（植物学专业论文）拟南芥atsp1基因抗逆生理功能的初步研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 拟南芥彳胛，基因抗逆生理功能的初步研究 摘要 非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素，而其中又以 干旱、盐渍和极端温度的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了 一套主动的防御机制，能够识别逆境信息通过信号传递最终调节植物的生 长发育，从而抵御不良环境的影响。s p l ( s t a b l ep r o t e i ni ) 蛋白最早是从欧 洲的一类山杨树中发现的，研究中通过加热煮沸实验，发现它具有良好的 热稳定性，另外，转此基因的杨树还能提高其抗盐性及其他抗性，但是此 基因与其它基因同源性很低，所以，有可能代表一类新的基因家族。目前 关于该基因功能的研究还很有限，特别是在抗逆生理方面。本实验通过订 购a t s p l ( a t 3 9 1 7 2 1 0 ) 基因的t - d n a 插入突变体s a l k _ 0 2 3 7 0 1 ，并通过p c r 检 测获得突变体纯合子，将其与野生型拟南芥同时放在不同浓度i 勺n a c l 、 a b a 、高温、低温等胁迫条件下培养，发现高温下野生型的生长情况要好 于突变体纯合子，其他条件下突变体与野生型植株的生长情况相差不大， 由此推测该基因可能参与拟南芥高温逆境的生理调节。实验结果如下： 1 采用p c r 和r t - p c r 技术，在d n a 和r n a 水平上鉴定出了与 a t s p l 基因对应的t - d n a 插入纯合拟南芥突变体，并对其表型进行了观 察。 2 半定量r t - p c r 分析发现，a t s p l 基因在拟南芥的叶和根中表达最 高，而在茎、叶柄、花中的表达则较弱。暗示a t s p l 基因在拟南芥的叶和 根的生长发育过程中可能起作用。 3 高温胁迫使a t s p l 基因的表达迅速升高，高温处理3h 后的表达量 达到最高峰，8h 以后才开始下降；不同浓度的盐胁迫和a b a 以及低温处 理对该基因的表达影响不明显。因此，推测该基因可能是高温信号传导通 路中的一个重要调控因子。 4 在高温处理条件下，野生型拟南芥脯氨酸含量、p s i i 活性明显高于 突变体株系。植株s o d 活性增高明显，但野生型拟南芥株系s o d 活性高于 3 5 突变体株系，且差异显著。野生型拟南芥可溶性物质脯氨酸的积累明 显高于突变体植株。m d a 含量在高温处理后呈上升趋势，但野生型拟南 拟南芥a t s p l 基因抗逆生理功能的初步研究 芥m d a 含量较突变体株系低，说明突变体株系膜脂过氧化程度高于野生 型拟南芥，膜伤害程度较重。 5 突变体植株最显著的特征是生长发育迟缓，营养生长阶段延长， 叶片等器官体积减小，植株矮化，抗逆性降低。 关键词：a t s p l 基因：功能分析；非生物胁迫；抗逆生理功能 山东农业大学硕士学位论文 s t u d i e so ns t r e s s - r e s i s t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f a t s p li na r a b i d o p s i st h a l i a n a a b s t r a c t a b i o t i cs t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，h i g hs a l ta n de x t r a m e t e m p e r a t u r e i n f l u e n c e p l a n tg r o w t h ，p r o d u c t i v i t y a n dd e v e l o p m e n t t o c o p ew i t h u n p r e d i c t a b l e e n v i r o n m e n t a l c h a n g e s ，p l a n t se v o l v es i g n a lt r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m sb yw h i c ht h e yr e c e i v es t r e s s s i g n a l sa n dr e g u l a t et h e i r s t r e s s - t o l e r a n c er e a c t i o n s i ti sk n o w nt h a tt h es t a b l ep r o t e i ni ( s p1 ) d e t e c t e di n a s p e np l a n t s r e m a i n ss o l u b l e u p o nb o i l i n ga n dt h a ts p le x p r e s s i o ni n t r a n s g e n i ca s p e ni sr e s i s t a n c et os a l ts t r e s s t h es t u d ya l s or e p o r t e dt h a ts p1i s as t r e s s r e l a t e dp r o t e i nw i t h1 1 0s i g n i f i c a n ts e q u e n c e h o m o l o g yt oo t h e r s t r e s s 。