢；孢子4 多剧1 4 1 p 4 5 7 。 1 1 2 地衣共生菌藻的人工培养 众多地衣共生菌藻人工培养的结果表明分离培养的菌和藻与地衣共生体菌藻其结 构、生理、化学和遗传均有较大区别。地衣共生体并非真菌与藻类的简单加和，而是经 过长期的相互作用演化而成的既不同于真菌又不同于藻类的生物体，特殊结构和生理生 化特性使其对恶劣环境的适应性明显强于组成地衣的两种生物体和其他植物，是两种生 物体相互适应并适应环境的产物。 y o s h i m u r a 等人( 1 9 9 0 ) 首次得到了3 种南极地衣r h i z o c a r p o nf l a v u md o d g e & b a k u m b i l i c a r i aa p r i n an y l ，和ud e c u s s u t a ( v i u ) z a h l b r 人工培养组织，并对其进行低温适应 性试验，结果显示：除u m b i l i c a r i aa p r i n a 夕b ，其它种人工培养的组织，在1 5 c 的生长状 况均好于5 c ；只有ua p r i n a 在5 c 条件下长势优于1 5 c ，表现出较强的低温适应性【15 1 。 1 1 3 菲尔德斯半岛自然环境及其特征 菲尔德斯半岛位于乔治王岛西南部，其地理坐标为：$ 6 2 0 0 8 4 8 - $ 6 2 0 1 4 0 2 ”， w 5 8 0 5 3 4 0 ”w 5 9 0 0 17 5 0 ”。乔治王岛是南极洲距南美大陆最近且面积最大的一个岛屿， 即距南美大陆南端约1 1 0 0 k r n ，距南极半岛仅1 4 0 k m 。该岛面积为1 3 3 8k m 2 ，其中无冰 区面积仅6 0k m 2 。菲尔德斯半岛是乔治王岛上最大的无冰区，其面积约为3 8 k m 2 【1 6 1 。本 半岛上有1 9 6 8 年建立的俄罗斯别林斯高晋站、1 9 6 9 年建立的智利马尔什基地、1 9 8 4 年 建立的中国长城站和1 9 8 5 年建立的乌拉圭阿尔蒂卡站。在乔治王岛上其它无冰区还有 1 9 5 3 年建立的阿根廷尤巴尼站，1 9 7 7 年建立的波兰阿尔茨托夫斯基站，1 9 8 4 年建立的 巴西费拉兹站，1 9 8 8 年建立的韩国世宗王站和秘鲁等国的科学考察站，还有s c a r 确 定的三处南极科学兴趣点( s s s i s ) ，即海军湾、波特尔半岛和菲尔德斯半岛。因此这里是 南极科学考察站最为集中的地区之一，也是进行南极环境科学研究的理想场所。 本半岛主体由第三纪层状熔岩、火山碎屑岩和火山沉积岩组成，且以基性熔岩为主。 在地形上表现为海拔4 0 5 0 m 和1 1 0 1 2 0 m 两级波状起伏台地，地表冰川堆积作用不明显， 而剥蚀作用强烈；在东海岸一般有4 6 级海积阶地，多为松散砾砂质堆积物。本区属于 亚南极海洋性气候区，年平均气温之1 0 c 左右，每年有4 个月月平均气温高于0 0 c ，年 4 第1 章绪论 平均大气相对湿度为9 0 左右，年平均降水量约6 3 0 m m 。相对温暖湿润的气候，使本 地区成为南极动植物的天堂，其中植物以地衣、苔藓和藻类为主。苔藓多分布于地形平 坦、冻融作用微弱地表相对稳定的滨海地区；地衣则广泛分布于基岩和大砾石的表面； 藻类分布广泛，在多年积雪面上有冰藻生活，在海鸟栖息地、地表径流底和浅层积水洼 地也有多种藻类集中分布，局部可形成明显的藻质层；在半岛中南部平缓的北坡及西北 坡偶见有丛状南极发草生长。在菲尔德斯半岛滨海区夏季还栖息有许多海鸟和海豹，这 些生物每年将大量海洋物质代谢在其栖息地 1 7 1 引。 1 2自由基与天然抗氧化剂的研究进展 1 2 1自由基的概念及其与抗氧化活性的关系 自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物。机体不断产生自由基的同时，也 在及时清除着自由基。当机体清除自由基的能力下降或体内自由基生成过多时，过剩的 自由基在体内堆积，作用于生物膜、多不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化而引起膜结 构和功能的紊乱，攻击蛋白质，引起蛋白质交联，酶活性改变，损伤d n a ，引起突变 等等【3 】。而食用油脂和富含油脂的食品在存放过程中，发生酸败也是自由基引发的氧化 反应。