r e l a t e dp r o t e i n sa n dm a yr e p r e s e n tan e wp r o t e i n f a m i l y h o w e v e r ， k n o w l e d g eo f s p l g e n ef u n c t i o n ，e s p e c i a l l yi ns t r e s sr e s p o n s e s i ss t i l l i n c o m p l e t e p r e s e n t l y , w ea n a l y z e dt h ee f f e c to fe x p r e s s i o no fs p1b yo r d e r i n g a t 3 9 17 2 10g e n em u t a n to fa r a b i d o p s i st h a l i a n as a l k 一0 2 37 0 1 ，a n dt h r o u g h d e t e c t i n gt h ee x p r e s s t i o no ft h eg e n ew eh a v eg o th o m o z y g o u s ，t h e na tt h e s a m et i m ew ep l a n th o m o z y g o u sm u t a n ta n dw i l d - t y p ea r a b i d o p s i st h a l i a ? l a u n d e rt h es a l t ，a b a ，h ig ht e m p e r a t u r ea n dl o w t e m p e r a t u r es t r e s s e s ， e t c t r a i n i n gu n d e rt h ec o n d i t i o n s ，w ef o u n dt h a tt h eg r o w t ho ft h ew i l d t y p e a r a b i d o p s i st h a l i a n au n d e rh i g ht e m p e r a t u r ei sb e r e rt h a nt h eh o m o z y g o u s m u t a n t sg r o w t h ，w h i l eu n d e ro t h e rc o n d i t i o n st h eg r o w t ho fm u t a n ta n d w i l d t y p ep l a n t si ss i m i l a r b e c a u s eo ft h i sw es p e c u l a t et h a tt h eg e n em a yb e i n v o l v e di nt h es t r e s sr e g u l a t i o no fa r a b i d o p s i st h a l i a n ag r o w t hu n d e rh i g h t e m p e r a t u r e t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h eh o m o z y g o u st - d n am u t a n t so ft h ea t s p l g e n ei na r a b i d o p s i s t h a l i a n aw e r ei d e n t i f i e da td n aa n dr n al e v e l s ，a n di t s p h e n o t y p i c c h a n g e sw e r eo b s e r v e d 2 t h es e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rw a su s e df o rt h ea n a l y s i so ft h ee x p r e s s i o n i i i 拟南芥a t s p l 基因抗逆生理功能的初步研究 l e v e l so fa t s p jg e n ei nt h ed i f f e r e n tt i s s u e sa n du n d e ra b i o t i cs t r e s s e s t h e e x p r e s s i o np r o f i l i n gs h o w e dt h a ta t s p lg e n ew a sh i g h l ye x p r e s s e di nr o o t s a n dl e a v e s a n d1 e s si ns t e m s ，l e a f s t a l k sa n df l o w e r s 3 t h eh i g ht e m p e r a t u r ei n d u c e daf a s ti n c r e a s ei nm r n a l e v e lo ft h ea t s p i g e n e t h ee x p r e s s i o no f t h ea t s p lg e n ei n c r e a s e st ot h em a x i m u m w i t ht h e h i g ht e m p e r a t u r ef o r3h ，a n ds l o wd o w nf o r8h t h ed i f f e r e n ts a l t a b a c o n c e n t r a t i o na sw e l la sl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n th a dn oe f f e c to nt h e e x p r e s s i o no ft h ea t s p lg e n ei nt h ee x p e r i m e n t s t h e s er e s u l t si n d i c a t i e d t h a tt h ea t s p lg e n ew a sl i k e l yt ob ea ni m p o r t a n tr e g u l a t i o nf a c t o ri nh ig h t e m p e r a t u r es i g n a lp a t h w a y s 4 u n d e rt h eh i g ht e m p e r a t u r et r e a t m e n t ，t h ew i l d t y p ea r a b i d o p s i st h a l i a n a p l a n t sg r e wm u c hs t r o n g e r t h a nm u t a n t sp l a n t s ，a n de x h i b i t e dh i g h e r p r o l i n ec o n t e n t s ，t o t a l s o da c t i v i t i e s ，p s i ia c t i v i t i e sa n dl o w e rm d a c o n t e n t s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ew i l d - t y p ea r a b i d o p s i st h a l i a n ap l a n t s s u f f e r e dl e s si n j u r eu n d e rh i g ht e m p e r a t u r e 5 t h em o s tr e m a r k a b l ec h a r a c t e r i s t i c so f t h em u t a n tw a sg r o w t hr e t a r d a t i o n ， l e n g t h e n e dv e g e t a t i v eg r o w t hs t a g e ，d e c r e a s e d l e a fv o l u m e ，s h o r t e n e d h y p o c o t y l s a sw e l la st o t a ll e n g t ho ft h ew h o l ep l a n t s ，a n dr e d u c e d r e s i s t a n c et oh a m f u le n v i r o m e n t k e yw o r d s ：a t s p lg e n e ，f u n c t i o n a la n a l y s i s ，a b i o t i cs t r e s s e s ， s t r e s s r e s i s t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n i v 英文缩写符号及中英文对照表 英文缩写 英文名称中文名称 a m p b p a m p i c i l l i n b a s ep a i r c a m v 3 5 s3 5 sp r o m o t e ro fc a l i f l o w e rm o s o i cv i r u s c d n a c t a b d d h 2 0 d e p c d n a d n t p d t t e c o l i e b e d t a g u s 口t g k m l b m r n a c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u mb r o m i d e d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o c y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i e t h i o t h r e i t o l e s c h e r i c h i ac o l i e t h i d i u mb r o