油脂酸败后不但破坏了其中的营大陆分，而且氧化过程中产生的各种中间产物和 终产物进入生物体后，亦会影响到生物膜和机体的其他重要成分及功能。适当补充外源 性抗氧化剂，可清除自由基，阻断脂质过氧化反应。现在常用的抗氧化剂b h t 、b h a 及p g ，绝大多数为合成品，其安全性已引起人们的质疑，因此天然抗氧化剂逐渐得到 了广泛的关注。 自由基可与生物体内的许多物质，如蛋白质、脂肪酸等作用，夺取其氢原子，造成 相关细胞的结构与功能的破坏，而食用油脂和富脂食品的酸败也是自由基所引发的，它 不仅使油脂本身受破坏失去营养，更重要的是其氧化产物和中间产物会伤害生物膜、酶、 维生素、蛋白质及活细胞功能，其中一些是公认的致癌物【1 9 】。 抗氧化性是通过阻止一系列氧化反应从而抑制或延缓氧化反应进程来共同完成的。 目前，人造抗氧化剂如b h a 、b h t 、以及t b h q i = , 被广泛应用与食品工业。然而，人造 抗氧化剂的局限正因其对人类肝脏的毒性和致癌性而加强【2 0 。2 1 1 。 鉴于上述原因，有关抗氧化剂清除自由基以及发现和应用更多有效的天然抗氧化剂 的研究得到普遍关注，人们越来越趋向于使用天然抗氧化剂。 5 河北大学理学硕士学位论文 1 2 2 天然抗氧化剂的活性成分及抗氧化机理 天然植物本身也是生命有机体，在其生命活动过程中同样由于各种外源性因素和内 源性因素产生自由基。在漫长的生物进化过程中，天然植物体内产生了一套精细的防护、 清除和修复过量自由基的体系。包括酶体系：如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 、过氧化物酶等等；非酶体系：如v c 、v d 、b 胡萝卜素、硒、蛋白质及其衍生物类、酚酸类、生物类黄酮、内酯、植酸等等。 1 2 2 1 酶类抗氧化剂【2 2 】 1s o d s o d 是一类含金属的酶，按金属辅基成分可分为三种。最常见的一种含有铜锌金属 辅基( c u z n - s o d ) ，第二种含锰辅基( m n s o d ) ，第三种是f e s o d 。s o d 可清除体内过 量的超氧阴离子0 2 - 可延缓衰老，提高机体免疫力。 2c a t c a t 是血红素酶，大都由4 个相同的亚基组成，各亚基的中心活性部位为f e 3 + 原卟 啉，分解h 2 0 2 。 3g s h p x 这是一种含硒的酶由4 个分子质量太致相同的亚基组成，每个亚基含有1 个硒代半 胱氨酸残基。它能清除活性氧自由基。其中硒起了很重要的作用，硒代半胱氨酸是 g s h p x 的催化部位，谷胱甘肽作供氢体。 1 2 2 2 非酶类抗氧化剂【2 3 】 l 维生素类 p 一胡萝卜素：p 一胡萝卜素是维生素a 的前体，有很好的抗氧化性能，能通过提供电 子抑制活性氧的生成达到清除自由基的目的，能清除单线态氧，减少光过敏作用，也是 单线态氧的猝灭剂。 维生素e ：迄今为止，公认存在于自然界的0 【生育酚、p 生育酚、丫- 生育酚和6 生育 酚及a - 三烯生育酚、p 三烯生育酚、丫一三烯生育酚和6 三烯生育酚共八种同族异构体，统 称为维生素e ，均有维生素e 的生理活性。生育酚是已知生物活性最大的一种生育酚。维 生素e 经过一个自由基中间体氧化成醌，将r o o 转变成化学性质不活泼的r o o h ，中 断了脂类过氧化的连锁反应，有效地抑制脂类过氧化作用。 维生素c ：这是一种简单的六碳化合物，是一种重要的自由基清除剂，它通过逐级 6 第1 章绪论 供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸以达到清除活性氧自由基。 2 含氮化合物 r i c h a r d a 等对植物中的许多含氮化合物进行了研究，结果表明，茶叶中的咖啡碱 和咖啡中的咖啡因对亚油酸的抗氧化活性可与b h a 、b h t 媲美。如马钱子碱、金雀花碱、 精胺等均能抑制或猝灭单氧原子的作用，使细胞膜中的不饱和脂肪酸得到稳定 2 4 1 。 1 9 9 6 年，姚慧英等对茶叶蛋白抗自由基作用的实验，结果发现，茶叶蛋白比茶多酚 清除自由基的效果要强l o 倍以上。由于茶叶中的蛋白多数不溶于水，以至这一功能未被 发现【2 5 1 。分子中含有一s h 基的蛋白质、多钛、氨基酸等同样可以贡献出h ，作为还原剂 和自由基发生反应，如谷胱甘肽便是有名的自由基清除剂【2 6 1 。 3 植酸 亦称环己六醇六磷酸酯( 肌醇六磷酸) ，大多以钙、镁、钾的复盐形式存在。植酸有 很强的螯合能力。由于金属离子( 如铁离子、铜离子) 与其形成了螫合物，可减少金属离 子所催化的氧化作用。一般螫合剂单独使用效果不佳，但对其它抗氧化剂有协同增效作 用。柠檬酸、多聚磷酸作为抗氧化剂与此类似【2 3 1 。 4 酚酸类化合物 自然界具有抗氧化活性的酚酸类化合物很多。带有羟基的酸性化合物，如咖啡酸、 绿原酸、绿原酸的异构体，均有抗氧化活性。在亚油酸系统中，浓度在1 2 1 0 8m o l l 时，对过氧化基的抑制率高达8 0 以上。咖啡酸与甾醇、三萜烯醇类对猪油、沙丁鱼油 的抗氧化活性近似或超过b h t ，如甾醇、三萜烯醇与阿魏酸酯一起协同，能有效地防止 稻米、麸糖类等的抗氧化作用【2 4 1 。 5 黄酮类化合物 黄酮类化合物广泛存于植物界，是目前倍受关注的天然活性产物之一。早在2 0 世纪 6 0 年代，黄酮体抗油脂过氧化的活性就已经被证实。8 0 年代以来对黄酮类化合物的研 究逐渐转向其对活性氧自由基的清除和对老年病的防治功效a z 2 7 。很多的黄酮类化合物 已被证实有很强的清除氧自由基的能力。迄今认为，其作用机制至少包括三种：通过酚 羟基与自由基进行抽氢反应，生成稳定的半醌自由基，从而中断链式反应以完成抗氧化 作用；通过抗氧化剂的还原作用，直接给出电子而清除自由基；通过抗氧化剂对金属离 子的络合，降低若干需金属离子催化的反应，从而间接实现抗氧化作用 2 8 - 3 0 1 。 河北大学理学硕士学位论文 1 2 2 3不同抗氧化剂协同增效机理的研究 在进行天然植物抗氧化剂的筛选过程中，往往发现某一单体的抗氧化效果不如其溶 剂提取物的复合体，而且也发现在天然植物提取物里添加入b h t 、b h a 或加入v c 、v e 、 植酸等，其抗氧化效果往往大大增强。曾经有人把这种作用称为加合作用或相乘作用。 随着研究的深人，发现这既不是各种抗氧化剂抗氧化作用的简单加合，也不是它们的相 乘关系，而是各种抗氧化剂在抗氧化的不同方面发挥作用，从而从整体上表现为抗氧化 效果大大增强，即协同增效作用。 沈生荣等对儿茶素抗氧化的协同增效效应的研究结果表明，单- - ) l 茶素以( ) e g c g 的清除自由基能力最强，其次是( ) e c g ，两两不同组合对氧自由基的清除率以( ) e g c g + ( ) e c g 效果最佳，比各自单独存在时要增效；三三组合时以( ) e g c g + ( ) e c g + ( ) - e c 组合效果最佳，增效效果明显，且强于两两组合；四种儿茶素组成的不同比例， 以茶叶的天然组成增效效果最明显。用伏安法测得各儿茶素第一还原电位由高到低的顺 序为：( 一) - e g c g ( - ) - e c g ( 一) e g c ( - ) - e c ，这一电位顺序是儿茶素构成抗氧化循环的根 本所在【3 1 1 。对上述结果不难理解：以还原电位接近的组合，增效效果明显，这是因为形 成了抗氧化循环。在多种儿茶素共存的体系中，还与组成比例有关，以天然组成的比例 最佳，这是因为天然的比例本身就是经过长期的自然选择被保留下来的，是适者生存的 体现。 已有研究表明，儿茶素与v c 、v e 共同使用对猪油抗氧化有明显的协同增效作用【3 2 1 。 在研究其它天然植物抗氧化的试验中也发现了类似的现象。联系抗氧化的机理对此不难 理解。抗氧化剂所起的作用并不完全相同：有的抗氧化剂提供质子，捕获自由基，而本 身形成稳定的共振结构而阻断氧化( 如黄酮类化合物) ；有的抗氧化剂是与氧作用而消耗 密闭系统中残留的氧( 如v c 及其盐类) ；有的抗氧化剂可与金属离子形成螯合物，减少金 属离子对氧化作用的催化活性( 如柠檬酸、植酸等) ；有的能破坏单旋态氧( 1 0 2 ) 而抑制光 氧化的进行( 如胡萝卜素) 等等。如将这些具有不同抗氧化性能的物质混合在一起，抗氧 化的整体效果自然要增刮2 3 】。另外，不同抗氧化剂共同使用时，抗氧化剂自由基之间可 能互相还原，使抗氧化剂再生【3 3 j 。 