m i d e 1 3 - g l u c u r o n i d a s e i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n l u r i a b e r t a n im e d i u m m e s s a g er n a m sm u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i a 氨苄青霉素 碱基对 花椰菜花椰病毒3 5 s 启 动子 互补d n a 十六烷基三乙基溴化铵 重蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 p - 葡糖醛酸酶 异丙基- p - d 硫代、卜乳糖苷 卡那霉素 l b 培养基 信使r n a m s 培养基 n a 3 p 0 4 s o d i u mp h o s p h a t e磷酸钠 c i c t a b w t f m f v f m m s p c r p e g p r o i n t e r c e l l u l a rc 0 2c o n c e n t r a t i o n 细胞间隙c 0 2 浓度 c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三乙基溴化铵 w i l dt y p ea r a b i d o p s i s 野生型拟南芥 m a x i m u mf l u o r e s c e n c ei nt h ed a r k 暗适应下的最大荧光 m a x i m u mp h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yo fp s i i a to p e nc e n t e r si nt h ea b s e n c eo fn p q m u r a s h i g ea n ds k l l gm e d i u m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n e p r o l i n e p s i i 最大光化学效率 m s 培养基 聚合酶链式反应 聚乙二醇 脯氨酸 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧化物歧化酶 _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ l _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ - l _ _ - _ _ - _ _ - - - - _ _ - 一- i i i n p t i i n e o m y c i np h o s p h o t r a n d f e r a s ei i新霉素磷酸转移酶i i p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b sp h o s p h a t eb u f f e r磷酸缓冲液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 r i f r i f a m p i c i n利福平 r n a s ea r i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶a r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 r t - p c r r e v e r s et r a n s c r i p t a t i v ep c r s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p a g e p si i t e m e d s t e t s d sp o l y - a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o t o s y s t e mi i n ，n n n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e s o d i u mc h l o r i d e ，t r i s h c l ，e d t ab u f f e r 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 光系统i i n n ，n ，n 四甲基乙二胺 n a c i ，t r i s h c l ，e d t a ， t et r i s h c i ，e d t ab u f f e r ir i s h c l 、e d t a 缓冲液 t r i st t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 x g a l 5 - b r o m o 4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 1 3 - d g a l a c t o s i d e5 一溴一4 氯一3 - 吲哚p d 半乳糖苷 y e p y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u my e p 培养基 u v u l t r a v i o l e ts p e c t r o m e t r y紫外光谱 英文缩写英文名称 中文名称 b pb a s e p a i r 碱基对 i i 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学 位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：丞髂同 导师签礁彩毛 日 期：丝多r 。 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 干旱、盐渍、极端温度和病虫害是影响植物生长发育和造成作物减产 的主要逆境因素，这已成为全球性的问题。世界各国都致力于培育抗逆作 物新品种。全球有三分之的土地面积属于干旱和半干旱地区，干旱对农 作物造成的损失在所有非生物胁迫( b r a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 中占首位。植物病害和 虫害也往往使农业蒙受严重损失，农作物产量的三分之一可归因于病害， 而植物虫害也使全世界每年大约损失数千亿美元。高温逆境有利于物种分 配( l e s t e re ta 1 ，2 0 0 4 ) ，植物为了更好地适应环境，在长期的进化过程中形 成了相应的保护机制，发生了很多诸如形态上、生理上及基因水平上的变 化( s e k ie ta 1 ，2 0 0 2 ；b r a ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。其中有些基因由于功能特殊，对多种 逆境都具有抗性，被称之为广谱抗逆基因。研究这些基因的功能对于植物 的抗逆机制具有广泛的意义( v a nb u s k i r ke ta 1 ，2 0 0 6 ) 。此外，在实际生产中， 植物往往遭遇多种逆境，通过转化某些广谱抗逆基因( r a b b a n ie ta 1 ，2 0 0 3 ) ， 对于提高植物的综合抗逆能力，从而达到作物增产的目的具有重大意义。 近年来，随着现代分子生物学的飞速发展和转基因技术的同趋成熟， 利用基因工程改善作物的抗逆性成为一种快速、有效的方法之一。改善植 物抗逆性的基因操作基本可以分为两大类：类是导入在信号转导和逆激 基因表达过程中起调节作用的蛋白质因子的编码基因；另一类就是向植物 中导入在植物的抗逆性中直接起保护作用的蛋白质编码基因。 s p l ( s t a b l ep r o t e i ni ，热稳定蛋白) 蛋白是最早从欧洲的一类山杨树 ( p o p u l u st r e m u l a ) 中分离获得的逆境蛋白( w a n g e ta 1 ，2 0 0 2 ；x i o n ge ta 1 ， 2 0 0 4 ) ，初步研究发现，s p l 在逆境早期发生阶段在山杨树中起重要的保护 作用，但其对a b a 等激素在早期并没有响应( y a m a g u c h i s h i n o z a k i ，m u n d ye ta 1 ， 1 9 9 0 ) ，通过比对可以发现它在其他物种中的同源性也很高，因此它可能代 表一类新的基因家族( d g a n ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。另夕i s p l 蛋白又同小分子热激蛋 白存在类似的多聚体结构，转铲_ 基因山杨树的n a c l 抗性比野生型强 ( a l t m a n e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。生物化学分析发现，s p l 作为分子伴侣来保护和修复 热胁迫中的酶( w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 因此，本文通过借助模式植物拟南芥及该基因的突变体植株，比较高 温处理下转基因拟南芥和野生型拟南芥的脯氨酸含量( h ee ta 1 ，2 0 0 5 ； 拟南芥a t s p i 基因抗逆生理功能的初步研究 k a v ie ta 1 ，1 9 9 5 ；b a t e se ta 1 ，1 9 7 3 ) 、丙二醛含量( e s t e r b a u e re ta 1 ，19 9 1 ) 、 p si i 活性( m a x w e l le ta 1 ，2 0 0 0 ；n e i le ta 1 ，2 0 0 4 ；l i c h t e n t h a l e re ta 1 ，19 8 7 ) 和 s o d 活。| 生( k u m a r , y a d a ve ta 1 ，2 0 0 9 ) 等指标的差异，探讨了拟南芥 a t s p l 基 因在提高植物抗逆性方面的作用，从而以便为利用基因工程手段在分子水 平上调节植物对逆境胁迫的响应机带1 ( z o r a ne ta 1 ，2 0 0 7 ) ，提供有价值的信 息，并为植物抗逆育种提供理论依据。 