8 第1 章绪论 1 3 地衣抗氧化活性的研究进展 近几年，已研究了以下几种地衣的抗氧化活性，包括：b r y o r i a f u s c e s c e n s ，c e t r a r i a i s l a n d i c a ，d e r m a t o c a r p o ni n t e s t i n i f o r m i s ，p a r m e l i as a x a t i l i s ，p e l t i g e r ar u f e s c e n s ，p l a t i s m a t i a g t a u c a ，r a m a l i n ap o l l i n a r i a ，r p o l y m o r p h ，u m b i l i c a r i an y l a n d e r i a n a ，u s n e ag h a t t e n i s ，和u l o n g i s s i m a ，并发现其中许多种类地衣具有很好的抗氧化活性【3 4 3 7 】。但是，由于地衣生 长缓慢，人工培养存在较大困难，目前对地衣抗氧化活性的研究报道仍比较少；因生存 环境的特殊性，南极地衣抗氧化活性的研究更少。 j a y a p r a k a s h a 等( 2 0 0 0 ) 用1 3 - 胡萝卜素一亚油酸体系研究评估- - j p a m o t r e m as t u p p e u m 的苯、丙酮提取物的抗氧化活性，分离鉴定出其四种有效成分的化学结构分别为：m e t h y l o r s e n i l l a t e ，o r s e n i l l i c a c i d ，a t r a n o r i n 和l e c a n o r i ca c i d 。这是首次报道分析阐述来自地衣 p a m o t r e m as f 甜阳e “，z 的化合物及地衣的抗氧化活性p 研。 b e h e r a 等人( 2 0 0 5 ) 研究发现u s n e ag h a t t e n i s i s 的不同溶剂的提取物均显示良好的抗 氧化活性。其甲醇提取物对油脂过氧化的抑制率明显高于t r o l o x 体系；对超氧阴离子和 自由基的清除能力也较高；并表现出一定的抑菌活性3 9 1 。 1 4 研究内容与方法 本文采用子囊孢子释放法和组织分离培养法对采集自南极长城站所在的菲尔德半 岛的地衣进行共生菌藻的分离培养，并对其标本及其培养物进行初步分类鉴定，以期为 后续相关研究提供共生菌藻的资源基础。 通过亚油酸体系试验、二苯代苦味酰自由基体系试验、还原力试验对采集自南极长 城站所在的菲尔德半岛的部分地衣、簇花石萝所含松萝酸以及2 株共生菌的抗氧化活性 进行测定，并同维生素c 、丁基甲氧基苯酚进行比较。 9 河北大学理学硕士学位论文 第2 章南极菲尔德斯半岛某些地衣共生菌藻的分离培养 2 1 试验材料、试剂与仪器 2 1 1 试验材料 本试验所用地衣由中国科学院微生物研究所地衣真菌系统重点实验室研究生王海 英于2 0 0 6 年1 2 月至2 0 0 7 年1 月期间采自南极乔治王岛菲尔德斯半岛南极长城站周边 西湖，企鹅岛，西海岸小企鹅岛，南海岸等地。上述标本保存于中国科学院微生物研究 所真菌地衣系统学重点实验室菌物标本馆地衣标本室( h m a s l ) 。 2 1 2 主要试剂与培养基 2 1 2 1 试剂 葡萄糖，t w e e n 2 0 ，丙酮，乙酸，硫酸，氯仿，苯酚，乙醇( 9 5 ) ；d n a 提取缓 充液( o 0 1 m o f lt n s h c l ，p h8 0 ；2 c t a b ，w vo 0 2e d t a ；1 4 m o l ln a c i ；2 巯基乙醇，v v ) ，氯仿异戊醇混合液( 2 4 1 ，v v ) ，结合液( 0 0 5 m o l lt f i s h c i ，p h8 0 ； 1 c t a b ，w v ；0 0 1 m o l le d t a ) ，t e 洗脱液，强s 一硼酸一e d t a 缓冲液( p h 8 3 ) ， e b 溶液，加样缓冲液( 5 0 甘油+ 0 2 5 溴酚蓝) ，琼脂糖；硅胶板g f 2 5 4 ( 1 5 0 x1 0 0m m ) 。 2 1 2 2 培养基 1 地衣型真菌常用培养基： ( 1 ) p d a m y 培养基( 马铃薯浸汁麦芽酵母提取物培养基) 【4 0 】：马铃薯2 0 0 9 ，麦 芽提取物2 0 9 ，酵母提取物2 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水补足10 0 0 m l 。 ( 2 ) l b 培养基( l i l l y b a r n e t tm e d i u m ) 【4 0 】：葡萄糖1 0 9 ，天冬酰胺酸2 9 ，k h 2 p 0 4l g ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，f e ( n 0 3 ) 3 9 h 2 0 0 2m g ，z n s 0 4 7 h 2 00 2 m g ，m n s 0 4 4 h 2 00 1 m g ， 维生素b 10 1 m g ，维生素h5 u g ，蒸馏水补足1 0 0 m l 。 2 地衣型藻及蓝细菌常用培养基： b b m 培养基( b o l d ，sb a s a lm e d i u m ) 【4 0 】： a 将下列6 种盐类( n a n 0 31 0 9 ；k 2 h p 0 43 9 ；c a c l 2l g ；k h e p 0 47 9 ；m g s 0 4 7 h ：o 3 9 ；n a c ll g ) 分别配制成6 种各为4 0 0 m l 的溶液备用。将每一种溶液各取1 0 m l 混合， 并用蒸馏水将该盐类混合液加至9 4 0 m l 。 1 0 第2 章南极菲尔德斯半岛某些地衣共生菌藻的分离培养 b 将下列4 种微量元素溶液( a h 3 8 0 31 1 4 2 9 l ；b f e s 0 4 7 h 2 04 9 8 9 l 、 z n s 0 4 7 h 2 08 8 2 9 l 、m n c l 2 。4 h 2 01 4 4 l ；c m 0 0 30 7 1 9 l 、c u s 0 4 5 h 2 01 5 7 9 l 、 c o ( n 0 3 ) 3 6 h 2 00 4 9 9 l ；d e d t a5 0 9 l 、k o h3 1g l ) ，配妥备用。 将上述每一种溶液种各取l m l 加入上述溶液a 种，如果要制备成固体培养基，则 可添加1 5 9 的琼脂。 2 1 3 主要仪器 超净工作台：北京亚泰克隆实验科技开发中心y t - c j i n 电热恒温干燥箱：天津市实验仪器厂 紫外灯；北京智源通生物技术研究所u v 一a 电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司h w s l 2 2 2 试验方法 2 2 1 地衣共生菌藻的分离 2 2 1 1 共生菌的分离 1 子囊孢子释放法【4 1 】： ( 1 ) 清洗对于大型地衣( 叶状和枝状) ：从地衣体顶端切下约l c m 2 ，然后放在自来 水中浸泡5 1 0 分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。 对于小型地衣：如果地衣体较小( 多壳状地衣) ，可将其放入装有1 2m l 的无菌水 和一滴t w e e n 2 0 的小试管中。超声波粉碎约3 分钟。离心去除地衣体表面的附属物。 ( 2 ) 地衣体匀浆液的制备：大型地衣( 枝状或叶状) ：清洗之后，将地衣体放在一个 无菌的载玻片上。在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。在显微镜下，取 下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把 切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌 丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。 较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。 不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含 有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的 细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。 2 组织分离培养法：在体式显微镜下将地衣体上的苔藓等杂质挑去，并将其切成 1 1 河北大学理学硕士学位论文 小碎片，在自来水下冲洗约1 小时，直至其表面被冲洗干净。将冲洗干净后的地衣体碎 片放入无菌离心管中，加入无菌水，置于振荡器上振荡，以此反复荡洗约1 0 2 0 次，目 的是洗去其上的杂菌。将荡洗后的地衣体碎片用无菌的磨口玻棒研磨并加无菌水成悬浮 液。