1 1 模式植物拟南芥 拟南芥( a r a b i d o p s & t h a l i a n a ) 是一种十字花科( c r u c i f e r a e ) 的d , 型野草， 由于具有一些独特的生物学、遗传学及分子生物学性质，目前己成为植物 分子遗传学研究中最受欢迎的模式植物( m o d e lp l a n t ) 之- - ( m e y e m w i t ze t a 1 ，1 9 8 7 ；m e i n k ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。该植物早在1 6 世纪就已被植物学家发现，但 直到1 9 世纪末，科学家们才注意到了它的研究价值。拟南芥基因组全序列 在2 0 0 0 年底己完全测定并公开发表( f e d e r s p i e le ta 1 ，2 0 0 0 ) ，它是国际上第 一个完成全部基因组序列测定的高等植物，使得拟南芥基因的克隆、结构 与功能分析的研究有了飞速发展的条件( m e i n k e ，c h e r r ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 。其研 究成果对于其它高等植物包括农作物的研究，也将产生重大的影响，因此 拟南芥的研究越来越受到国际植物学界及各国政府的重视。 拟南芥作为一种模式植物，具有其它植物无法替代的优点：( 1 ) 生长 周期短，从萌发到种子成熟仅6 周；( 2 ) 基因组小，仅有5 条染色体。基因 组全序列长度大约1 2 5 m b ( 水稻基因组4 3 0 m b ，玉米基因组4 5 0 0 m b ) ，约 2 5 9 0 0 个基因；( 3 ) 具有双子叶植物的所有特性，整个生命周期同样经过细 胞的分裂、生长发育、分化、衰老、死亡等一系列生物学现象；( 4 ) 有效 的农杆菌介导转化途径，易获得大量的突变体和基因组资源；( 5 ) 植株体 积小，在有限的空间内可大量种植，收获大量的种子。 1 1 1 拟南芥突变体库 随着一些模式生物( 水稻、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫、拟南芥等) 的基因组测序工作的完成，植物基因组研究已经由以全基因组测序为目标 的结构基因组学，转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究。如何 揭示基因组测序工作产生的大量数据所隐藏的生物学意义摆在遗传学家 面前。拟南芥突变体库正是在这个背景下建立的。 2 山东农业大学硕士学位论文 我们知道，突变体对于遗传学研究有着重要作用( l e o n k l o o s t e r z i e l g i le ta 1 ，1 9 9 6 ) 。从突变体入手，是研究基因生理生化功能的最直接的 方法( h o w d e na n dc o b b e t t1 9 9 2 ：z h a o ，b a r k l ae ta 1 ，2 0 0 8 ) 。植物在 自然生长条件下也可以产生突变性状，早期的普通正向遗传学研究经常通 过寻找与某种生物学特性相关的自然突变体来研究某个特定的基因 ( p a r k sa n do u a i 1 1 9 9 3 ) 。但是自然突变体的数量是非常有限的，而且在 自然条件下并非所有的基因都能够产生可生存的突变体。已获得的拟南芥 突变体大体上可分为三类：由于控制植物形态发育的基因发生突变形成的 形态发生变异株( b o l l e ，c2 0 0 9 ) ；由于基因组中编码某种酶的基因发生 了变异，而导致植物体内缺少某种特定的酶活力的生化变异株；参与植物 激素合成的基因，或参与植物激素或调节信号传导的基因发生变异后。导 致的植物激素和调节物质变异株。 为了满足拟南芥基因功能研究的需要，科学家们先后探索了人工诱 变、转座子插入、t d n a 插入等方法来获得高覆盖率的突变体库 ( b e c h t o l d ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。为配合植物功能基因组高通量研究的策略，目前 已经构建了大量的不同类型的拟南芥等物种的大型突变体库，如t d n a 突变体库、转座子突变体库等。现在这些突变体都能够从t a i r 等地方买 到，为全面鉴定和研究拟南芥基因的功能创造了非常方便的条件。 1 1 2 拟南芥基因组研究 完成拟南芥的基因图谱仅仅是基因组计划的第一步，拟南芥属还有 3 0 基因的功能是未知的。基因组研究主要包括三个层次：一、结构基因 组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的 遗传图谱和以d n a 的核苷酸序列为基础的物理图谱( l i m ，g t ，g p w a n g ，e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。二、功能基因组学，即“后基因组计划”，是结构基因 组研究的延伸，利用结构基因组提供的遗传信息，利用表达序列标签，建 立以转录图谱为基础的功能图谱( 基因组表达图谱) ，系统研究基因的功 能。三、蛋白质组学，是功能基因组学的深入。植物功能基因组学是f i t 植物科学最前沿的领域之一，美国自1 9 9 0 年启动“植物基因组学”计划， 2 0 0 0 年底公布了模式植物拟南芥的全部序列。2 0 0 1 年开始，美国全面启 动“2 0 1 0 年计划”，目标是到2 0 1 0 年确定拟南芥中所有基因的功能。我国 3 拟南芥a t s p i 基因抗逆生理功能的初步研究 国家自然科学基金委员会已于2 0 0 1 年快速启动“拟南芥全部转录调控因 子蛋白组学研究”重大国际合作研究项目，2 0 0 4 年3 月，研究取得了重要 进展：共克隆了4 4 个拟南芥转录调控因子家族中的1 2 8 2 个基因，获得了 拟南芥所有己知和预测的1 8 6 4 个转录因子的序列，利用e d n a 微阵列芯 片，检测了拟南芥幼苗的转录因子在光调控下的表达，所有表达的基因占 整个转录因子的8 4 ，并通过蛋白质表达实验验证，己克隆的拟南芥转录 调控因子融合基因中8 5 以上有一定量的蛋白质表达。有关拟南芥功能基 因组的研究进展如此迅速，与突变体的研究密不可分。拟南芥植株小，自 花授粉，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，极易获得各种代谢 功能的缺陷型。例如，用含除草剂的培养基来筛选，一般获得抗除草剂的 突变率是1 1 0 0 0 0 0 ，是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中 的果蝇”。突变体涉及到发育的各个时期、不同部位。诱导突变体产生的 方法主要有三种：一是使用化学诱变剂e m s 进行化学诱变( k i m ，ye ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。二是x 射线物理诱变。三是利用农杆菌介导的t d n a 转化获得 突变体，这也是目前使用最为广泛、也最为直接的一种方法( w e i g e l ，d ， j h a h n ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 总之，由于拟南芥具有以上特性，作为遗传研究材料非常经济方便。 目前利用各种实验方法己从拟南芥中分离和鉴定了一大批功能基因，涉及 到植物的生长发育，性别决定，生理代谢，激素调节以及对外界环境的胁 迫应答响应等各个方面( i z h a k ie ta 1 ，2 0 0 1 ；a d e e t a 1 ，2 0 0 1 ；p i a oe ta 1 ， 2 0 0 1 ；k o o r n n e e f e ta 1 ，1 9 9 8 ；w e na n dc h a n g2 0 0 2 ；p o z oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。另外选 用拟南芥作为模式植物进行研究的另一个重要目的：就是从中克隆到那些 与农艺性状相关的重要基因，然后再应用到其它经济作物中去，从而提高 作物的产量，增强抗逆性，改善品质等。由于拟南芥具有以上优点，本论 文选用拟南芥作为研究材料。 1 2t - d n a 介导的基因诱捕技术及其在研究植物基因功能中的 应用 人们一直利用物理或化学诱变剂诱使植物大量变异，获得植株突变体 ( r e d e i ，g p1 9 8 2 ) 。植物学家也利用这些突变体鉴定与克隆目的基因。插 4 山东农业大学硕士学位论文 入诱变剂包括转移d n a ( t d n a ) 和转座成分( 转座子) ，是植物分子生物学 家克隆基因最普遍使用的诱变剂，这些诱变剂既能使基因失活，又可重获 植物基因组。它不但能验证突变的目的基因对植物生物化学与发育过程的 重要性，而且克隆相关基因的方法也较为简便，不需了解目的基因产物或 在基因组中的位置。尤其是t d n a 插入法，该方法作为上世纪8 0 年代中后 期建立起来的一种新的快速分离基因的遗传学技术，因其t d n a 既可以作 为诱变剂，同时又可以作为分离基因的标签( a h ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，因此该技术 又被称为基因标签法( g e i l e t a g g i n g ) 或基因诱捕( g e n e - t r a p p i n g ) 法。通过标签 法目前已成功地分离到一些与植物生长发育密切相关的基因，比如控制植 物表皮毛发育的基因，定位于拟南芥第三条染色体_ l ( h e r m a na n d m a r k s ，1 9 8 9 ；f e l d m a n n ，1 9 9 1 ) ，其突变体是通过种子转化将t - d n a 插入引 起g ll 变异，表型为植株茎杆及叶片上光滑无毛。a g ( a g a m o u s ) 是拟南 芥中参与花分生组织转变过程的一个m a d sd o m a i n 基因，与花器官发育有 关( y a n o f s k y e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。当a g 发生变异后，原来花器官中发育成雄蕊的 细胞同源分化发育成花瓣，而雌蕊发育成花托。a g 与其他该家族基因突 变体相比较，进一步阐明了调节花发育的过程，如受光周期调控，参与成 花诱导的不同信号途径，以及基因之间的相互作用( j a c ke ta l ，1 9 9 2 ：p n u e l i e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。另外，c h 一4 2 ( c h l o r a t a ) 是一个参与控制叶绿体发育的核基因， 其突变体是通过组织培养转化得到的( k o n c ze ta 1 ，1 9 9 0 ) 。