将研磨后的悬浮液置于无菌漏斗滤纸上，用无菌水反复过滤约3 次。将过滤的滤纸 放在体式显微镜下( 超净工作台中) ，挑取无色的菌丝，接种至相应的斜面培养基上。 2 2 1 2 共生藻的分离 1 子囊孢子释放法【4 1 j ： ( 1 ) 清洗对于大型地衣( 叶状和枝状) ：从地衣体顶端切下约l c m 2 ，然后放在自来 水中浸泡5 1 0 分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。 对于小型地衣：如果地衣体较小( 多壳状地衣) ，可将其放入装有1 - 2 m l 的无菌水 和一滴t w e e n 2 0 的小试管中。超声波粉碎约3 分钟。离心去除地衣体表面的附属物。 ( 2 ) 地衣体匀浆液的制备： 大型地衣( 枝状或叶状) ：清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。在解剖 镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的 无菌的玻片上。在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上， 轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻 就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。 较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。 不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含 有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的 细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。 2 组织分离培养法：在体式显微镜下将地衣体上的苔藓等杂质挑去，并将其切成 小碎片，在自来水下冲洗约1 小时，直至其表面被冲洗干净。将冲洗干净后的地衣体碎 片放入无菌离心管中，加入无菌水，置于振荡器上振荡，以此反复荡洗约1 0 2 0 次，目 的是洗去其上的杂菌。将荡洗后的地衣体碎片用无菌的磨口玻棒研磨并加无菌水成悬浮 液。将研磨后的悬浮液置于无菌漏斗滤纸上，用无菌水反复过滤约3 次。将过滤的滤纸 放在体式显微镜下( 超净工作台中) ，挑取无色的菌丝，接种至相应的斜面培养基上。 1 2 第2 章南极菲尔德斯半岛某些地衣共生菌藻的分离培养 2 2 2 地衣共生菌藻的培养 2 2 2 1 共生菌的培养 根据南极菲尔德斯半岛的生态气候特点及温度试验结果，将供试地衣共生菌的培养 温度确定为1 0 ，避光培养。定期观察记录生长情况。 2 2 2 2 共生藻的培养 根据南极菲尔德斯半岛的生态气候特点及温度试验结果，将供试地衣共生菌的培养 温度确定为1 0 ，避光培养。定期观察记录生长情况。 2 2 3 地衣共生菌藻的鉴定 2 2 3 1 形态和解剖学观察 利用体式显微镜m o t i ck 4 0 0 和复式显微镜m o t i cb 2 2 2 3 对地衣体外部形态和内部 解剖特征进行观察并描述，地衣体解剖学研究中的显微观察切片通过以石蜡为支持物的 徒手切片法获得。 2 2 3 - 2 地衣化学物质测定方法 在化学分析测定中，采用地衣物质标准薄层层析法( m n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 【4 2 1 ，进行地衣次生代谢产物的测定。 1 薄层层析的基本溶剂系统： a 系统( t - d a ) ： 甲苯( r o l u e n e ) ：二氧杂环己烷( d i o x a n ) ：乙酸( a c e t i ca c i d ) = 1 8 0 ：6 0 ：8 一 b 系统( h e f ) ： 己烷( h e x a n e ) ：乙醚( d i e t h y l e t h e r ) 甲酸( f o r m i ca c i d ) = 1 3 0 ：1 0 0 ：2 0 c 系统( t - a ) ： 甲苯( t o l u e n e ) ：乙酸( a c e t i ca c i d ) = 2 0 0 ：3 0 补充溶剂系统：专门用于茶渍酸( 1 e c a