t d n a 介导的 基因诱捕技术是以t d n a 作为转化载体，对其进行适当修改后整合报告基 因，通过报告基因的表达来研究目的基因表达并进而分离、鉴定基因的一 门遗传学技术( a l o n s oe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。其基本原理是将含有己矢h d n a 序列的 t d n a 载体通过转化插入到受体基因组 ( c h u n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) ，使插入位点 基因的功能缺失或获得从而造成突变，并在被诱捕序列启动子的控制下表 达插入的报告基因，以鉴定可见或非可见的突变。t d n a 不仅可作为诱变 剂产生大量突变体，而且转化载体中的报告基因还可作为克隆整合位点内 源基因的标签，分离和鉴定突变体相关基因( a na n dl e e ，2 0 0 5 ) 。到目前为 止，通过基因诱捕己经发现了很多新基因( g a r l a n df me ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在拟 南芥已经克隆的6 2 0 多个有表型的突变体基因中，有4 0 是通过t d n a 介 导的基因诱捕技术分离的( m e i n k ea n ds c h o l l ，2 0 0 3 ) 。t d n a 介导的基因诱 拟南芥a t s p i 基因抗逆生理功能的初步研究 捕技术( h i g u c h i ，o z a k ie ta 1 ，2 0 0 9 ) 在研究植物基因功能中的应用主要有以下 方面。 1 2 1 分离组织特异性表达的基因 基因诱捕系统多用于分离和鉴定可差异调控的特异表达基因( r y u ， y o ue ta 1 ，2 0 0 4 ；c h i n ，c h o ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。具有细胞和组织特异性表达、暂 时性表达或有条件表达的基因，可通过报告基因的表达得以分离( q u i e t s c h e ta 1 2 0 0 0 ) 。利用根癌农杆菌介导的遗传转化，将启动子诱捕元件插入到 棉花基因组中，获得了1 4 1 个独立转化子，发现g u s 报告基因在不同株系 的植株间表达模式呈现较大差异，在有些植株中g u s 呈组织特异性表达， 有些是器官特异性表达，有些则在多个器官中均有表达( j i n ，2 0 0 5 ) 。这种 组织特异性表达模式可被作为用于鉴定特殊细胞和组织的分子标签 ( w a l d e ne ta 1 ，2 0 0 2 ；k o o ，k i me ta 1 ，2 0 0 7 ) 。此标签在分析植物发育的研究中 是一个非常有用的工具( n a g a w a ，s a w a e ta 1 ，2 0 0 6 ) ，它可用来检测发育时的正 常模式和鉴定突变表型。目前已建立了3 种t d n a 基因诱捕类型：启动子 诱捕、增强子诱捕和基因诱捕，关于它们的基本原理及其结构已经有很多 报道( t a n ge ta 1 ，2 0 01 ；l ia n dz h a n g ，2 0 0 6 ) 。 f a r r a r 等( 2 0 0 3 ) 通过研究拟南芥启动子诱捕系爿舢d ，发现，g u s 报 告基因在胚胎和幼苗活跃的细胞分裂区，尤其在顶端分生组织和幼叶中表 现出较高的活性，由此捕获的基因称之为e x o r d i u m ( e x o ) 。e x o 基因在 结构上与烟草的p 础堪因相关，分析结果表明它是控制细胞分裂和维持 分生组织负调节系统的一个组分。此外，为了鉴定低温条件下水稻中表 达的基因，k i m 等( 2 0 0 4 ) 筛选了在5 。c 冷胁迫条件下生长的1 5 5 8 6 个基因 诱捕系，发现8 1 个系表现出了冷响应g u s 活性。选取其中的6 2 个系作进 一步分析，发现5 3 个系表现出g u s 活性增强，而9 个系则活性减弱：1 6 个 系受a b a 的影响，表明这是a b a 依赖性的冷响应。此外，他们用t a i l p c r 法获得了这些诱捕系中的3 7 个基因，并对其中的2 个诱捕基因从分子水平 上进行了研究。其中一个是编码富含重复亮氨酸类似受体的蛋白激酶基因 o s r l k i 。此基因的表达受低温和盐胁迫的诱导；另一个是o s d m k t l 基因， 它编码的觥职受低温胁迫诱导而不受高盐胁迫或干旱诱导。这些研究 结果表明，t d n a 介导的基因诱捕技术对分离和鉴定水稻胁迫响应基因是 6 山东农业大学硕士学位论文 非常有效的。 1 2 2 分离功能冗余基因和多效性基因 基因敲除是一种有效地确定基因功能的方法，然而某些特定基因，由 于其特性，在基因敲除后并不表现出功能的丧失，例如那些编码产物在植 物生命周期中执行重要功能的基因( 它被破坏将产生致死效应) ；或者某些 在功能上冗余的基因，与其它在序列水平相关或不相关的基因分担着重叠 的功能；也可能某些基因是在多个发育阶段产生作用，这些基因的突变可 以导致早期致死或者是高度的多效性表型，这种多效性表型会掩盖一个基 因在特定途径中扮演的角色( s p r i n g e r ，2 0 0 0 ) 。基因诱捕系统的应用可以克 服这些困难，同时也能找出参与代谢或